适用于混合血斑的DNA分层提取方法及其应用与流程

适用于混合血斑的dna分层提取方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及一种混合血斑处理方法，具体涉及一种适用于混合血斑的dna分层提取方法及其应用。属于法医遗传学应用技术领域。


背景技术：

2.法庭科学检案中，混合检材多由受害人与施暴者的个体成分混合而成。混合斑占了大概总检材量的近十分之一，识别其中不同成分来源才能为法庭科学提供可靠的证据。
3.性侵案中，男性精子/女性阴道液是最多见的混合斑。gill等年提出差异裂解法(different extraction),也称两步消化法(two-step lysis)。由于精子细胞膜表面有大量的硫醇蛋白(cross-linkedthiol-richproteins)，其中含有大量的二硫键，这让精子细胞相比于上皮细胞更难裂解，利用精子的这种特性，在处理精液与其他成分混合的样本时，先以常规的dna提取方法除去精子以外的细胞成分，通过离心留下精子细胞从而获得其dna。随着差异提取法在全球性推广应用，并伴随着其他精子分离方法的开发应用，大量的性侵案得以告破。
4.检案中，混合血斑的出现频率仅次于男女混合斑，常常被发现在现场衣物、床单等棉织物上。然而由于混合血斑细胞类型相同，细胞核结构上无差异，所以无法通过目前的差异提取法(二步提取法)分离混合成分。对于混合血斑，一般是采用常规的dna提取方法得到混合dna，之后对混合图谱基因型进行判定。实际检案中，法医物证混合斑的检测多采用常染色体短串联重复序列(short tandem repeats，strs)遗传标记。当采用常染色体遗传标记检测一名个体时，一个基因座最多可出现2条信号峰，而如果是二名个体混合斑，则可分别出现1条，2条，3条或4条信号峰。为了推导混合成分可能的基因型组合(genotype combinations)，首先必须对其中混合比(mixed gradient)进行评估。混合斑一般由主要成分(major component)和次要成分(minor component)组成。当主要成分/次要成分接近及大于3/1时，混合成分的基因型将相对容易识别，此时，法医学常定义该类混合斑为可识别混合斑(resolvedmixed stains)。当混合成分比接近时(1/1至2/1)时,同一基因座各信号峰强度将趋于相似，此时形成不可识别混合斑(unresolvedmixed stains)，即可能基因型组合较多，无法明确具体基因型组合(如表1)。不可识别混合斑基因型判定的准确性(locus separation accuracy)下降，个体识别能力低下。所以对混合血斑，应用现有技术不能分离得到单一成分dna，同时在混合比相近的情况下，难以推导到明确、特定的基因型。
5.表1.混合比相似混合斑出现4条、3条及2条信号峰时可能的基因型
[0006][0007]
备注：三条峰时，假定a是相对高峰(即二个等位基因重叠)；二条峰时，假定a是相对高峰(即三个等位基因重叠)。混合比相似的混合血斑可出现多种基因型组合，难以判断特定的基因型组合。
[0008]
长期以来，混合检材的成分分离一直被认为是法医案件中的主要挑战。在过去的几十年中，相关研究及方法不断出新，以识别混合斑中的个体来源，尤其是混合成分相同的混合血斑，多年来一直是法医学有待解决的问题。法医学混合血斑目前无法通过现有dna提取方法来达到分离混合成分的问题。


技术实现要素：

[0009]
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种适用于混合血斑的dna分层提取方法及其应用，通过逐步消化混合斑的三个层面，达到分离混合成分的目的，为法医学混合血斑的个体来源识别提供了一种有效方案。
[0010]
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
[0011]
