一种竹荪蛋多糖、提取方法及其在抗胰腺癌中的应用

1.本发明涉及天然药物提取技术领域，具体涉及一种竹荪蛋多糖、提取方法及其在抗胰腺癌中的应用。


背景技术：

2.胰腺癌是常见的消化系统恶性肿瘤，全球常见的恶性肿瘤中胰腺癌位于第12位，也是癌症死亡的第7大原因，5年生存率仅为10％。美国癌症协会最新的数据显示，2021年约有60430例胰腺癌新增患者，其中死亡患者数约为48220例，预计在未来20～30年内将成为美国癌症死亡的第二大原因。因其缺乏典型的临床症状和解剖位置，癌胚抗原cea、血清ca19-9缺乏特异性，早期诊断率较低，导致患者错过手术治疗时期。晚期胰腺癌主要以放化疗为主，然而，目前临床使用的放化疗药物大多存在副作用大、药效低等现象。因此，需要寻找高效且低毒的化疗药物。
3.现代研究表明多糖为一类由醛糖或酮糖通过糖苷键连接而成的天然高分子多聚物，是一种安全、低毒的天然物质，因具有较强的抗肿瘤生物活性，对多种肿瘤细胞均有较好的抑制作用，且对正常细胞几乎没有毒副作用，因此成为了一种潜在的新型抗肿瘤药物资源。
4.竹荪(dictyophora indusiata)，又名竹参、竹菌，隶属真菌界，真菌门，担子菌亚门，腹菌纲，鬼笔目，鬼笔科竹荪属，是一类名贵的大型食用真菌，素有“真菌皇后”、“山珍之王”等美称。竹荪的生长阶段包括：孢子
→
菌丝体
→
竹荪蛋
→
竹荪子实体。竹荪子实体包括菌盖、菌柄、菌裙及菌托四大部分。竹荪蛋(embryo of dictyophora indusiata)为竹荪胚体，由梦荪、孢子、菌盖、外包被四部分构成。梦荪又叫竹荪菇，是未出完的竹荪胚，呈乳白色，蘑菇状，入口清香嫩脆；外包被和菌盖呈乳白色半透明网状，又叫竹荪花，入口松脆味鲜。中国竹荪资源丰富，主要分布于贵州、云南、四川、福建等地。竹荪蛋同时也是贵州、四川等地产特色药食两用的真菌，有着很高的营养价值和具有补气养阴、润肺止咳、清热利湿的药用功效。研究表明，多糖是竹荪蛋有效活性成分之一,具有提高免疫力、抑菌、抗炎、维持人体正常生理等作用。
5.目前，对竹荪与竹荪蛋的研究主要集中在栽培与加工、营养成分与药效、化学成分的分析与分离等。而大量的研究也主要集中在竹荪子实体中，有关竹荪蛋中的活性成分的研究报道较少，同时也未见将竹荪蛋多糖应用于抗胰腺癌的报道。


技术实现要素：

6.本发明针对现有技术的不足，从竹荪蛋中提取出一种能抗胰腺癌的多糖。
7.本发明的目的之一是提供一种竹荪蛋多糖，由甘露糖、葡萄糖、半乳糖和岩藻糖组成，其摩尔比为15.32：35.41：46.89：2.38，分子量为17.0kda。
8.本发明的目的之二是提供竹荪蛋多糖在制备抗胰腺癌药物中的应用。
9.本发明的目的之三是提供一种竹荪蛋多糖的提取方法，包括以下步骤：
10.s1、称取干燥的竹荪蛋，加入5～30倍蒸馏水浸泡过夜；
11.s2、取浸泡后的竹荪蛋水煮提取2～5次，每次2～5h；
12.s3、合并多次水煮液后浓缩，用乙醇醇沉，冻干得到竹荪蛋总多糖(edip)；
13.s4、将竹荪蛋总多糖(edip)经deae-琼脂糖凝胶分离，收集各级份溶液，减压浓缩，透析，再进行冷冻干燥得到各级份竹荪蛋多糖，其中经水洗脱级份为中性糖(edip-n)，不同离子强度的nacl洗脱级份为酸性多糖，命名为edip-a1
……
edip-an。
14.进一步，步骤s2竹荪蛋加水煮沸后过滤得水煮液，滤渣加水继续煮沸，煮沸3次。
15.进一步，步骤s3采用质量分数为80％的乙醇醇沉。
16.进一步，步骤s4洗脱流动相为蒸馏水和不同离子强度的nacl，nacl的离子强度分别为0.05m、0.14m、0.19m、0.27m、0.51m。
