快速检测尿液脱落细胞基因甲基化的试剂及方法与流程

1.本发明涉及分子医学技术领域，具体地属于核酸检测技术领域，涉及一种尿液细胞基因甲基化的快速检测试剂及方法。


背景技术：

2.肿瘤尤其是恶性肿瘤严重威胁着人们的生命健康，是当今全球突出的公共卫生问题。肿瘤的防治重点在于早发现早诊断早治疗。近年来，基因诊断在人类多种肿瘤、疾病的早诊、治疗以及预后评估中受到广泛重视。
3.dna甲基化(dna methylation)是发生在胞嘧啶5号碳原子上的一种表观修饰，与人类发育、基因转录调节、遗传印记和肿瘤等疾病密切相关。特别是cpg岛异常甲基化与肿瘤抑制基因的转录失活有关，是肿瘤发生的一个重要因素。迄今为止，超过1000多个基因cpg甲基化与癌症有关。基因甲基化是肿瘤早期的重要生物学特征改变，因此，检测相关的重要基因甲基化在肿瘤早筛查早诊断中得到了广泛的应用。
4.特定基因的甲基化检测可以通过亚硫酸盐测序(bisulfite sequencing),甲基化特异性pcr(ms-pcr)等方法,其中ms-pcr方法简单方便最为常用。通过核酸提取方法提取dna，接着用亚硫酸盐处理标本dna，最后通过针对特定区域设计的pcr引物对处理过的dna扩增进行分子检测。
5.常规方法检测标本基因甲基化涉及需要对生物样本的dna提取与纯化,包括样本的裂解、苯酚/氯仿提取(酚氯仿法、核酸沉淀等步骤，这种方式需要的实验步骤多，操作繁琐，耗时长，还涉及有毒有害的有机试剂使用。
6.另外，在实际应用中,检测标本,特别是临床获得的标本,细胞数量往往很有限，采用常规核酸提取与纯化方法存在诸多困难。目前虽然有很多商业化的dna提取试剂盒，采用dna吸附柱或dna吸附磁珠,能够有效提高dna提取效率,如qiagen公司的qiaamp dna mini kit,zymo公司的quick-dna
tm
urine kit，但仍然需要提取纯化步骤，且进口产品成本高，不利于临床大量标本应用时的普及与推广。
7.尿路上皮分布在泌尿系统的多个部位，包括肾盂、输尿管、膀胱和尿道。尿路上皮癌(urothelial carcinoma,uc)则是一种发生于尿路上皮的多灶性泌尿系统恶性肿瘤。膀胱来源的尿路上皮癌最为常见，而尿道来源的尿路上皮癌罕见。肾盂、输尿管和膀胱癌的发生比例分别为1：3：50。
8.膀胱癌是最常见的泌尿系统恶性肿瘤,也是男性癌症死亡的主要原因之一。膀胱镜检查是诊断膀胱癌的金标准。将膀胱镜插入患者尿道显示膀胱壁,对可疑病变进行组织活检。该技术具有侵入性，属创伤性检查，常导致病人疼痛和不适，接受程度低，费用高。尿脱落细胞学检查作为一种常见的膀胱癌非侵入性检查，其灵敏度不高，阳性率较低，临床检出率低及准确性差等不足给临床实际应用带来不便。
9.尿脱落细胞dna甲基化检测作为一种无创伤，非侵入性(只需患者尿液)诊断膀胱癌的方法，其敏感性远高于细胞学检查，可用于尿路上皮癌的早期辅助诊断和疾病监测，且
100mm:0.05-2％。
28.在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含缓冲剂或其缓冲液。所述缓冲剂选自柠檬酸盐、tris、磷酸盐中的任意一种或几种的组合。优选地，所述缓冲剂是tris。
29.在一个或多个实施方案中，所述离子螯合剂、蛋白变性剂、盐和表面活性剂的比例为0.05-0.5m:0.5-3m:5mm-50mm:0.1-1％；优选为0.05-0.2m:0.5-2m:10mm-30mm:0.1-0.3％；更优选地，所述离子螯合剂、蛋白变性剂、盐和表面活性剂的比例为约0.1m:1m:20mm:0.2％。
30.在一个或多个实施方案中，(2)的各组分置于1个、分开的2、3、4或更多个容器中。