适用于混合血斑的dna分层提取方法，具体步骤如下：
[0012]
(1)固定血痕：将钢针插入混合血斑中，以钢针为中心，剪下一块圆形血痕；
[0013]
(2)三步分离法提取dna：从血痕中提取上层细胞dna，去除中层细胞dna，提取下层细胞dna；
[0014]
(3)分别将上层细胞dna和下层细胞dna利用常染色体试剂盒进行扩增，得扩增产物；
[0015]
(4)对扩增产物进行毛细管电泳分析和基因分析。
[0016]
作为优选的技术方案之一，步骤(1)中，钢针短于1.5ml离心管，血痕直径为4mm。
[0017]
作为优选的技术方案之一，步骤(2)中，上层细胞dna的提取方法如下：先将血痕转移至离心管内，加入双蒸水完全浸没血痕，静置浸泡，轻轻捏住钢针取出血痕，吸出浸泡液，然后向离心管中加入chelex100，加热孵育，将上层液体轻轻转移到另一离心管中，水浴加热，离心取上清，即得上层细胞dna的提取液。
[0018]
作为进一步优选的技术方案之一，在提取上层细胞dna时，静置浸泡时间为5～10分钟；加热孵育的工艺条件为：56℃孵育20分钟；水浴加热的工艺条件为：98℃水浴10分钟；离心的工艺条件为：13000rpm离心3分钟。
[0019]
作为优选的技术方案之一，步骤(2)中，中层细胞dna的去除方法如下：将提取上层细胞dna后的血痕置于离心管中，加入双蒸水完全浸没血痕，加热消化，去除固定用的钢针，离心弃上清即可。
[0020]
作为进一步优选的技术方案之一，加热消化的工艺条件为：56℃消化40分钟；离心
的工艺条件为：13000rpm离心3分钟。
[0021]
作为优选的技术方案之一，步骤(2)中，下层细胞dna的提取方法如下：剪碎置于离心管中的血痕，加入双蒸水完全浸泡血痕，加热消化，加入chelex100，水浴加热，振荡后离心，取上清，即得下层细胞dna的提取液。
[0022]
作为进一步优选的技术方案之一，加热消化的工艺条件为：56℃孵育60分钟左右。水浴加热的工艺条件为：98℃水浴10分钟；离心的工艺条件为：13000rpm离心3分钟。
[0023]
作为优选的技术方案之一，步骤(3)中，利用常染色体试剂盒进行扩增2次，以防止扩增不平衡导致基因型判定受干扰。
[0024]
作为优选的技术方案之一，步骤(3)中，具体扩增体系参照试剂盒说明书，pcr反应的循环参数为：96℃，1min；94℃，10sec，60℃，1min，72℃，30sec 30循环；60℃终延伸20min。
[0025]
作为优选的技术方案之一，步骤(4)中，将扩增产物与分子量内标、hi-di甲酰胺混合后，95℃变性3分钟，之后冰浴冷却，进行毛细管电泳分析。
[0026]
作为优选的技术方案之一，步骤(4)中，应用genemapper分析软件进行基因分析。
[0027]
上述dna分层提取方法在混合血斑个体来源识别中的应用。
[0028]
本发明的有益效果：
[0029]
为了解决现有dna提取方法无法分离混合血斑的难题，本发明首先提出混合血斑三层理论：即当二名个体的血在体外相遇，会启动凝血机制，并不会是二名个体血细胞的均匀混合，而是二种成分存在一定的接触面之后逐渐凝固。因而，混合血斑理论上会存在三个层面：上层，中层及下层。上层成分大多来源于一名个体血细胞，中层由二名个体成分混合，即为最明显的混合成分，下层大多来源于另一名个体细胞。如果能够把混合血斑的三层分别提取，那么将有希望分离混合斑。即使没有得到单一成分的dna，如果能把混合比接近的不可识别混合斑人为提取成混合比差异较大的可识别混合dna，那么混合血斑个体来源的识别将可获得突破。
[0030]
本发明通过三个步骤提取、分离不同层面的细胞dna。提取过程设计为：步骤一设计为提取混合斑的上层细胞，但同时要避免破坏中层及下层细胞,该步骤为本发明技术的关键，与常规dna提取不一样的是，为了保持血痕最初的三层状态，在检测之前必须固定血痕，同时严格控制血斑洗涤及56℃消化时间，获取上层细胞dna备用；步骤二设计为去除中层混合细胞dna，同时又不能过多消化下层细胞，消化时间约为40分钟；步骤三设计为提取下层细胞dna，提取方法与时间与常规提取方法一致。
