一种用于检测猪血凝性脑脊髓炎病毒的引物探针组、试剂盒及检测方法

1.本发明属于及生物检测领域，特别涉及一种用于检测猪血凝性脑脊髓炎病毒的引物探针组、试剂盒及检测方法。


背景技术：

2.猪血凝性脑脊髓炎是由猪血凝性脑脊髓炎病毒(phev，porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus)引起仔猪的一种急性、高度接触性传染病。phev是猪的神经和消化疾病的病原体，是首批被鉴定和分离出的猪冠状病毒之一，也是目前已知的唯一一种对猪产生影响的的嗜神经病毒。临床上主要感染3周龄以内的仔猪，表现为呕吐和划水样神经症状，病理学观察典型病变可见不同程度的脑膜出血、脑髓质有出血点，死亡率高达20-100％。因此，亟需建立针对猪血凝性脑脊髓炎病毒的检验检测方法。
3.目前，已报道的用于检测phev的方法有：免疫组织化学(ihc)试验方法、血凝/血凝抑制(ha/hi)试验方法、酶联免疫吸附试验快速免疫层析试条试验方法、包括病毒分离、病毒中和试验，以及能够从感染组织中检测特异性cov rna序列的分子工具，如巢式聚合酶链反应(nest pcr)、逆转录聚合酶链反应(rt-pcr)和lamp方法。其中，其中，在现有的恒温核酸体外扩增方法中，环介导基因恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，lamp)是一种相对比较成熟的新技术。lamp扩增方法的核心是使用链置换型dna聚合酶，当dna双链在65℃处于动平衡状态时，反应中的引物可通过类似于滚环复制的链替换反应，在同一条链上产生互补序列，周而复始形成大小不一的扩增产物。lamp扩增方法的特点是需使用4-6条引物，在一个蛋白的作用下，并在65℃的恒温条件下进行dna扩增反应。其反应灵敏度高于巢式pcr，并且特异性高。若使用荧光染料，还可以直接用肉眼观察到反应的扩增产物。但lamp扩增方法存在以下缺点：(1)lamp扩增方法使用的引物较复杂,必须用特殊的软件设计4-6个引物，设计难度大，易造成扩增产物引物二聚体过多的缺点；(2)lamp扩增方法易发生非特异性扩增，由于其同一反应中引物长度相对较短且数量相对较多，所以易造成引物的错配率增加，从而造成假阳性反应的缺点；(3)lamp扩增方法得到的扩增产物是一些大小不等的片段，无法直接克隆和测序，只能用于判定目的基因是否存在，这也是lamp方法最大的局限性；(4)因为引物数量较多，lamp扩增方法只能单纯扩增反应，不能进行双重扩增核酸鉴别诊断同一病原的不同基因型。进而限制了其大规模的推广应用。上述其他几种检测方法也费时费力，需要实验室程序或特殊设备，不适合现场检查，而且现有的检测策略也不能满足phev暴发后应急处理的需要，从而限制了其在兽医临床诊断中的应用。因此，建立一种灵敏、特异、简便的检测方法对快速检测和监测phev感染和传播至关重要。
4.重组酶聚合酶扩增技术(rpa，recombinase polymerase amplification)，是一种新的核酸分子快速恒温扩增技术，被称为是可以替代pcr的核酸检测技术，其工作原理主要包括：在37℃-42℃恒温下，该重组酶可与引物dna紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引
dna聚合酶、dntps、二硫苏糖醇、三磷酸腺苷、三甲基甘氨酸、聚乙二醇20000、肌酸激酶、磷酸激酶、醋酸钾、醋酸镁。
17.本发明的第三方面提供了一种猪血凝性脑脊髓炎病毒的检测方法，用于非诊断目的的，包括以下步骤：
18.s1、从待测样品中提取核酸；
19.s2、将待测样本中提取的核酸加入rpa反应体系中，进行rpa反应；
20.s3、使用恒温实时荧光扩增仪将步骤s2中所得扩增产物进行显示。
21.优选地，所述步骤s2中，rpa反应体系包括：100ng/μl重组酶uvsx、50ng/μl辅助蛋白uvsy、100ng/μlgp 32蛋白、25ng/μl bsu dna聚合酶；0.5mm dntps、1mm二硫苏糖醇、3mm三磷酸腺苷、100mm三甲基甘氨酸、5％聚乙二醇20000、100ng/μl肌酸激酶、20mm磷酸激酶、80mm醋酸钾、50pm phev1brpaf123a、50pm phevns2rpar123c、10pm phevpg123、10units nfo酶、100mmol/l醋酸镁；