31.在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含检测dna甲基化的试剂。在一个或多个实施方案中，所述试剂包括亚硫酸氢盐、酸式亚硫酸盐或焦亚硫酸盐或其任意组合。在一个或多个实施方案中，所述试剂包括与目标dna序列或其经转化的序列杂交的引物分子。所述引物分子能扩增出所述序列或其经转化的变体。在一个或多个实施方案中，所述试剂包括与目标dna序列或其经转化的序列杂交的探针分子。在一个或多个实施方案中，所述探针还含有可检测物。在一个或多个实施方案中，所述可检测物是5’端荧光报告基团和3’端标记淬灭基团。在一个或多个实施方案中，所述荧光报告基因选自fam、hex、rox、cy5和bhq3。
32.在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包括纯化dna的试剂。
33.在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包括pcr反应试剂。优选地，所述pcr反应试剂包括dna聚合酶、pcr缓冲液、dntp、mg
2+
。
34.在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包括检测dna甲基化的其他试剂，所述其他试剂是选自以下方法的一个或多个中所用的试剂：基于重亚硫酸盐转化的pcr(例如甲基化特异性pcr)、dna测序(如亚硫酸氢盐测序、全基因组甲基化测序、简化甲基化测序)、甲基化敏感的限制性内切酶分析法、荧光定量法、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法、基于芯片的甲基化图谱分析、质谱(例如飞行质谱)。优选地，所述其他试剂选自以下一种或多种：重亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、酸式亚硫酸盐或焦亚硫酸盐或其衍生物，甲基化敏感或不敏感的限制性内切酶，酶切缓冲液，荧光染料，荧光淬灭剂，荧光报告剂，外切核酸酶，碱性磷酸酶，内标，对照物。
35.在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含处理样品的试剂，例如pbs或水。
36.在一个或多个实施方案中，所述样品是细胞含量少的样品，其中的细胞数为至多100万个细胞/40ml，优选至多80万个细胞/40ml，更优选至多50万个细胞/40ml。在一些实施方案中，所述样品中的细胞数至多约20万个细胞/40ml。优选地，所述样品源自或是动物(优选哺乳动物，更优选人)的尿液。
37.本发明第二方面提供一种从细胞含量少的样品中制备含细胞dna的试剂的方法，包括用本文任一实施方案所述的细胞裂解液处理所述样品的细胞的步骤，所述样品中的细胞数为至多100万个细胞/40ml，优选至多80万个细胞/40ml，更优选至多50万个细胞/40ml。在一些实施方案中，所述样品中的细胞数至多约20万个细胞/40ml。
38.在一个或多个实施方案中，所述含细胞dna的试剂用于检测dna甲基化。
39.在一个或多个实施方案中，所述样品源自或是动物(优选哺乳动物，更优选人)的尿液。
40.在一个或多个实施方案中，所述细胞是尿液脱落细胞。
41.在一个或多个实施方案中，所述样品是尿液或尿液与尿液保存液的混合物。
42.在一个或多个实施方案中，所述尿液保存液是edta溶液，任选还含有抗生素。
43.在一个或多个实施方案中，所述方法包括步骤：将样品固液分离，用本文任一实施方案所述的细胞裂解液处理所得的固相。
44.在一个或多个实施方案中，所述方法包括步骤：
45.(1)将样品离心，优选5000rpm离心10分钟，
46.任选的(2)洗涤固相，优选用pbs洗涤固相，
47.(3)使用本文任一实施方案所述的细胞裂解液处理固相，优选所述处理是90℃孵育至少5min，和
48.(4)将所得的产物固液分离，获得含细胞dna的上清液。
49.在一个或多个实施方案中，细胞裂解液与样品中细胞的比例为大于或等于100ul细胞裂解液:100万个细胞，优选大于或等于100ul细胞裂解液:80万个细胞，更优选大于或等于100ul细胞裂解液:50万个细胞。在一个或多个实施方案中，细胞裂解液与样品中细胞的比例为大于或等于100ul细胞裂解液:20万个细胞。
