一种肠膜明串珠菌及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种肠膜明串珠菌及其应用，更具体的，涉及一种可产胞外多糖的肠膜明串珠菌及其应用。


背景技术：

2.微生物胞外多糖是指某些特定微生物(如乳酸菌、土壤杆菌、根瘤菌等)在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的一类糖类化合物，其中，依附于微生物细胞壁外的多糖被称为荚膜多糖，而粘液多糖则以渗透于生长环境中的形式存在。
3.微生物胞外多糖不但可以赋予发酵制品特殊的风味，还具有一定的降血脂、免疫调节和抗肿瘤等保健功能。更重要的是，随着生活质量的不断提高，与我们每个人日常生活息息相关的一些食品添加剂(如增稠剂、乳化剂、稳定剂等)的食品安全问题越来越受到消费者的重视，因此，寻找来源明确、产量稳定、功能多样的新型食品添加剂越来越受到研究者的重视。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种可以高产胞外多糖的菌株。
5.为此，本发明提供了一种肠膜明串珠菌，所述肠膜明串珠菌命名为肠膜明串珠菌fy01，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m2022541，保藏日期为2022年5月3日。
6.上述肠膜明串珠菌fy01可以发酵生产胞外多糖。
7.本发明还提供了一种富含胞外多糖的发酵饮品的制备方法，包括以下步骤：
8.(1)制备上述肠膜明串珠菌fy01的种子液，将种子液接种至培养基中培养，培养结束后将菌液离心去上清，使用无菌水清洗后重悬得重悬菌液，备用；
9.(2)对鲜果进行预处理，得到果汁混合物；
10.(3)向果汁混合物中加入步骤(1)制备的重悬菌液，搅拌均匀，静置发酵，得到发酵饮品。
11.具体的，上述步骤(1)中重悬菌液的菌密度≥107cfu/ml。
12.具体的，上述步骤(2)中预处理方法具体为：将鲜果清洗破碎，匀浆处理，加入清水混匀后，添加复合酶制剂进行酶解，向酶解后的混合物中添加糖和氮源，调整糖度，随后杀菌、灭酶活得到果汁混合物。
13.具体的，上述步骤(2)中复合酶制剂包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和酸性蛋白酶；以质量百分比计，纤维素酶添加量为0.1％-0.5％，半纤维素酶的添加量为0.1％-0.5％，果胶酶的添加量为0.12％-0.18％，酸性蛋白酶的添加量为0.1％-0.5％。
14.具体的，上述步骤(2)中糖包括蔗糖、乳糖、葡萄糖中的一种或多种；氮源包括大豆肽粉，乳清蛋白粉、玉米低聚肽中的一种或多种。
15.具体的，上述步骤(2)中调整糖度至14％-20％；以质量百分比计，氮源添加量为
0.4％-0.6％。
16.具体的，按体积比计，上述步骤(3)中重悬菌液的添加量为2％-8％。
17.具体的，上述步骤(3)中发酵条件为25-32℃条件下发酵4-7天，每隔10h搅拌一次。
18.本发明提供的这种肠膜明串珠菌筛选自野生蓝莓，具有较高的产胞外多糖能力，能在果汁发酵过程中产生胞外多糖，使发酵的果汁具有抗氧化、抗肿瘤的作用，为开发新型功能性饮品提供新的思路，是一株可应用到实际生产的具有潜在经济效益的菌株。
具体实施方式
19.下面将结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。尽管已经详细描述了本发明的代表性实施例，但是本发明所属技术领域的普通技术人员将理解，在不脱离本发明范围的情况下可以对本发明进行各种修改和改变。因此，本发明的范围不应局限于实施方案，而应由所附权利要求及其等同物来限定。