22.所述反应程序为：39℃，扩增15-30min。
23.与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：
24.本发明以phev orf1b、ns2保守序列设计rpa引物和探针，再以合成重组质粒pet28b-ms2-phev为模板，成功建立了phev的rt-rpa方法。相较于传统rt-pcr方法，本发明检测方法不仅节省了时间成本、简化了操作、更为高效，而且表现出良好的敏感性和特异性，最低可达到检测3.44
×
101拷贝的pet28b-ms2-phev质粒。
25.本发明通过将rpa扩增与荧光探针检测技术相结合使检测结果可直接实时判读，从而实现猪血凝性脑脊髓炎病毒的分子检测现场化、快速化，省去了原有的pcr或lamp扩增产物需要经过凝胶电泳后进行结果的判定的过程，因此在兽医基础检测方向具有良好的应用前景，对于保障养猪业的健康发展及食品安全具有重要意义。
附图说明
26.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
27.图1为phev的rt-rpa检测方法引物探针组筛选结果图；
28.图2为rt-rpa检测pet28b-ms2-phev敏感性试验结果图；
29.图3为rt-pcr检测pet28b-ms2-phev敏感性试验结果图；
30.图4为rt-rpa检测pet28b-ms2-phev特异性试验结果图；
31.图5为rt-pcr检测pet28b-ms2-phev特异性试验结果图。
具体实施方式
32.以下描述中，为了说明而不是为了限定，提出了诸如特定系统结构、技术之类的具体细节，以便透彻理解本发明实施例。然而，本领域的技术人员应当清楚，在没有这些具体细节的其它实施例中也可以实现本发明。
33.实施例1
34.1、实验材料和方法
35.1.1实验材料
36.phev rna来源于本实验室现有phev假病毒质控品；101份血清，于2021年6月7日-9日采自于辽宁省鞍山市、营口市和盖山市疑似发病猪场；参考毒株，为商品化疫苗株：伪狂犬病活疫苗，购自哈尔滨元亨生物药业有限公司；传染性胃肠炎、流行性腹泻和轮状病毒三联苗，购自上海海利生物技术股份有限公司；猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗和猪瘟活疫苗，购自北京华夏兴洋生物科技有限公司。
37.反转录试剂盒，购自成都福际生物技术有限公司；2
×
san taq master mix、dm2000 dna marker和病毒基因组dna/rna提取试剂盒，购自苏州海狸生物医学工程有限公司；raa核酸扩增检测试剂盒，购自杭州众测生物科技有限公司；引物及探针由上海生工公司程合成。
38.1.2实验方法
39.1.2.1设计引物和探针：
40.具体步骤：本发明实施例中的引物和探针选自以猪血凝性脑脊髓炎病毒(phev)特征片段，且所述引物和探针均为根据phev特性设计。收集genbank数据库中可用的主要phev毒株的完整基因组(mf083115.1、ky994645.1、ky419113.1、ky419112.1、ky419110.1、ky419109.1、ky419107.1、ky419106.1、ky419105.1、ky419104.1、ky419103.1、ab362589.1、mw165134.1、dq011855.1、nc_007732.1、eu919227、dq011855.1、ay078417.1、af481863.1)序列blast分析，选取orf1b、ns2保守区为靶序列设计引物和探针，具体引物和探针信息见下表1。筛选最佳引物对，设计引物的长度范围为
41.表1.phev rt-rpa引物和探针信息
[0042][0043]
1.2.2病毒核酸的提取：
[0044]