50.在一个或多个实施方案中，制备细胞上清包括步骤：
51.(1)收集的尿液标本5000rpm离心10分钟，弃上清；
52.(2)细胞沉淀加1ml pbs重悬细胞转入eppendorf管，短暂离心后，弃pbs；
53.(3)细胞沉淀加100μl所述的细胞裂解液，充分混匀细胞，90℃ 10min；
54.(4)8,000～10,000rpm 4℃离心5～10min；
55.(5)取20μl上清直接用于dna亚硫酸盐转化。
56.在一个或多个实施方案中，所述细胞沉淀是尿液沉渣脱落细胞。优选地，所述尿液沉渣脱落细胞是40ml尿液离心得到的尿液脱落细胞。其中，样品中的尿液脱落细胞数为至多100万个细胞/40ml，优选至多80万个细胞/40ml，更优选至多50万个细胞/40ml。在一些实施方案中，所述样品中的细胞数至多约20万个细胞/40ml
57.本发明还提供一种检测样品中的细胞的dna的方法，包括步骤：
58.(1)本文任一实施方案所述的细胞裂解液处理所述样品中的细胞，获得含细胞dna的试剂，和
59.(2)检测目标dna序列，
60.所述样品中的细胞数为至多100万个细胞/40ml，优选至多80万个细胞/40ml，更优选至多50万个细胞/40ml。在一些实施方案中，所述样品中的细胞数至多约20万个细胞/40ml。
61.在一个或多个实施方案中，所述检测是检测dna的甲基化。
62.在一个或多个实施方案中，步骤(1)如本文第二方面任一实施方案所述。
63.在一个或多个实施方案中，步骤(2)为，采用选自以下的任一种方法检测目标dna序列的甲基化：基于重亚硫酸盐转化的pcr(例如甲基化特异性pcr)、dna测序(如亚硫酸氢盐测序、全基因组甲基化测序、简化甲基化测序)、甲基化敏感的限制性内切酶分析法、荧光定量法、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法、基于芯片的甲基化图谱分析、质谱(例如飞行质谱)。
64.本发明还提供(1)本文任一实施方案所述的细胞裂解液、或(2)如下比例的离子螯
合剂、蛋白变性剂、盐和表面活性剂：0.01-1m:0.1-5m:1-100mm:0.05-2％，在制备用于检测dna甲基化或诊断尿路上皮癌的试剂盒中的用途。
65.在一个或多个实施方案中，所述尿路上皮癌是肾盂癌、输尿管癌、膀胱癌或尿道癌中的一种或多种。
66.在一个或多个实施方案中，(2)还包含缓冲剂或其缓冲液。所述缓冲剂选自柠檬酸盐、tris、磷酸盐中的任意一种或几种的组合。优选地，所述缓冲剂是tris。
67.在一个或多个实施方案中，所述离子螯合剂、蛋白变性剂、盐和表面活性剂的比例为0.05-0.5m:0.5-3m:5mm-50mm:0.1-1％；优选为0.05-0.2m:0.5-2m:10mm-30mm:0.1-0.3％；更优选地，所述离子螯合剂、蛋白变性剂、盐和表面活性剂的比例为约0.1m:1m:20mm:0.2％。
68.本发明优点
69.本发明提供的免提取细胞dna直接进行甲基化pcr检测的细胞裂解液及方法应用，该方法无需额外的核酸提取，操作简单，快捷方便，同时也降低了检测成本，可以更好地应用于大量的临床上各种标本dna甲基化检测，大大增加临床诊断的准确性，可靠性。另外，还可以避免核酸提取中各种有机溶剂的使用，更环保。
附图说明
70.图1是标本-1采用本发明细胞裂解液直接法(a)与qiagen提取dna法(b)甲基化pcr结果比较。
71.图2是标本-2采用本发明细胞裂解液直接法(a)与qiagen提取dna法(b)甲基化pcr结果比较。
72.图3是标本-3采用本发明细胞裂解液直接法(a)与qiagen提取dna法(b)甲基化pcr结果比较。
73.图4是标本-4采用本发明细胞裂解液直接法(a)与qiagen提取dna法(b)甲基化pcr结果比较。
具体实施方式