[0031]
本发明最理想的检测效果是步骤一检测到上层细胞，步骤三获得下层细胞dna，即获得二张单一dna图谱。即使没得到纯净的单一成分dna，但在第一步骤和/或第三步骤如果获得混合比存在差异的可识别混合图谱，也属于有效的混合斑分离。如果获得一个单一dna图谱，一个混合图谱，在获知了其中一混合成分基因型的情况下，另一成分容易推导(见表1)。如果本方法没有从dna提取的过程中获得单一来源dna，但如果在步骤一和步骤三的二张dna图谱中出现混合比显著差异，那么此时至少一张图谱属于可识别混合dna(混合成分不相近)，同时，所产生的存在差异二张图谱，能把多种可能的基因型进行进一步排除，获得特定的基因型组合。
[0032]
用图1二个基因座(d1s1656、d13s317)作为示范，解释本发明dna提取三步分离法
获得混合比存在显著差异的二张图谱在基因型判定的意义。图1中每条峰标记等位基因名字及等位基因峰高，混合图谱中主要/次要成分(或贡献者1/贡献者2)混合比评估是通过等位基因不重叠的基因座来确定：较大等位基因的str峰值高度总和除以较小等位基因峰高度之和。以图1中基因座d1s1656步骤三(b)为例：r＝(1835+1236)/(689+516)＝2.55(r为ratio(比值)的缩写)。步骤一中混合比相近(为不可识别混合dna)，步骤三的混合比大于2:1。在图1中d1s1656基因座步骤一(a)很难确定基因型组合(表1中的所有组合均有可能)，但通过步骤三图谱(可识别混合dna)可确定基因型组合为11、16/15、17；在图1中d13s317基因座，步骤一的基因型组合可为8,8/10,12或8,10/8,12(混合比约1:1)；而步骤三中的组合可以是8,8/10,12、8,12/10,10或8,10/12,12(混合比约2:1)，结合步骤一和步骤三后，基因型组合确定为8,8/10,12。
[0033]
本发明的具体优势如下：
[0034]
1、dna提取三步分离法有希望获得单一成分dna，获得其基因型，此时另一成分信息将容易推导，可成功分离混合成分。
[0035]
2、可让混合成分相近的混合斑，通过“dna提取三步分离法”成为混合成分不相近的可识别混合斑，解决不可识别混合斑判定困难的问题(如图1中a步骤三)。
[0036]
3、dna提取三步分离法可获得到二张不同的图谱，结合该二张图谱更容易推导特定的基因型(如结合图1中b步骤一及步骤三)。
[0037]
本发明dna分离技术是基于chelex 100提取法，通过常染色体dna扩增、毛细管电泳技术进行混合成分分离，所采用的试剂及仪器均已在法医学dna实验室广泛应用，整个操作过程简单，成本低，对人员及仪器要求不高。因此本发明可以直接应用于设有毛细管电泳技术的生物实验室。本发明对于混合血痕的dna提取提出新策略，结合现有的pcr技术、通用的毛细管电泳平台基础，能实现一部分混合血斑的分离。本发明的检测成本低、操作简单、易于推广，有益于在法医学实验室推广应用。本发明为法医学混合血斑提供一种新的分离技术，使分离混合血斑成为可能，能为法庭科学的个体识别提供有力支持。
[0038]
本发明所采用的检测技术，经检测60处混合血斑，43处步骤一和步骤三图谱有差异(其中4例在步骤一中获得了近似单一成分dna图谱)，这使混合血斑个体识别成为可能。
附图说明
[0039]
图1是dna提取三步分离法获得混合比存在显著差异的二个基因座示范图谱，其中a为步骤一，b为步骤三。
[0040]
图2是dna提取三步分离法获得单一dna和混合dna的典型图谱，其中，a为步骤一获得的单一成分dna图谱，来源于上层细胞；b为下层细胞为主要成分的混合图谱。
[0041]
图3是dna提取三步分离法产生的二张不同混合比的典型图谱，其中，a来自步骤一，混合比接近1：1；b来自步骤三，混合比约2.5：1。