20.本发明提供了一种肠膜明串珠菌，菌体呈豆形，革兰氏染色为阳性，无芽孢；在固体培养基平板上的菌落呈乳白色，边缘清晰，不透明。将该菌株进行16srrna基因测序，其序列如seq id no.1所示。获得的序列进行同源序列检索，结果显示与leuconostoc mesenteroides等的序列同源性超过99％，综合该菌株的形态、菌落形态特征观察、分子生物学测序结果，最终确定该菌为肠膜明串珠菌，命名为肠膜明串珠菌fy01(leuconostoc mesemterpodes fy01)，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2022541，保藏日期为2022年5月3日，保藏地点为中国武汉。
21.seq id no.1：
22.ggaatgtgcggcgtgctatactgcagtcgaacgcacagcgaaaggtgcttgcacctttcaagtgagtggcgaacgggtgagtaacacgtggacaacctgcctcaaggctggggataacatttggaaacagatgctaataccgaataaaacttagtgtcgcatgacacaaagttaaaaggcgcttcggcgtcacctagagatggatccgcggtgcattagttagttggtggggtaaaggcctaccaagacaatgatgcatagccgagttgagagactgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggctgcagtagggaatcttccacaatgggcgaaagcctgatggagcaacgccgcgtgtgtgatgaaggctttcgggtcgtaaagcactgttgtatgggaagaacagctagaataggaaatgattttagtttgacggtaccataccagaaagggacggctaaatacgtgccagcagccgcggtaatacgtatgtcccgagcgttatccggatttattgggcgtaaagcgagcgcagacggtttattaagtctgatgtgaaagcccggagctcaactccggaatggcattggaaactggttaacttgagtgcagtagaggtaagtggaactccatgtgtagcggtggaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggcttactggactgcaactgacgttgaggctcgaaagtgtgggtagcaaacaggattagataccctggtagtccacaccgtaaacgatgaacactaggtgttaggaggtttccgcctcttagtgccgaagctaacgcattaagtgttccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacggggacccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctttgaagcttttagagatagaagtgttctcttcggagacaaagtgacaggtggtgcatggtcgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttattgttagttgccagcattcagatgggcactctagcgagactgccggtgacaaaccggaggaaggcggggacgacgtcagatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggcgtatacaacgagttgccaacccgcgagggtgagctaatctcttaaagtacgtctcagttcggattgtagtctgcaactcgactacatgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccg
tcacaccatgggagtttgtaatgcccaaagccggtggcctaacctttaggaaggagcc
23.本发明还提供了一种富含胞外多糖的发酵饮品的制备方法，包括以下步骤：