74.传统方法中获得的尿沉渣细胞数量少、dna提取过程中有损失，导致最后得到的dna很微量，有时因量太少影响下一步的dna检测。基于传统方法存在的缺点，本发明提供了一种免提取dna快速检测细胞含量很少的样品中的基因甲基化的试剂及方法。省去dna提取步骤，将原始未经dna提取的样本直接加入到下游dna亚硫酸盐转化实验，处理后的dna用于pcr反应，减少检验步骤和实验周期，减少dna提取过程中的丢失，同时也降低提取dna造成的检验成本。采取免提dna方法需要解决的关键问题是裂解细胞所用裂解液的反应环境,需要与dna亚硫酸盐转化反应环境相匹配,不应对dna转化有明显的影响，不应导致pcr效率降低进而阴性结果产生的假阴性。
75.适合本发明方法的样品包括细胞含量少的样品，其中的细胞数为至多100万个细胞/40ml，优选至多80万个细胞/40ml，更优选至多50万个细胞/40ml。在一些实施方案中，样品中的细胞数至多约20万个细胞/40ml。特别适合地，所述样品源自或是动物(优选哺乳动物)的尿液，所述细胞是尿脱落细胞。本文所述的“尿脱落细胞”是指由肾盂、膀胱或尿道中
0.3％。在示例性实施方案中，表面活性剂sds的浓度为0.2％。
85.在一个或多个实施方案中，所述细胞裂解液中，edta的浓度为0.1m，异硫氰酸胍的浓度为1m，tris的浓度为0.5m，nacl的浓度为20mm，sds的浓度为0.2％。
86.试剂盒
87.上述细胞裂解液或其组分可以试剂盒的形式提供，用于本发明方法。在一个实施方案中，所述试剂盒包含本文所述细胞裂解液。在另一些实施方案中，所述试剂盒包含如下比例的离子螯合剂、蛋白变性剂、盐和表面活性剂：0.01-1m:0.1-5m:1-100mm:0.05-2％。在一个或多个实施方案中，各组分置于1个、分开的2、3、4或更多个容器中。
88.所述组分按比例组成的试剂盒还可包含缓冲剂或其缓冲液，所述缓冲剂选自柠檬酸盐、tris、磷酸盐中的任意一种或几种的组合。优选地，所述缓冲剂是tris。
89.本发明中所述试剂盒还可包括检测dna甲基化的试剂。
90.本文所述“dna”或“dna分子”即脱氧核糖核酸。dna基本组成单位是脱氧核糖核苷酸，经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。每个脱氧核糖核苷酸由磷酸、脱氧核糖和碱基组成。dna的碱基(base)主要有腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)和胸腺嘧啶(t)。在双链dna的双螺旋结构中，a与t经氢键配对，g与c经氢键配对。dna形式包括cdna、基因组dna、片段化dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以为任意长度，例如50-500bp，100-400bp，150-300bp或200-250bp。
91.本发明涉及检测dna甲基化的试剂是本领域周知检测dna甲基化方法中所用的试剂。在一个或多个实施方案中，检测dna甲基化的试剂包括亚硫酸氢盐、酸式亚硫酸盐或焦亚硫酸盐或其任意组合。
92.在一个或多个实施方案中，所述试剂还包括与目的dna序列或其经转化的序列杂交的引物分子。所述引物分子能扩增出所述序列或其经转化的变体。
93.本文所述“引物”或“引物分子”是指在核苷酸聚合作用起始时，引导合成的一种具有特定核苷酸序列的核酸分子。引物通常至少9bp。引物序列可为甲基化特异的或非特异的。通常，引物被设计为扩增的产物长度为1-2000bp、10-1000bp、30-900bp、40-800bp、50-700bp、或至少150bp、至少140bp、至少130bp、至少120bp。示例性的实施方案中，针对actin的引物具有seq id no:1和seq id no:2所示的序列。
94.检测dna甲基化的试剂还可包括与待测序列杂交的检测探针。通常，检测探针的序列的5’端标记荧光报告基团，3’端标记淬灭基团。在一个或多个实施方案中，所述荧光报告基因选自fam、hex、rox、cy5和bhq3。