17.抗癌活性实验表明，本发明得到的竹荪蛋中性糖edip-n为电荷及分子量均一的多糖，其对比于经传统水提醇沉法提取所得的竹荪蛋总多糖，可以显著降低sw1990及aspc-1胰腺癌细胞系的活性，且呈浓度依赖性，其中半抑制浓度ic
50
分别为273.3μg/ml和478.4μg/ml，而传统水提醇沉法提取所得的竹荪蛋总多糖对sw1990及aspc-1胰腺癌细胞系的活性影响的半抑制浓度ic
50
仅为1210μg/ml和1375μg/ml；并且本发明提取的竹荪蛋中性糖edip-n对其他癌细胞如hepg2人肝癌细胞、ht-29人结肠癌细胞系及a549人非小细胞肺癌细胞系毒性较小，且对l02正常人肝细胞系几乎无毒性，说明本发明的竹荪蛋多糖对抗胰腺癌具有较好的专一性，且高效低毒，安全性较好。
附图说明
18.图1为竹荪蛋总多糖(edip)经deae-琼脂糖凝胶柱层析洗脱曲线图；
19.图2为竹荪蛋中性糖edip-n单糖组成示意图，(a)混标、(b)edip-n；
20.图3为edip-n分子量测定结果示意图；
21.图4为各级分竹荪蛋多糖对sw1990人胰腺癌细胞系活力影响示意图；
22.图5为各级分竹荪蛋多糖对aspc-1人胰腺癌细胞系活力影响示意图；
23.图6为edip-n对hepg2人肝癌细胞系、ht-29人结肠癌细胞系、a549人非小细胞肺癌细胞系、l02正常人肝细胞系活力影响示意图。
具体实施方式
24.下面通过具体实施方式进一步详细说明：
25.1、一种竹荪蛋多糖的提取方法：
26.实施例1
27.称取干燥竹荪蛋500g于煎药机中，加12l蒸馏水浸泡过夜，水煮2h，过滤，收集滤液，重复此操作三次，合并三次煮提液。将三次收集滤液浓缩至3l，4000rpm离心20min，收集上清液。上清液80％乙醇醇沉过夜，4000rpm离心20min，收集沉淀。沉淀加入适量蒸馏水溶解，加热挥尽乙醇后，放入-20℃冰箱冻存过夜，再转入-80℃冰箱冻存24h，再进行冷冻干燥，干燥后，合并称重，得到竹荪蛋总多糖(edip)52.38g，收率为10.48％。
28.deae-琼脂糖凝胶柱色谱分离竹荪蛋多糖：
29.称取edip样品1g溶解于20ml蒸馏水中，配制成50mg/ml的多糖溶液过deae-琼脂糖
凝胶层析柱(60.6mm
×
187mm)，依次用3倍体积的水和不同离子强度的nacl(0.05m、0.14m、0.19m、0.27m、0.51m)进行分步等度洗脱至苯酚硫酸法检测显示无糖为止。合并相同组分，减压浓缩后透析(分子截留量500da)，再进行冷冻干燥。如图1所示竹荪蛋总多糖经deae-琼脂糖凝胶柱层析洗脱曲线中，可依次得到水洗组分edip-n，0.05m nacl洗脱组分edip-0.05m，0.14m nacl洗脱组分edip-a1，0.19m nacl洗脱组分edip-a2，0.27m nacl洗脱组分edip-a3，0.51m nacl洗脱组分edip-a4。多糖收率分别为23.15％、7.78％、7.28％、1.95％、3.92％、24.72％。
30.实施例2
31.称取干燥竹荪蛋500g于煎药机中，加13l蒸馏水浸泡过夜，水煮2h，过滤，收集滤液，重复此操作三次，合并三次煮提液。将三次收集滤液浓缩至3l，4000rpm离心20min，收集上清液。上清液80％乙醇醇沉过夜，4000rpm离心20min，收集沉淀。沉淀加入适量蒸馏水溶解，加热挥尽乙醇后，放入-20℃冰箱冻存过夜，再转入-80℃冰箱冻存24h，再进行冷冻干燥，干燥后，合并称重，得到竹荪蛋总多糖(edip)51.67g，收率为10.33％。