根据病毒dna/rna提取试剂盒的说明书，使用生理盐水分别稀释phev假病毒样品、传染性胃肠炎、轮状病毒三联苗、流行性腹泻、伪狂犬活疫苗、猪繁殖与呼吸综合征活疫苗和猪瘟活疫苗，并取200μl用于提取rna/dna作为特异检测对照。
[0045]
1.2.3合成病毒cdna：
[0046]
将提取的病毒rna按照2
×
rt or-easytm mix说明书进行反转录制备病毒(第一链)cdna，构建重组质粒pet28b-ms2-phev，具体反转录反应体系(10μl)和反应程序见下表2：
[0047]
表2.第一链cdna合成的反应体系和反应程序
[0048][0049]
1.2.4建立phev的荧光rt-rpa检测方法
[0050]
(i)具体步骤：以合成的重组质粒pet28b-ms2-phev为模板，phev假病毒cdna为阳性对照，建立rt-rpa检测体系，包含：abuffer 25μl、上游引物、下游引物(终浓度为250μl)2.0μl、探针0.6μl、模板5μl、b buffer 2.5μl，加水补齐50μl，将所有预混液加入冻干粉中，混匀后加入到200μl八连管中，最后用gene-8c恒温荧光检测仪器观察结果，反应条件为39，℃30min。
[0051]
(ii)phev的荧光rt-rpa检测方法的敏感性评价
[0052]
将质粒pet28b-ms2-phev连续十倍梯度稀释后，作为模板，按照(i)方法步骤进行敏感性检测，同时参考普通rt-pcr方法进行对比分析，具体引物信息及反应程序见下表3-4。
[0053]
(iii)phev的荧光rt-rpa检测方法的特异性评价
[0054]
将从猪繁殖与呼吸综合征活疫苗、猪瘟活疫苗、传染性胃肠炎、流行性腹泻、轮状病毒三联苗、伪狂犬活疫苗中提取的rna/dna作为模板，按照(i)方法步骤进行特异性的评估，同时参考普通rt-pcr方法进行对比分析，具体引物信息及反应程序见表3-4。
[0055]
表3.rt-pcr引物信息
[0056][0057]
表4.rt-pcr反应体系和反应程序
[0058][0059]
1.2.5临床样品的处理及检测
[0060]
s1、临床样品的处理及病毒rna的提取
[0061]
将临床血清样品送到实验室后，短暂离心，收集200μl临床血清样品用于核酸的提
取和检测。按照苏州海狸磁珠法病毒dna/rna提取试剂盒说明书，分别取200μl血清样品、200μl异丙醇、400μl裂解液、40μl蛋白酶k、20μl磁珠混匀于1.5ml离心管中，55℃水浴15min，期间颠倒混匀三次，随后将离心管放在磁力架上，待磁珠完全吸附在离心管一测后，吸弃上清液，加入600μl洗涤液ⅰ(包括：1～5m guhcl/guscn、0.1～2m nacl、0.05～5％吐温-20、异丙醇30～60％)混匀磁珠洗涤后，弃去上清液，再加入洗涤液ⅱ(包括：0.01～0.5m三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐和0.001～0.1m乙二胺四乙酸，3～4倍体积乙醇)洗涤两次后，保持离心管在磁力架上室温晾干2min，直至磁珠表面失去金属光泽后，加入50μl无酶rna洗脱液反复吹吸50次，再于55℃水浴5min后放在磁力架上，收集上清液即为提取的病毒rna，于-80℃保存。
[0062]
s2、对步骤s1中所提取的核酸进行(重组酶聚合酶)rpa扩增：
[0063]
将2μl步骤s1所提取的核酸样本加入0.2ml离心管中，再加入45.5μl rpa扩增反应液、100ng/μl重组酶uvsx、50ng/μl辅助蛋白uvsy、100ng/μlgp 32蛋白、25ng/μl bsu dna聚合酶、0.5mm dntps、1mm二硫苏糖醇、3mm三磷酸腺苷、100mm三甲基甘氨酸(ph 8.0)、5％聚乙二醇20000、100ng/μl肌酸激酶、20mm磷酸激酶、80mm醋酸钾；
[0064]
其中，上述rpa扩增反应液中包含有特定核酸扩增与检测用的标记引物与标记探针，具体成份包括50pm phev1brpaf123a、50pm phevns2rpar123c、10pm phevpg123、10units nfo酶；