95.在示例性实施方案中，针对actin的检测探针具有seq id no:3所示的序列。
96.所述试剂盒还可包括纯化dna的试剂。这些试剂本领域技术人员熟知。
97.所述试剂盒还可包括pcr反应试剂。这些试剂本领域技术人员熟知，例如dna聚合酶、pcr缓冲液、dntp、mg2+。
98.此外，试剂盒还可包括检测dna甲基化的其他试剂，所述其他试剂是选自以下方法的一个或多个中所用的试剂：基于重亚硫酸盐转化的pcr(例如甲基化特异性pcr)、dna测序(如亚硫酸氢盐测序、全基因组甲基化测序、简化甲基化测序)、甲基化敏感的限制性内切酶分析法、荧光定量法、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法、基于芯片的甲基化图谱分析、质谱(例如飞行质谱)。优选地，所述其他试剂选自以下一种或多种：重亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、
酸式亚硫酸盐或焦亚硫酸盐或其衍生物，甲基化敏感或不敏感的限制性内切酶，酶切缓冲液，荧光染料，荧光淬灭剂，荧光报告剂，外切核酸酶，碱性磷酸酶，内标对照物。pcr所需的反应液包含taq dna聚合酶、pcr缓冲液、dntps、kcl、mgcl2和(nh4)2so4。优选地，taq dna聚合酶为热启动taq dna聚合酶。优选地，mg
2+
终浓度为1.0-10.0mm。
99.所述试剂盒还可包含处理样品的试剂。根据样品的不同，本领域技术人员可以选择适当的处理实际，例如pbs或水。
100.方法
101.使用本文提供的细胞裂解液处理样品可从细胞含量少的样品中制备含细胞dna的试剂。具体地，所述方法包括步骤：(1)将样品离心，优选5000rpm离心10分钟，任选的(2)洗涤固相，优选用pbs洗涤固相，(3)使用本文任一实施方案所述的细胞裂解液处理固相，和(4)将所得的产物固液分离，获得含细胞dna的上清液。术语“处理”表示将细胞与细胞裂解液接触一定的时间。例如，将含细胞的溶液或沉淀与细胞裂解液充分混匀细胞，90℃孵育至少1min。
102.在示例性实施方案中，所述样品是尿液或尿液与尿液保存液的混合物。步骤(3)中的细胞裂解液与样品中细胞的比例为大于或等于100ul细胞裂解液:100万个细胞，优选大于或等于100ul细胞裂解液:80万个细胞，更优选大于或等于100ul细胞裂解液:50万个细胞。更具体地，所述方法包括步骤：(1)收集的尿液标本5000rpm离心10分钟，弃上清；(2)细胞沉淀加1ml pbs重悬细胞转入eppendorf管，短暂离心后，弃pbs；(3)细胞沉淀加100μl所述的细胞裂解液，充分混匀细胞，90℃ 10min；(4)8,000～10,000rpm 4℃离心5～10min；(5)取20μl上清直接用于dna亚硫酸盐转化。其中，步骤(2)中的细胞沉淀是尿液沉渣脱落细胞。
103.由本发明的细胞裂解液制备得到的含细胞dna的试剂尤其适合进行dna转化和甲基化检测，在转化前无需进行dna提取或纯化。因此，本发明还提供一种检测样品中细胞dna的方法，包括步骤：(1)使用本文所述的细胞裂解液处理所述样品中的细胞，获得含细胞dna的试剂，和(2)检测目标dna序列。
104.步骤(2)的检测用于确定dna的性质，例如序列、结构、修饰(例如甲基化)水平等。例如，可采用选自以下的任一种方法检测目标dna序列的甲基化：基于重亚硫酸盐转化的pcr(例如甲基化特异性pcr)、dna测序(如亚硫酸氢盐测序、全基因组甲基化测序、简化甲基化测序)、甲基化敏感的限制性内切酶分析法、荧光定量法、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法、基于芯片的甲基化图谱分析、质谱(例如飞行质谱)。优选地，本发明采用基于重亚硫酸盐转化的pcr进行dna甲基化检测。