32.deae-琼脂糖凝胶柱色谱分离竹荪蛋多糖：
33.称取edip 1g溶解于30ml蒸馏水中，配制成33.33mg/ml的多糖溶液过deae-琼脂糖凝胶层析柱(60.6mm
×
187mm)，依次用3倍体积的水和不同离子强度的nacl(0.05m、0.14m、0.19m、0.27m、0.51m)进行分步等度洗脱至苯酚硫酸法检测显示无糖为止。合并相同组分，减压浓缩后透析(分子截留量500da)，再进行冷冻干燥。edip-n、edip-0.05m、edip-a1、edip-a2、edip-a3、edip-a4收率分别为22.27％、8.18％、7.51％、2.05％、3.22％、25.12％。
34.实施例3
35.称取干燥竹荪蛋500g于煎药机中，加14l蒸馏水浸泡过夜，水煮3h，过滤，收集滤液，重复此操作三次，合并三次煮提液。将三次收集滤液浓缩至3.5l，4000rpm离心20min，收集上清液。上清液80％乙醇醇沉过夜，4000rpm离心20min，收集沉淀。沉淀加入适量蒸馏水溶解，加热挥尽乙醇后，放入-20℃冰箱冻存过夜，再转入-80℃冰箱冻存24h，再进行冷冻干燥，干燥后，合并称重，得到竹荪蛋总多糖(edip)52.31g，收率为10.46％。
36.deae-琼脂糖凝胶柱色谱分离竹荪蛋多糖：
37.称取edip 1.2g溶解于30ml蒸馏水中，配制成40mg/ml的多糖溶液过deae-琼脂糖凝胶层析柱(60.6mm
×
187mm)，依次用3倍体积的水和不同离子强度的nacl(0.05m、0.14m、0.19m、0.27m、0.51m)进行分步等度洗脱至苯酚硫酸法检测显示无糖为止。合并相同组分，减压浓缩后透析(分子截留量500da)，再进行冷冻干燥。再进行冷冻干燥。edip-n、edip-0.05m、edip-a1、edip-a2、edip-a3、edip-a4收率分别为21.87％、8.36％、7.72％、2.12％、3.31％、25.43％。
38.2、竹荪蛋中性糖(edip-n)的单糖组成分析：
39.hplc条件：流动相组成为乙腈：磷酸缓冲盐＝18.3％:81.7％。检测器型号：varian prostar325，检测波长：254nm。色谱柱型号：supersil ods2 5μm(250mm
×
4.6mm)；柱温：35℃；进样量：20μl；流速：1ml/min。
40.样品前处理：
41.(1)完全酸水解：称取10mg样品，加2m的三氟乙酸(tfa)3ml，于安瓿瓶中，用酒精喷灯封口，110℃的条件下加热水解3h。取出室温冷却后，加入等体积2m naoh至中性。
42.(2)pmp(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)衍生化：取100μl(1)中的完全酸水解溶液，加入浓度为0.6m的naoh溶液100μl混匀，再加入200μl现配置的浓度为0.5m的pmp甲醇溶液，密封后涡漩混匀。水浴温度为70℃条件下反应100min后，冷却至室温，用浓度为0.3m的hcl 200μl进行中和，加蒸馏水补足至1ml。再加入1ml三氯甲烷萃取，取出上层水相，多次重复萃取，尽量除尽pmp。涡旋后取20μl上清液进样分析。
43.(3)取100μl 1mg/ml单糖标准品(man，rha，gal，gala，glc，glca，xyl，ara，fuc)混合液，按样品pmp衍生同法处理，然后进样分析。
44.结果如图2所示，竹荪蛋中性糖edip-n由甘露糖：葡萄糖：半乳糖：岩藻糖组成，摩尔比为：15.32：35.41：46.89：2.38。
45.3、竹荪蛋中性多糖(edip-n)分子量测定