具体实施方式
[0042]
下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
[0043]
以下用具体实例进一步具体说明本发明，所使用的主要试剂和仪器如下：
[0044]
1)自动激光荧光毛细管电泳3130遗传分析仪，abi公司
[0045]
2)9700pcr扩增仪，abi公司
[0046]
3)台式高速离心机eppendorf公司
[0047]
4)移液器eppendorf公司
[0048]
5)hi-di甲酰胺abi公司
[0049]
6)扩增试剂盒powerplex21(德国promega公司)
[0050]
7)chelex 100(购自美国bio-rad公司)
[0051]
实施例：
[0052]
本发明基于对混合血斑采用“三步提取分离法”来获取第一层和第三层细胞dna，经过扩增、毛细管电泳获得二张有差异的常染色体图谱，应用二张图谱分析法判定混合成分基因型。
[0053]
1)为了保持混合血痕的最初状态，第一步能得到相对纯净的上层dna，本发明提取dna的前提是血痕的固定，以防止在提取过程中载体血痕发生翻滚。一根短于1.5ml离心管的钢针插入血斑中，以钢针为中心，剪大约直径4mm的圆形血痕。
[0054]
2)三步分离法提取dna：
[0055]
步骤一提取上层细胞dna：钢针固定的血斑放入1.5ml离心管中(离心管1)，加入约500μl ddh2o浸泡约5分钟，期间避免摇晃、振荡。轻轻捏住针柄取出血痕，吸出浸泡液，然后加入10％chelex100约50ul于离心管1中，在56℃下孵育约20分钟。在不离心的情况下，将上层液体轻轻转移到另一离心管2中，然后离心管2经过98℃水浴10分钟，13000rpm离心3分钟，上层液体备用(之后扩增时dna模板尽量不吸取到底部)。
[0056]
步骤二去除中层细胞dna：加入约100μl ddh2o于离心管1，56℃消化约40分钟，去除固定的钢针，以13000rpm离心3分钟后去除上清液。
[0057]
步骤三提取下层细胞dna：剪碎血斑，添加约50μl ddh2o，在56℃消化60分钟，之后的步骤遵循常规的chelex100提取方法：98℃水浴约10分钟，振荡后高速离心3分钟，上层液体用于检测(扩增模板尽量不吸取到底部)。
[0058]
3)以上步骤一和步骤三提取dna用常染色体试剂盒扩增二次(21试剂盒)，目的是防止存在扩增不平衡而导致基因型判定受干扰。具体扩增体系参照试剂盒说明书，pcr反应的循环参数为：96℃，1min；94℃，10sec，60℃，1min，72℃，30sec 30循环；60℃终延伸20min。
[0059]
4)毛细管电泳检测扩增产物：扩增产物与分子量内标、hi-di甲酰胺混合后，95℃变性3分钟，之后冰浴冷却后，进行毛细管电泳分析。
[0060]
5)基因型判定：应用genemapper分析软件对步骤一和步骤三图谱进行基因分析。
[0061]
图2为本发明的dna提取三步分离法获得单一dna和混合dna的典型图谱。a为步骤一获得的单一成分dna图谱，来源于上层细胞；b为下层细胞为主要成分的混合图谱。表2为从步骤一中获得的上层成分1基因型，推导成分2基因型，结果与血液提供者基因型一致。检测结果证明混合血斑三层理论是正确并可实施的，有希望从混合血斑中分离得到单一dna。
[0062]
表2推导混合成分基因型
[0063][0064][0065]
试验例
[0066]
1)混合血斑制备
[0067]
制备以滤纸及白色薄棉布为载体的混合血斑。8例湖南无关个体血样，1至8随机编号。按照1和2号混合、3和4号混合，以此类推。取一名个体(比如1号)200μl新鲜血分别滴在滤纸及棉布上，然后立即取同量另一个体新鲜血滴在1号血上。滤纸混合血斑放置在常温24小时以上，薄棉布血斑常温放置24小时以上(所检测的棉布血斑不超过一周)。
[0068]
2)dna的提取
[0069]