[0105]“含细胞dna的试剂”是指经所述细胞裂解液处理后的含细胞dna的液体或固体，其可用于dna检测，例如用于dna亚硫酸盐转化及后续的pcr扩增。亚硫酸盐转化试剂盒包括qiagen、sigma、zymo research、life technologies等产品。在一个或多个实施方案中，所述dna亚硫酸盐转化试剂盒是上海长岛公司亚硫酸盐dna转化试剂盒。
[0106]
在具体实施方案中，检测样品中的细胞的dna甲基化的方法包括步骤：(1)使用本文所述的细胞裂解液处理所述样品中的细胞，获得含细胞dna的试剂，和(2)将所述含细胞dna的试剂与亚硫酸盐接触，进行dna转化，任选的(3)纯化所述转化的dna，(4)对目标dna序列进行pcr，例如荧光定量pcr。
[0107]
以下将以具体实施例的方式对本发明作进一步说明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非用于限制本发明的范围。实施例中所用到的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域的常规方法和试剂。
[0108]
实施例
[0109]
实施例1：细胞裂解液的制备
[0110]
细胞裂解液由表面活性剂、离子螯合剂，蛋白强变性剂及缓冲液的共同组成。具体的，
[0111]
乙二胺四乙酸二钠(edta)2.92克，十二烷基硫酸钠(sds)0.2克，异硫氰酸胍11.8克，nacl 0.116克，50毫升1摩尔ph 7.0的tris缓冲液，终体积为100毫升。edta浓度为0.1m，sds的浓度为0.2％，tris的浓度为0.5m，nacl的浓度为20mm，异硫氰酸胍的浓度为1m。
[0112]
实施例2：尿液样本采集及处理
[0113]
收集正常人尿液40ml x 2管,分别加2ml尿液保存液(2mm edta，0.1％青霉素/链霉素)充分混匀,备用。
[0114]
实施例3：尿沉渣细胞裂解，细胞上清制备
[0115]
(1)收集的尿液标本5000rpm离心10分钟，弃上清；
[0116]
(2)细胞沉淀加1ml pbs重悬细胞转入eppendorf管，短暂离心后，弃pbs；
[0117]
(3)细胞沉淀加100μl所述的细胞裂解液，充分混匀细胞，90℃ 10min
[0118]
(4)8,000～10,000rpm 4℃离心5～10min
[0119]
(5)取20μl上清直接用于dna亚硫酸盐转化
[0120]
对照样本为：采用预先细胞dna提取：
[0121]
作为本发明方法的对照实验，相同等分(40ml尿液标本)的尿液细胞沉淀采用qiagen公司的qiaamp dna mini kit试剂盒按照标准操作流程进行dna提取操作。
[0122]
(1)尿液标本40ml，加2ml尿液保存液充分混匀
[0123]
(2)5000rpm离心10min,弃上清液，
[0124]
(3)细胞沉淀加10ml pbs悬浮细胞，5000rpm离心10min
[0125]
(4)细胞沉淀重新悬浮在1ml pbs中，转移到eppendorf管中，5000rpm离心10min
[0126]
(5)弃上清液留沉淀，细胞dna提取采用qiaamp mini dna kits(qiagen 51304)
[0127]
(6)40μl te洗脱dna
[0128]
(7)nanodrop紫外光度计检测dna含量和纯度(od260/280》1.8)
[0129]
实施例4：dna亚硫酸盐转化
[0130]
在0.5ml pcr管中配制亚硫酸盐转化反应体系(上海长岛公司亚硫酸盐dna转化试剂盒)，具体配制体系如下：
[0131][0132]
反应体系配置好后，在pcr仪设置温度变化程序进行亚硫酸盐转化：
[0133]
[95℃5min，60℃20min]
×
2，循环，保持4℃；
[0134]
实施例5：dna转化后的纯化
[0135]
(1)亚硫酸盐处理结束后,经过短暂离心,将管中反应体系转移至干净的1.5ml离心管；
[0136]
(2)加入1ml 6m盐酸胍和40μl磁珠,涡旋混匀10sec,静置5min；