46.采用高效凝胶渗透色谱法(hpgpc)法测定竹荪蛋多糖edip-n的分子量。色谱柱：tsk-gel g-3000pw xl；色谱条件：rid-101示差检测器，在线脱气装置；流动相为0.2mnacl；流速：0.5ml/min；样品检测：将多糖样品溶于0.2m nacl中，配制成15mg/ml的溶液，10000rpm离心10min，经0.22μm微孔滤膜过滤后，取上清液进行hpgpc分析。取已知分子量的葡萄聚糖系列标准品(t5、t10、t20、t40、t70、t100、t200、t2000和glc)，配制浓度为15mg/ml的标准品溶液，10000rpm离心10min后，取上清液，经0.22μm微孔滤膜过滤后，进行hpgpc分析，绘制标准曲线，并计算竹荪蛋多糖的分子量。结果如图3所示edip-n于14.054min出峰，其分子量为17.0kda，而19.396min所出的峰为盐峰。
47.4、竹荪蛋中性多糖(edip-n)抗癌活性实验
48.实施例1制备的edip-n抗sw1990胰腺癌活性实验
49.sw1990细胞培养传代3代后，将处于对数生长期的细胞用胰蛋白酶消化，计数，以每孔3
×
103个细胞的密度接种于96孔板内(边缘孔用无菌pbs填充)，于5％ co2，37℃培养箱中孵育约16h至细胞贴壁后，分别加入终浓度为62.5、125、250、500、1000μg/ml的各级分竹荪蛋多糖进行处理，每孔100μl，设5个复孔，继续孵育48h。避光条件下，每孔加入20μl mtt溶液(5mg/ml，即10％mtt)，继续培养4h。弃去上清，每孔加入150μl二甲基亚砜(dmso)，置摇床上低速振荡20min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪od 490nm处测量各孔的吸光值。结果如图4所示，edip-n对sw1990人胰腺癌细胞系具有显著的抑制活性，且呈浓度梯度依赖性，半抑制浓度ic
50
为273.3μg/ml，而传统水提醇沉法提取所得的竹荪蛋总多糖(edip)对sw1990胰腺癌细胞系的活性影响的半抑制浓度ic
50
仅为1210μg/ml，而其他级分多糖未表现出明显的抑制活性，说明所提取分离得到的edip-n对sw1990人胰腺癌细胞系具有较好的专一性。
50.实施例1制备的edip-n抗aspc-1胰腺癌活性实验
51.aspc-1细胞培养传代3代后，将处于对数生长期的细胞用胰蛋白酶消化，计数，以每孔3
×
103个细胞的密度接种于96孔板内(边缘孔用无菌pbs填充)，于5％ co2，37℃培养箱中孵育约16h至细胞贴壁后，分别加入终浓度为62.5、125、250、500、1000μg/ml的各级分竹荪蛋多糖进行处理，每孔100μl，设5个复孔，继续孵育48h。避光条件下，每孔加入20μl mtt溶液(5mg/ml，即10％mtt)，继续培养4h。弃去上清，每孔加入150μl二甲基亚砜(dmso)，置摇床上低速振荡20min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪od 490nm处测量各孔的吸光值。结果图5所示，edip-n对aspc-1人胰腺癌细胞有显著的抑制活性，且呈浓度梯度依赖性，
半抑制浓度ic
50
分别为478.4μg/ml，而传统水提醇沉法提取所得的竹荪蛋总多糖(edip)对aspc-1胰腺癌细胞系的活性影响的半抑制浓度ic
50
仅为1375μg/ml，且其他级分多糖未表现出明显的抑制活性，说明edip-n对aspc-1人胰腺癌细胞具有较好的专一性。