步骤一提取上层细胞dna：钢针固定的血斑放入1.5ml离心管中(离心管1)，加入约500μl ddh2o浸泡约5分钟，期间避免摇晃、振荡。轻轻捏住针柄取出血痕，吸出浸泡液，然后加入10％chelex100约50ul于离心管1中，在56℃下孵育约20分钟。在不离心的情况下，将上层液体轻轻转移到另一离心管2中，然后离心管2经过98℃水浴10分钟，13000rpm离心3分钟，上层液体备用(之后扩增时dna模板尽量不吸取到底部)。
[0070]
共进行60例混合血斑检测，其中滤纸载体和薄布片载体各30例，用“三步提取法”从60个血样中提取基因组dna，以步骤一及步骤三提取的dna作为下述扩增体系中扩增。
[0071]
3)扩增
[0072]
dna扩增参照试剂盒说明书如下：powerplex21试剂盒(常染色体检测体系，德国promega公司)10μl扩增反应体系：5
×
pcr反应混合物2μl，5
×
pp21引物混合物2μl，模板dna 6μl，去离子水0μl。
[0073]
pcr反应循环参数：96℃，1min；94℃，10sec，60℃，1min，72℃，30sec 30循环；60℃终延伸20min。
[0074][0075]
4)毛细管电泳检测
[0076]
扩增产物和等位基因分型标准物混合物均取1μl，分别加入9μl的hi-di甲酰胺和0.5μl wen ils 500分子量内标混匀，95℃下变性3min，迅速冷却，用美国abi公司的遗传分析仪3130进行电泳检测。应用data collection 3.0软件收集数据。
[0077]
5)混合成分基因分型
[0078]
genemapper v3.2软件对电泳结果进行基因分析。
[0079]
对比例(常规混合斑提取法)：
[0080]
1)dna的提取
[0081]
共进行10处混合血斑检测，用常规chelex100法从血样中提取基因组dna。方法如下：剪大约3mm
×
3mm血痕，加入约500μl ddh2o浸泡约30分钟，期间摇晃、振荡；13000rpm离心3分钟，去上清，然后加入10％chelex100约200ul，在56℃下孵育约60分钟，然后98℃水浴10分钟，13000rpm离心3分钟，上层液体备用。
[0082]
2)扩增
[0083]
dna扩增参照试剂盒说明书如下：powerplex21试剂盒(常染色体检测体系，德国promega公司)10μl扩增反应体系：5
×
pcr反应混合物2μl，5
×
pp21引物混合物2μl，模板dna 1μl，去离子水5μl。
[0084]
pcr反应循环参数：96℃，1min；94℃，10sec，60℃，1min，72℃，30sec 30循环；60℃终延伸20min。
[0085][0086]
3)毛细管电泳检测
[0087]
扩增产物和等位基因分型标准物混合物均取1μl，分别加入9μl的hi-di甲酰胺和0.5μlwen ils 500分子量内标混匀，95℃下变性3min，迅速冷却，用美国abi公司的遗传分析仪3130进行电泳检测。应用data collection 3.0软件收集数据。
[0088]
4)混合成分基因分型
[0089]
genemapper v3.2软件对电泳结果进行基因分析。
[0090]
三步提取法所检测的30处滤纸血斑中，共22处获得了二张差异图谱：4个滤纸血斑在步骤一检测到了近似单一来源的dna，步骤三中观察到下层细胞为主要成分的混合图谱(参见图2)；2处滤纸血斑步骤一中检测到混合图谱，在步骤三中检测到接近单一成分的dna图谱；16处混合斑在步骤一和步骤三中获得了有显著差异的二张图谱。
[0091]
三步提取法所检测30处棉布载体血斑(存放室温不超过七天)，21处在步骤一及步骤三中获得了混合比有显著差异的二张混合图谱(参见图3)。其中，a来自步骤一，混合比接近1：1；b来自步骤三，混合比约2.5：1。
[0092]
本发明方法二张图谱中至少有一张是混合成分差异大的可识别混合图谱，使混合量相近的不可识别混合血斑成为可识别，结合二张图谱，使推导基因型组合更容易，能获得二名血液贡献者的明确基因型(基因型推导结果同表2)。