24.(1)将上述肠膜明串珠菌fy01进行活化处理，得到种子液，将种子液接种至培养基中，优选番茄汁肉汤培养基，培养12-15h，而后再次转接至新鲜培养基继续培养20-30h。将菌液离心去除上清，无菌水清洗后，用无菌水重悬，使菌密度达到≥107cfu/ml。具体的，上述两次接种的接种量均在4％-8％之间。
25.(2)将冷藏的鲜果，例如欧洲越橘鲜果，清洗破碎，匀浆处理。按照1：0.5-1的比例加入清水，混匀。然后以质量百分比计，加入0.1％-0.5％的纤维素酶，0.1％-0.5％的半纤维素酶，0.12％-0.18％的果胶酶，0.1％-0.5％的酸性蛋白酶。调节混合液ph值至4.2，置于50-60℃水浴中酶解4h。向酶解后的混合物中添加糖和氮源。糖可为蔗糖、乳糖、葡萄糖等中的一种或多种，氮源可为大豆肽粉，乳清蛋白粉、玉米低聚肽等中的一种或多种。在室温条件下使用手持糖度仪进行糖度测定，调整糖度至14％-20％；氮源添加质量百分比为0.4％-0.6％。随后杀菌、灭酶活。具体的，采用巴氏杀菌的方式对越橘汁混合物进行杀菌，85℃杀菌20min后，置于冰水中冷却，得到果汁混合物。
26.(3)按体积比计，向步骤(2)的果汁混合物中加入2％-8％的步骤(1)制备的重悬菌液，搅拌均匀，25-32℃条件下静置发酵4-7天，每隔10h搅拌一次，得到发酵饮品。
27.下面通过具体实施例对本发明的肠膜明串珠菌fy01及其应用的效果进行研究。
28.实施例1：
29.本实施例提供了一种肠膜明串珠菌fy01，通过以下步骤获取。
30.将自然放置3-4周的野生蓝莓样品连同表皮一起破碎匀浆，接种至番茄汁肉汤培养基中富集培养，所述番茄汁肉汤培养基配方为：番茄浸粉2.5g/l，牛肉浸粉10.0g/l，酵母浸粉5.0g/l，醋酸钠5.0g/l，葡萄糖2.0g/l，蔗糖15g/l，乳糖15g/l，磷酸氢二钾2g/l，吐温80 1g/l。富集培养24h后取其发酵液，用无菌生理盐水按10的倍数逐级稀释，将各级稀释液分别涂布于固体番茄汁肉汤培养基中，36℃培养箱倒置培养48h，筛选产粘稠状菌苔单菌落在固体番茄汁肉汤培养基上反复划线分离纯化多次，得纯菌株，4℃保存。
31.将筛选分离的多株菌株进行液体发酵，获得发酵液上清液，通过采用苯酚硫酸法测定筛选菌株发酵产生胞外多糖能力和生长能力，筛选出一株产胞外多糖能力较高的优势菌株，将其命名为fy01。
32.菌株的生理生化试验鉴定：对菌株fy01进行初步的生理生化鉴定，包括菌落形态检测和革兰氏染色，结果显示菌株在培养基表面会形成粘稠状菌苔，菌落边缘整齐、乳白色、有光泽、不透明；显微镜观察菌体细胞为成对或链状的豆形菌，革兰氏染色阳性，不形成荚膜。
33.提取dna并进行16s rrna基因测序，其序列如seq id no.1所示。将此序列在ncbi进行blast-n比对分析，结果表明，与其最相近的是leuconostoc mesemterpodes，同源性超过99％。因此，该菌株是肠膜明串珠菌属的菌株，将其命名为肠膜明串珠菌fy01。
34.seq id no.1：
35.ggaatgtgcggcgtgctatactgcagtcgaacgcacagcgaaaggtgcttgcacctttcaagtgagtggcgaacgggtgagtaacacgtggacaacctgcctcaaggctggggataacatttggaaacagatgctaataccgaataaaacttagtgtcgcatgacacaaagttaaaaggcgcttcggcgtcacctagagatggatccgcggtgcattagttag
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36.实施例2：
37.本实施例提供了一种欧洲越橘发酵果汁，通过以下步骤制备：
38.(1)将实施例1筛选的肠膜明串珠菌fy01进行活化处理，得到种子液，以6％的接种量将种子液接种至番茄汁肉汤培养基，培养12h，而后再次以6％的接种量转接至新鲜培养基继续培养24h。将菌液离心去除上清，无菌水清洗后，用无菌水重悬，使菌密度达到≥107cfu/ml。