[0065]
s3、使用恒温实时荧光扩增仪对步骤s2中所得rpa扩增产物进行显示：
[0066]
将上述反应液混合均匀后，再加入2.5μl的100mmol/l醋酸镁，混匀后、置于39℃的恒温实时荧光扩增仪中温浴30min,获得的扩增反应产物作为待检rpa扩增样品，并实时显示结果。
[0067]
2、敏感性试验
[0068]
将拷贝数为3.44
×
107copies/μl的重组质粒pet28b-ms2-phev作为原始浓度，连续十倍稀释后作为模板，分别进行rt-rpa和rt-pcr敏感性检测。敏感性试验结果见图2和图3。
[0069]
由图2结果可知，该检测方法最低可检测3.44
×
101copies/μl的pet28b-ms2-phev，最早起峰检出时间在第6min开始，在15min(左右)达到峰值(注：拷贝数计算公式：浓度(ng/μl)
×
10-9
/mw(g/mol)
×
10
23
copies/μl)。
[0070]
由图3结果可知，常规rt-pcr敏感性检测，可检测到3.44
×
102拷贝的phev rna(注：1-7分别表示3.44
×
10
6-3.44
×
100copies/μl拷贝pet28b-ms2-phev质粒，8表示水对照)。
[0071]
3、特异性试验
[0072]
rt-rpa和rt-pcr特异性检测试验结果见图4和图5。
[0073]
由图4结果可知，除了以重组质粒pet28b-ms2-phev和假病毒阳性对照为模板有明显起峰，其余病毒(例如，猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪血凝性脑脊髓炎病、猪瘟活病毒、传染性胃肠炎、流行性腹泻、轮状病毒)均无任何交叉反应，表明本发明检测方法具有良好的特异性。由图5结果可知，常规rt-pcr特异性检测，可检测到重组质粒pet28b-ms2-phev和假病毒阳性对照(注：1表示phev；2表示prrsv；3表示pedv、tgev、hrv三联苗；4表示prv；5表示csfv；6表示阴性对照；7表示阳性对照)。
[0074]
4、临床样品的rt-rpa与rt-pcr检测的一致性评价
[0075]
分别使用rt-rpa和rt-pcr两种方法对phev同步检测，结果见下表5。
[0076]
表5临床猪血清样品中phev的检测结果
[0077][0078]
注：0.0≤(κ)≤0.2表示一致性极低；0.2＜(κ)≤0.4表示一致性一般；0.4＜(κ)≤0.6表示中等一致性；0.6＜(κ)≤0.8表示高度一致性；0.8＜(κ)≤1.0表示完全一致。
[0079]
由表5结果可知，仅有一例样品检出phev阳性，阳性检出率为0.99％(1/101)，阴性检出率为99.01％(100/101)。“kappa”(κ)分析结果显示(κ)＝1，结果证明rt-rpa检测方法具有与rt-pcr检测方法完全一致的适用性。
[0080]
本发明根据twist amo tm exo kit(twist dx cambridge，uk)说明书及原理在orf1b、ns2保守区为靶序列成功设计了一对rpa引物和探针并建立了phev rt-rpa检测方法。在本发明中，完成一次rt-rpa实验的时间大约是30min，而每次rt-pcr的时间在60min以上，且本发明rt-rpa方法省去了rt-pcr方法所需的温度高低循环，且扩增结果可视化，省去了复杂的凝胶电泳步骤。相较于传统rt-pcr方法，本发明rt-rpa方法不仅节省了时间成本，简化了操作，同时还表现出良好的敏感性和特异性，最低可达到检测3.44
×
101拷贝的pet28b-ms2-phev质粒。
[0081]
在本发明实施例中的临床检测部分，共检测了盖山市猪血清样品21份、营口市猪血清样品25份和鞍山市猪血清样品55份，一份阳性病料来源于鞍山市某猪场，阳性检出率为0.99％(1/101)，阴性检出率为99.01％(100/101)，这说明鞍山市的猪场中确实存在phev污染，消费者有较低可能性接触到污染的phev。临床的检测在rt-pcr和rt-rpa两种检测下同时进行，发现样品的临床阳性检出率相较文献报道偏低。考虑到phev的流行病学特征，出生仔猪受到母源抗体的保护，产生了与年龄相关的抵抗力因素有关。