[0093]
常规dna提取法检测混合斑10处，均为一张混合图谱。其中混合比接近的图谱(不可识别混合斑)，在四条峰、三条峰及二条峰(二条峰峰高相近的情况)的基因座均无法明确判定混合成分基因型(即存在多种可能的基因型，如表1)。
[0094]
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

技术特征：
1.适用于混合血斑的dna分层提取方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)固定血痕：将钢针插入混合血斑中，以钢针为中心，剪下一块圆形血痕；(2)三步分离法提取dna：从血痕中提取上层细胞dna，去除中层细胞dna，提取下层细胞dna；(3)分别将上层细胞dna和下层细胞dna利用常染色体试剂盒进行扩增，得扩增产物；(4)对扩增产物进行毛细管电泳分析和基因分析。2.根据权利要求1所述的dna分层提取方法，其特征在于，步骤(1)中，钢针短于1.5ml离心管，血痕大小为4mm
×
4mm。3.根据权利要求1所述的dna分层提取方法，其特征在于，步骤(2)中，上层细胞dna的提取方法如下：先将血痕转移至离心管内，加入双蒸水完全浸没血痕，静置浸泡，轻轻捏住钢针取出血痕，吸出浸泡液，然后向离心管中加入chelex100，加热孵育，将上层液体轻轻转移到另一离心管中，水浴加热，离心取上清，即得上层细胞dna的提取液。4.根据权利要求3所述的dna分层提取方法，其特征在于，在提取上层细胞dna时，静置浸泡时间为5～10分钟；加热孵育的工艺条件为：56℃孵育20分钟；水浴加热的工艺条件为：98℃水浴10分钟；离心的工艺条件为：13000rpm离心3分钟。5.根据权利要求1所述的dna分层提取方法，其特征在于，步骤(2)中，中层细胞dna的去除方法如下：将提取上层细胞dna后的血痕置于离心管中，加入双蒸水完全浸没血痕，加热消化，去除固定用的钢针，离心弃上清即可。6.根据权利要求5所述的dna分层提取方法，其特征在于，加热消化的工艺条件为：56℃消化40分钟；离心的工艺条件为：13000rpm离心3分钟。7.根据权利要求1所述的dna分层提取方法，其特征在于，步骤(2)中，下层细胞dna的提取方法如下：剪碎置于离心管中的血痕，加入双蒸水完全浸泡血痕，加热消化，加入chelex100，水浴加热，振荡后离心，取上清，即得下层细胞dna的提取液。8.根据权利要求7所述的dna分层提取方法，其特征在于，加热消化的工艺条件为：56℃孵育60分钟；水浴加热的工艺条件为：98℃水浴10分钟；离心的工艺条件为：13000rpm离心3分钟。9.根据权利要求1所述的dna分层提取方法，其特征在于，步骤(3)中，具体扩增体系参照试剂盒说明书，pcr反应的循环参数为：96℃，1min；94℃，10sec，60℃，1min，72℃，30sec30循环；60℃终延伸20min；步骤(4)中，将扩增产物与分子量内标、hi-di甲酰胺混合后，95℃变性3分钟，之后冰浴冷却，进行毛细管电泳分析；步骤(4)中，应用genemapper分析软件进行基因分析。10.权利要求1～9中任一项所述dna分层提取方法在混合血斑个体来源识别中的应用。

技术总结
本发明公开了适用于混合血斑的DNA分层提取方法及其应用。本发明对于混合血痕的DNA提取提出新策略，结合现有的PCR技术、通用的毛细管电泳平台基础，能实现一部分混合血斑的分离。本发明的检测成本低、操作简单、易于推广，有益于在法医学实验室推广应用。本发明为法医学混合血斑提供一种新的分离技术，使分离混合血斑成为可能，能为法庭科学的个体识别提供有力支持。力支持。力支持。


技术研发人员：黄健 蔡金洪 郝伟琪
受保护的技术使用者：湖南省脑科医院（湖南省第二人民医院）
技术研发日：2023.05.20
技术公布日：2023/8/2