39.(2)将冷藏的欧洲越橘鲜果清洗破碎，匀浆处理。按照1：0.5的比例加入清水，混匀。然后以质量百分比计，加入0.3％的纤维素酶，0.2％的半纤维素酶，0.12％的果胶酶，0.3％的酸性蛋白酶。调节混合液ph值至4.2，置于50℃水浴中酶解4h。向酶解后的混合物中添加蔗糖和大豆肽粉。在室温条件下使用手持糖度仪进行糖度测定，调整糖度至18％；大豆肽粉添加质量百分比为0.4％。随后采用巴氏杀菌的方式对越橘汁混合物进行杀菌，85℃杀菌20min后，置于冰水中冷却。
40.(3)按体积比计，向步骤(2)的越橘汁混合物中加入5％的步骤(1)制备的重悬菌液，搅拌均匀，28℃条件下静置发酵6天，每隔10h搅拌一次，得到欧洲越橘发酵果汁。
41.实施例3：
42.本实施例提供了一种欧洲越橘发酵果汁，通过以下步骤制备：
43.(1)将实施例1筛选的肠膜明串珠菌fy01进行活化处理，得到种子液，以8％的接种量将种子液接种至番茄汁肉汤培养基，培养15h，而后再次以8％的接种量转接至新鲜培养基继续培养20h。将菌液离心去除上清，无菌水清洗后，用无菌水重悬，使菌密度达到≥107cfu/ml。
44.(2)将冷藏的欧洲越橘鲜果清洗破碎，匀浆处理。按照1：0.8的比例加入清水，混匀。然后以质量百分比计，加入0.4％的纤维素酶，0.3％的半纤维素酶，0.16％的果胶酶，0.4％的酸性蛋白酶。调节混合液ph值至4.2，置于50℃水浴中酶解4h。向酶解后的混合物中
添加蔗糖和乳清蛋白粉。在室温条件下使用手持糖度仪进行糖度测定，调整糖度至14％；乳清蛋白粉添加质量百分比为0.6％。随后采用巴氏杀菌的方式对越橘汁混合物进行杀菌，85℃杀菌20min后，置于冰水中冷却。
45.(3)按体积比计，向步骤(2)的越橘汁混合物中加入5％的步骤(1)制备的重悬菌液，搅拌均匀，28℃条件下静置发酵6天，每隔10h搅拌一次，得到欧洲越橘发酵果汁。
46.比较例1：
47.本比较例提供了一种欧洲越橘发酵果汁，通过以下步骤制备：
48.(1)以6％的接种量将市场购买的常用果汁发酵菌接种至番茄汁肉汤培养基培养12h，而后以6％的接种量转接至新鲜培养基继续培养24h。将菌液离心去除上清，无菌水清洗后，用无菌水重悬，使菌密度达到≥107cfu/ml。
49.(2)将冷藏的欧洲越橘鲜果清洗破碎，匀浆处理。按照1：0.5的比例加入清水，混匀。然后以质量百分比计，加入0.3％的纤维素酶，0.2％的半纤维素酶，0.12％的果胶酶，0.3％的酸性蛋白酶。调节混合液ph值至4.2，置于50℃水浴中酶解4h。向酶解后的混合物中添加蔗糖和大豆肽粉。在室温条件下使用手持糖度仪进行糖度测定，调整糖度至18％；大豆肽粉添加质量百分比为0.4％。随后采用巴氏杀菌的方式对越橘汁混合物进行杀菌，85℃杀菌20min后，置于冰水中冷却。
50.(3)向上一步的越橘果汁混合物中，按体积比为5％的比例直接接入步骤(1)中的重悬菌液，搅拌均匀。28℃条件下发酵6天，每隔10h搅拌一次，得到欧洲越橘发酵果汁。
51.比较例2：
52.本比较例提供了一种欧洲越橘发酵果汁，通过以下步骤制备：
53.(1)将冷藏的欧洲越橘鲜果清洗破碎，匀浆处理。按照1：0.5的比例加入清水，混匀。然后以质量百分比计，加入0.3％的纤维素酶，0.2％的半纤维素酶，0.12％的果胶酶，0.3％的酸性蛋白酶。调节混合液ph值至4.2，置于50℃水浴中酶解4h。向酶解后的混合物中添加蔗糖和大豆肽粉。在室温条件下使用手持糖度仪进行糖度测定，调整糖度至18％；大豆肽粉添加质量百分比为0.4％。随后杀菌、灭酶活：采用巴氏杀菌的方式对越橘汁混合物进行杀菌，85℃杀菌20min后，置于冰水中冷却。
54.(2)向上一步的越橘果汁混合物中，按体积比为5％的比例直接接入灭菌清水，搅拌均匀。静置发酵：28℃条件下发酵6天，每隔10h搅拌一次，得到欧洲越橘发酵果汁。
55.实施例4：