[0082]
在本发明实施例中的实验设计方面，本发明设计了三对rt-rpa的引物和探针，用阳性质粒分别检测后，发现其中一组引物没有起峰，另一对引物特异性不强，与三联苗有交叉反应，只有一对引物探针敏感性强，特异型好，可用于检测。
[0083]
综上，本发明以phev orf1b、ns2保守序列设计rpa引物和探针，以合成重组质粒pet28b-ms2-phev为模板，某养殖场仔猪作为研究对象，成功建立了phev的荧光rt-rpa检测方法，该检测方法实现了phev的快速灵敏、准确检测，解决了现有phev检测方法存在的以下问题：
[0084]
(1)特异性低：根据碱基互补的原则可知，引物越长则特异性越高。相较于传统的
pcr和lamp方法，本发明rpa反应只使用一对针对猪血凝性脑脊髓炎病核酸的特异性长引物且引物的长度比现有方法中使用的引物长度长十个碱基左右，从而能够大幅提高恒温核酸扩增反应(检测结果)的特异性和可靠性。
[0085]
(2)无法实现猪血凝性脑脊髓炎病毒的现场快速分子检测：本发明采用rpa方法，因其为恒温条件下扩增核酸的方法，因此不需要pcr仪，解决了pcr贵重成本高的缺点；rpa扩增反应时间在20分钟左右即可完成，与pcr方法相比节约了大量时间；
[0086]
(3)无法实现猪血凝性脑脊髓炎病毒的分子检测现场化、快速化：本发明省去了原有的pcr或lamp扩增产物需要经过凝胶电泳后进行结果的判定的过程，通过将rpa扩增与荧光探针检测技术相结合使检测结果可直接实时显示扩增orf1b、ns2基因片段的检测结果并进行判读，从而实现猪血凝性脑脊髓炎病毒的分子检测现场化、快速化。
[0087]
另外，由于本发明rpa方法能够在15-20分钟内进行常温下的单分子核酸检测，且对硬件装备的要求不高，因此特别适合用于食品安全、兽医、生物防御、农业等领域的现场快速检测和诊断。一般来讲，传统常规pcr必须经过变性、退火、延伸三个步骤实现核酸扩增过程，pcr仪本质上就是一个控制温度升降的设备。而本发明rpa反应的最适温度在37℃-42℃之间，无需变性，在常温下即可进行，能够大大加快扩增的速度，进而实现快速检测。由于本发明rpa方法不需要温控设备，本发明rpa方法可以真正实现便携式的快速核酸检测，本发明rpa方法检测的灵敏度很高，能够将痕量的核酸(尤其是dna)模板扩增到可以检出的水平，从单个模板分子得到大约10
12
扩增产物，本发明rpa方法不需要复杂的样品处理，因此本发明适用于无法提取核酸的实地检测。为后续建立针对性的监测和高效防控措施提供了技术支撑，对于保障养猪业的健康发展及猪肉的食品安全具有重要意义。
[0088]
本发明不局限于上述具体的实施方式，本领域的普通技术人员从上述构思出发，不经过创造性的劳动，所做出的种种变换，均落在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种用于检测猪血凝性脑脊髓炎病毒的引物探针组，其特征在于，包括：针对猪血凝性脑脊髓炎病毒orf1b、ns2基因的第一方向引物phev1brpaf123a、针对猪血凝性脑脊髓炎病毒orf1b、ns2基因的中间探针phevpg123、以及针对猪血凝性脑脊髓炎病毒orf1b、ns2基因的第二方向引物phevns2rpar123c，其中，所述针对猪血凝性脑脊髓炎病毒orf1b、ns2基因的第一方向引物phev1brpaf123a的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述针对猪血凝性脑脊髓炎病毒orf1b、ns2基因的第二方向引物的phevns2rpar123c的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述针对猪血凝性脑脊髓炎病毒orf1b、ns2基因的中间探针phevpg123的核苷酸序列如seq id no.3所示。2.