[0137]
(3)将离心管置于磁力架上静置1min,待磁珠吸附后弃去液体；
[0138]
(4)加入600μl漂洗液(80％酒精/50mm tris buffer),涡旋混匀10sec,磁珠吸附后弃液体；
[0139]
(5)加入600μl脱硫液(0.3n naoh/90％etoh),涡旋混匀10sec,放置15min,磁珠吸附后弃液体；
[0140]
(6)加入600μl漂洗液(80％etoh/50mm tris buffer),涡旋混匀10sec,磁珠吸附后弃液体
[0141]
(7)重复漂洗液漂洗一次
[0142]
(8)磁珠室温晾干3～5min至无液体残余
[0143]
(9)加入40μl预热1x te缓冲液并混匀磁珠,室温放置3min
[0144]
(10)将离心管置于磁力架上静置1min，待磁珠吸附后收集洗脱产物(即为已纯化的转化dna)
[0145]
实施例6：荧光定量甲基化pcr
[0146]
每例标本分成2份同时进行pcr基因检测:
[0147]
(a)本发明所述的细胞裂解液上清
[0148]
(b)qiagen试剂盒提取的dna对照样品
[0149]
模板为经亚硫酸盐转化的dna(标本a,b)
[0150]
检测基因为actin，基因引物如下：
[0151]
seq id no.1：上游引物:5
’‑
tggtgatggaggaggtttagtaagt-3’；
[0152]
seq id no.2：下游引物:5
’‑
aaccaataaaacctactcctcccttaa-3’[0153]
所述actb荧光探针如下:
[0154]
seq id no.3：cy5-tgtgtttgttattgtgtgttgggtggtggt-bhq3
[0155]
引物和探针委托上海生工生物技术公司合成。
[0156]
pcr的反应体系(25μl):
[0157]
5μl亚硫酸盐转化dna
[0158]
6μl 4x hu mp buffer(上海翌圣公司)
[0159]
2.5μl引物+荧光探针混合液
[0160]
9.5μl h2o
[0161]
2μl enzyme mix(上海翌圣公司)
[0162]
同时取未转化dna设置为对照
[0163]
pcr扩增条件：95℃预变性4min,40个循环(95℃15s，61℃30s),72℃30，之后4℃保存。
[0164]
结果检测如图1-图4所示，经优化的细胞裂解液处理后直接pcr扩增效果与qiagen试剂盒抽提法提取的dna为模板的pcr扩增效果相比，两者皆可以很好地检测出dna甲基化，即本发明所述的细胞裂解液上清在免去dna提取步骤后，依然能够达到预先提取dna进行甲
基化pcr检测的技术效果，且在处理时间上明显缩短，操作简化。

技术特征：
1.一种细胞裂解液，所述细胞裂解液包括离子螯合剂、蛋白变性剂、缓冲液、盐以及表面活性剂，优选地，所述离子螯合剂选自乙二胺四乙酸钠盐(edta)或钾盐、乙二醇二乙醚二胺四乙酸钠盐或钾盐中的任意一种或几种的组合，和/或所述蛋白变性剂选自尿素、盐酸胍和异硫氰酸胍中的任意一种或几种的组合，和/或所述缓冲液选自柠檬酸盐缓冲液、tris缓冲液、磷酸盐缓冲液中的任意一种或几种的组合，和/或所述盐选自nacl、kcl、cacl2、mgcl2和na2so4中的任意一种或几种的组合，和/或所述表面活性剂选自十二烷基硫酸钠(sds)、n-月桂酰肌氨酸(nls)、triton x-100或乙基苯基聚乙二醇(nonidet p40，np-40)中的任意一种或几种的组合。2.如权利要求1所述的细胞裂解液，其特征在于，所述离子螯合剂是乙二胺四乙酸钠盐(edta)，和/或所述蛋白变性剂是异硫氰酸胍，和/或所述缓冲液是tris缓冲液，和/或所述表面活性剂是十二烷基硫酸钠(sds)。3.