56.本实施例对实施例2-3和比较例1-2提供的欧洲越橘发酵果汁品质进行了检测，具体如下。
57.1、胞外多糖含量测定
58.以葡萄糖为标准品，配置成1mg/ml的葡萄糖标准溶液，按比例梯度稀释一定倍数，采用苯酚-硫酸法测定吸光度，得到葡萄糖标准曲线。将发酵好的越橘果汁离心取上清，按照1:9的比例加入无水乙醇，匀混后4℃静置过夜，离心去除上清液，用80％乙醇洗涤2-3次，然后用去离子水溶解，测定胞外多糖含量，各组测定结果如表1所示。
59.表1发酵果汁中胞外多糖含量
[0060][0061]
由表1可知，采用本发明提供的肠膜明串珠菌fy01具有较高的产胞外多糖能力，能在果汁发酵过程中产生胞外多糖。
[0062]
2、抗氧化分析
[0063]
dpph自由基清除能力检测方法为：在比色管中依次加入1ml发酵果汁和2ml 80％的dpph乙醇水溶液(2
×
104mol/l)，充分振荡混匀后，用1cm比色皿在517nm波长处测吸光值，放置于黑暗处反应半小时，待反应结束后立刻在波长下测定其od值，为试验组，记a1；将2mldpph溶液和1ml80％乙醇溶液各混匀后，相同条件下测其吸光度，为空白组，记为a0；将1ml发酵果汁和2ml80％乙醇溶液混匀后，相同条件下测其吸光度，为对照组，记为a2。每组试验做三次重复取平均值。dpph自由基清除率用如下公式进行计算：dpph
·
自由基清除率(％)＝[1-(a
1-a2)/a0]
×
100。
[0064]
超氧阴离子自由基清除能力检测方法为：分别量取1ml发酵果汁和对照品溶液于刻度试管中，接着再加入0.5mlph为7.8的磷酸缓冲液(0.5mol/l)，再加1.5ml的甲硫氨酸试剂(0.13mol/l)，然后加0.3ml的nbt溶液(0.75mmol/l)，最后在加入0.3ml的核黄素(0.02mmol/l)，使其充分混匀后，置于35℃、4000lx光照下进行25min反应。反应完毕后，在黑暗处以终止反应，待反应结束后立刻在560nm波长下测定其od值，以蒸馏水为空白对照，记录各个试验品的od值。每组试验做三次重复取平均值并详细记录。超氧阴离子清除率用如下公式进行计算：o2-清除率(％)＝(a
1-a2)/a1×
100，其中：a1为空白对照组吸光值，a2为实验组发酵果汁吸光值。
[0065]
羟基自由基清除能力检测方法为：将1ml发酵果汁加入10ml刻度试管，以1ml蒸馏水为空白对照，再加入1.0ml，浓度为6mmol/l双氧水中，然后添加1.0ml浓度为20mmol/l水杨酸，再加入0.5ml浓度为1.5mmol/l硫酸亚铁。在温度为37℃的恒温水浴锅中加热1h，蒸馏水调零，用分光光度计在波长为562nm时测定吸光度a，每个处理均做3个重复实验。羟自由基清除率用如下公式进行计算：羟自由基清除率(％)＝[(a1-a2)/a1]
×
100，其中：a1为空白的平均吸光度；a2为发酵果汁的平均吸光度。
[0066]
经检测，本实施例2和3所得发酵果汁的dpph自由基清除能力分别为88.2％和85.8％，超氧阴离子自由基清除能力为53.2％和52％，羟基自由基清除能力为25.6％和23.9％。
[0067]
3、越橘发酵果汁感官评价
[0068]
请20名发酵专业人员从色泽、香气、口感、流动性、风味等5个方面，对实施例2-3和对比例1-2所得到的越橘发酵果汁进行感官评价，感官评定具体标准见表2，对越橘发酵果汁色泽、香气、口感、流动性、风味5项打分，5项总和100分。感官评价结果见表3。
[0069]
表2越橘发酵果汁感官评价标准
[0070][0071][0072]
表3越橘发酵果汁评价结果
[0073][0074]
由表3结果可知，使用本发明提供的方法生产的越橘发酵果汁具有较好的可饮性。所得发酵果汁呈现紫色有光泽，且可生成一些风味物质如酸、高级醇、酯类等，使越橘发酵果汁具有更佳可饮性。
[0075]