52.实施例1制备的edip-n对癌细胞与正常肝细胞活性实验
53.hepg2、ht-29、a549及l02细胞分别培养传代3代后将处于对数生长期的细胞用胰蛋白酶消化，计数，以每孔3
×
103个细胞的密度接种于96孔板内(边缘孔用无菌pbs填充)，于2.5％ co2，37℃培养箱中孵育约16h至细胞贴壁后，分别加入终浓度为62.5、125、250、500、1000μg/ml的edip-n进行处理，每孔100μl，设5个复孔，继续孵育48h。避光条件下，每孔加入20μl mtt溶液(5mg/ml，即10％mtt)，继续培养4h，弃去上清，每孔加入150μl二甲基亚砜(dmso)，置摇床上低速振荡20min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪od 490nm处测量各孔的吸光值。结果如图6所示，edip-n对其他肿瘤细胞系如hepg2人肝癌细胞、ht-29人结肠癌细胞系及a549人非小细胞肺癌细胞系虽有一定的抑制作用，但毒性最用较小，而edip-n对l02正常人肝细胞细胞系未有明显的抑制活性。综上所述说明本发明得到的竹荪蛋多糖对抗胰腺癌具有较好的专一性，且高效低毒，安全性较好。
54.以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本技术要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

技术特征：
1.一种竹荪蛋多糖，其特征在于，由甘露糖、葡萄糖、半乳糖和岩藻糖组成，其摩尔比为15.32：35.41：46.89：2.38，分子量为17.0kda。2.根据权利要求1所述的竹荪蛋多糖在制备抗胰腺癌药物中的应用。3.根据权利要求1所述竹荪蛋多糖的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：s1、称取干燥的竹荪蛋，加入5～30倍蒸馏水浸泡过夜；s2、取浸泡后的竹荪蛋水煮提取2～5次，每次2～5h；s3、合并多次水煮液后浓缩，用乙醇醇沉，冻干得到竹荪蛋总多糖；s4、将竹荪蛋总多糖经deae-琼脂糖凝胶分离，收集各级份溶液，减压浓缩，透析，再进行冷冻干燥得到各级份竹荪蛋多糖，其中经水洗脱级份为中性糖edip-n。4.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于：步骤s2竹荪蛋加水煮沸后过滤得水煮液，滤渣加水继续煮沸，煮沸3次。5.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于：步骤s3采用质量分数为80％的乙醇醇沉。6.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于：步骤s4洗脱流动相为蒸馏水和不同离子强度的nacl，nacl的离子强度分别为0.05m、0.14m、0.19m、0.27m、0.51m。

技术总结
本申请公开了天然药物提取技术领域中的一种竹荪蛋多糖，由甘露糖、葡萄糖、半乳糖和岩藻糖组成，其摩尔比为15.32：35.41：46.89：2.38，分子量为17.0KDa。抗癌活性实验表明，本申请的竹荪蛋中性多糖可以显著降低SW1990及AsPC-1胰腺癌细胞系的活性，对抗胰腺癌具有较好的专一性，且高效低毒，安全性较好。安全性较好。安全性较好。


技术研发人员：孙成新 覃海盼 任明旺 杨建文 张涛 余家奇 肖世基 董敏健 丁侃
受保护的技术使用者：遵义医科大学
技术研发日：2023.05.18
技术公布日：2023/8/2