如权利要求1或2所述的细胞裂解液，其特征在于，细胞裂解液中离子螯合剂的浓度为0.01-1m，优选0.05-0.5m，更优选0.05-0.2m，细胞裂解液中蛋白变性剂的浓度为0.1-5m，优选0.5-3m，更优选0.5-2m，细胞裂解液中缓冲液的浓度为0.1-1m，优选0.3-0.8m，更优选0.4-0.6m，细胞裂解液中盐的浓度为1-100mm，优选5mm-50mm，更优选10mm-30mm，细胞裂解液中表面活性剂的浓度为0.05-2％，优选0.1-1％，更优选0.1-0.3％。4.如权利要求3所述的细胞裂解液，其特征在于，缓冲液的浓度为0.5m，离子螯合剂的浓度为0.1m，蛋白变性剂的浓度为1m，盐的浓度为20mm，表面活性剂的浓度为0.2％。5.一种试剂盒，包含：(1)权利要求1-4中任一项所述的细胞裂解液，或(2)如下比例的离子螯合剂、蛋白变性剂、盐和表面活性剂：0.01-1m:0.1-5m:1-100mm:0.05-2％，优选地，(2)中所述离子螯合剂、蛋白变性剂、盐和表面活性剂的比例为0.05-0.5m:0.5-3m:5mm-50mm:0.1-1％。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含检测dna甲基化的试剂，和/或所述试剂盒还包括纯化dna的试剂，和/或所述试剂盒还包括pcr反应试剂，和/或所述试剂盒还包含处理样品的试剂；优选地，所述检测dna甲基化的试剂包括：亚硫酸氢盐、酸式亚硫酸盐或焦亚硫酸盐或其任意组合，和/或与目标dna序列或其经转化的序列杂交的引物分子，和/或
与目标dna序列或其经转化的序列杂交的探针分子；更优选地，所述试剂盒还包括检测dna甲基化的其他试剂，所述其他试剂是选自以下方法的一个或多个中所用的试剂：基于重亚硫酸盐转化的pcr、dna测序、甲基化敏感的限制性内切酶分析法、荧光定量法、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法、基于芯片的甲基化图谱分析、质谱，和/或所述样品是细胞含量少的样品，其中的细胞数为至多100万个细胞/40ml，和/或所述样品源自或是动物的尿液，所述动物优选是人。7.一种从细胞含量少的样品中制备含细胞dna的试剂的方法，包括用权利要求1-4中任一项所述的细胞裂解液处理所述样品的细胞的步骤，所述样品中的细胞数为为至多100万个细胞/40ml，优选地，所述样品源自或是动物的尿液，更优选地，所述动物是人。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：将样品固液分离，用权利要求1-4中任一项所述的细胞裂解液处理所得的固相，优选地，所述含细胞dna的试剂用于检测dna甲基化，和/或所述细胞是尿液脱落细胞，和/或细胞裂解液与样品中细胞的比例为大于或等于100ul细胞裂解液:100万个细胞。9.一种检测样品中的细胞的dna的方法，包括步骤：(1)用权利要求1-4中任一项所述的细胞裂解液处理所述样品中的细胞，获得含细胞dna的试剂，和(2)检测目标dna序列，所述样品中的细胞数为至多100万个细胞/40ml，优选地，步骤(1)是如权利要求7或8所述的方法。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述检测是检测dna的甲基化，优选地，步骤(2)为，采用选自以下的任一种方法检测目标dna序列的甲基化：基于重亚硫酸盐转化的pcr、dna测序、甲基化敏感的限制性内切酶分析法、荧光定量法、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法、基于芯片的甲基化图谱分析、质谱。

技术总结
本发明涉及快速检测尿液脱落细胞基因甲基化的试剂及方法，具体提供一种细胞裂解液，包括离子螯合剂、蛋白变性剂、缓冲液、盐以及表面活性剂。使用本文提供的细胞裂解液结合DNA甲基化检测可快速检测低细胞含量的样品中的细胞DNA甲基化状态，而无需单独提取DNA。而无需单独提取DNA。


技术研发人员：肖国伟 龚伟伟
受保护的技术使用者：上海长岛抗体诊断试剂有限公司
技术研发日：2023.05.17
技术公布日：2023/8/2