综合分析得出，本发明越橘发酵果汁不仅有较高含量的胞外多糖，还具有较高超氧化物歧化酶(sod)活性。通过其联合作用可见，感官评价表明本发明越橘发酵果汁色泽好，香气浓郁，粘稠度流动性均适中，风味独特，具有良好的可饮性。使用本发明方法制得的越橘发酵果汁品质优良，可直接饮用，亦可作为饮料配方中的一种原料。
[0076]
以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种肠膜明串珠菌，其特征在于：所述肠膜明串珠菌命名为肠膜明串珠菌fy01，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m 2022541，保藏日期为2022年5月3日。2.如权利要求1所述的肠膜明串珠菌在生产胞外多糖中的应用。3.一种富含胞外多糖的发酵饮品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备权利要求1所述肠膜明串珠菌的种子液，将种子液接种至培养基中培养，培养结束后将菌液离心去上清，使用无菌水清洗后重悬得重悬菌液，备用；(2)对鲜果进行预处理，得到果汁混合物；(3)向果汁混合物中加入步骤(1)制备的重悬菌液，搅拌均匀，静置发酵，得到发酵饮品。4.如权利要求3中所述富含胞外多糖的发酵饮品的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中重悬菌液的菌密度≥107cfu/ml。5.如权利要求3中所述富含胞外多糖的发酵饮品的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中预处理方法具体为：将鲜果清洗破碎，匀浆处理，加入清水混匀后，添加复合酶制剂进行酶解，向酶解后的混合物中添加糖和氮源，调整糖度，随后杀菌、灭酶活得到果汁混合物。6.如权利要求5中所述富含胞外多糖的发酵饮品的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中复合酶制剂包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和酸性蛋白酶；以质量百分比计，纤维素酶添加量为0.1％-0.5％，半纤维素酶的添加量为0.1％-0.5％，果胶酶的添加量为0.12％-0.18％，酸性蛋白酶的添加量为0.1％-0.5％。7.如权利要求5中所述富含胞外多糖的发酵饮品的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中糖包括蔗糖、乳糖、葡萄糖中的一种或多种；氮源包括大豆肽粉，乳清蛋白粉、玉米低聚肽中的一种或多种。8.如权利要求5中所述富含胞外多糖的发酵饮品的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中调整糖度至14％-20％；以质量百分比计，氮源添加量为0.4％-0.6％。9.如权利要求3中所述富含胞外多糖的发酵饮品的制备方法，其特征在于：按体积比计，所述步骤(3)中重悬菌液的添加量为2％-8％。10.如权利要求3中所述富含胞外多糖的发酵饮品的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中发酵条件为25-32℃条件下发酵4-7天，每隔10h搅拌一次。

技术总结
本发明属于微生物技术领域，具体提供了一种肠膜明串珠菌及其应用，所述肠膜明串珠菌命名为肠膜明串珠菌FY01，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022541，保藏日期为2022年5月3日。本发明提供的这种肠膜明串珠菌具有较高的产胞外多糖能力，能在果汁发酵过程中产生胞外多糖，使发酵的果汁具有抗氧化、抗肿瘤的作用，为开发新型功能性饮品提供新的思路，是一株可应用到实际生产的具有潜在经济效益的菌株。生产的具有潜在经济效益的菌株。


技术研发人员：方素云 孟像海 胡晓珂 王鹏 闵军 彭健 张海坤
受保护的技术使用者：青岛康小鹿生物科技有限公司
技术研发日：2023.05.15
技术公布日：2023/8/2