根据权利要求1所述的用于检测猪血凝性脑脊髓炎病毒的引物探针组，其特征在于，所述针对猪血凝性脑脊髓炎病毒orf1b、ns2基因的第一方向引物phev1brpaf123a与中间探针phevpg123针对猪血凝性脑脊髓炎病毒orf1b、ns2基因的同一个方向，且针对猪血凝性脑脊髓炎病毒orf1b、ns2基因的中间探针phevpg123位于针对猪血凝性脑脊髓炎病毒orf1b、ns2基因的第一方向引物phev1brpaf123a与针对猪血凝性脑脊髓炎病毒orf1b、ns2基因的第二方向引物phevns2rpar123c之间。3.根据权利要求1或2所述的用于检测猪血凝性脑脊髓炎病毒的引物探针组，其特征在于，所述针对猪血凝性脑脊髓炎病毒orf1b、ns2基因的中间探针phevpg123的中游连接有第一标记分子和第二标记分子、中间包含能够被具有dna损伤修复活性的酶识别并切除的人工碱基类似物以及下游连接有防止聚合反应的保护标签。4.根据权利要求3所述的用于检测猪血凝性脑脊髓炎病毒的引物探针组，其特征在于，所述第一标记分子为荧光分子fam，所述第二标记分子为bhq1，所述保护标签为c3-spacer，所述被具有dna损伤修复活性的酶识别并切除的人工碱基类似物为四氢呋喃。5.一种用于检测猪血凝性脑脊髓炎病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至4任一项所述的用于检测猪血凝性脑脊髓炎病毒的引物探针组。6.根据权利要求5所述的用于检测猪血凝性脑脊髓炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括nfo酶、重组酶uvsx、辅助蛋白uvsy、gp 32蛋白、bsu dna聚合酶、dntps、二硫苏糖醇、三磷酸腺苷、三甲基甘氨酸、聚乙二醇20000、肌酸激酶、磷酸激酶、醋酸钾、醋酸镁。7.一种猪血凝性脑脊髓炎病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、从待测样品中提取核酸；s2、将待测样本中提取的核酸加入rpa反应体系中，进行rpa反应；s3、用恒温实时荧光扩增仪将步骤s2中所得扩增产物进行显示。8.根据权利要求7所述的猪血凝性脑脊髓炎病毒的检测方法，其特征在于，所述步骤s2中，rpa反应体系包括：100ng/μl重组酶uvsx、50ng/μl辅助蛋白uvsy、100ng/μlgp 32蛋白、25ng/μl bsu dna聚合酶；0.5mm dntps、1mm二硫苏糖醇、3mm三磷酸腺苷、100mm三甲基甘氨酸、5％聚乙二醇20000、100ng/μl肌酸激酶、20mm磷酸激酶、80mm醋酸钾、50pm phev1brpaf123a、50pm phevns2rpar123c、10pm phevpg123、10units nfo酶、100mmol/l醋酸镁；反应程序为：39，℃扩增15-30min。

技术总结
本发明公开了一种用于检测猪血凝性脑脊髓炎病毒的引物探针组、试剂盒及检测方法，包括：针对猪血凝性脑脊髓炎病毒ORF1b、NS2基因的第一方向引物PHEV1bRPAF123a，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；针对猪血凝性脑脊髓炎病毒ORF1b、NS2基因的中间探针PHEVPG123，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；以及针对猪血凝性脑脊髓炎病毒ORF1b、NS2基因的第二方向引物PHEVNS2RPAR123c，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明成功建立了PHEV的RT-RPA检测方法。与传统RT-PCR相比，本发明方法在39℃条件下30min即可完成检测，且敏感性、特异性良好，同时能够实现对猪血凝性脑脊髓炎病毒的分子检测现场化、快速化。因此在兽医基础检测方向具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。


技术研发人员：高慎阳 李鸿彬 孙弋雅 董筱萍 周铁忠 周大勇
受保护的技术使用者：锦州医科大学
技术研发日：2023.05.17
技术公布日：2023/8/2