一种检测野大麦染色体的寡核苷酸探针试剂盒及其用法

1.本专利公开了一种用于检测野大麦染色体的寡核苷酸探针试剂盒及其使用方法，属于生物技术领域。


背景技术：

2.荧光原位杂交(fish)是20世纪80年代末发展起来的一种非放射性原位杂交技术，广泛用于植物核型分析、异源染色体鉴定和染色体进化及染色体工程等领域(jiang jm and gill bs.current status and the future of fluorescence in situ hybridization(fish)in plant genome research.genome，2006，49(9)：1057-1068)。随着植物基因组学的发展，依据基因组序列可以设计大量的寡核苷酸探针，包括重复序列和单拷贝序列寡核苷酸探针，由于单链寡核苷酸探针来源丰富，设计简单，且不用变性、杂交信号稳定，大大增加了染色体识别率，因此已经广泛应用于植物细胞遗传和染色体工程研究(du p，zhuang l，wang y，yuan l，wang q，wang d，dawadondup，tan l，shen j，xu h，zhao h，chu c，qi z.development of oligonucleotides and mul如lex probes for quick and accurate identification of wheat and thinopyrum bessarabicum chromosomes[j].genome，2017，60：93-103；zhang s，zhu m，shang y，wang j，dawadundup，zhuang l，zhang j，chu c，qi z.physical organization of repetitive sequences and chromosome diversity of barley revealed by fluorescence in situ hybridization(fish).genome，2019，62(5)：329-339；chen j，tang y，yao l，wu h，tu x，zhuang l，qi z.cytological and molecular characterization of thinopyrum bessarabicum chromosomes and structural rearrangements introgressed in wheat[j].molecular breeding，2019，39：146.)。
[0003]
小麦是世界上最重要的粮食作物之一。小麦近缘物种是小麦遗传改良的重要基因资源库。远缘杂交和染色体工程是利用近缘物种改良小麦遗传基础的主要方法。野大麦(hordeum brevisubulatum，2n＝4x＝28，h1h1h2h2)，又名短芒大麦，属于禾本科大麦属，是亚洲温带地区天然牧场优良的野生牧草，在我国主要分布于东北、华北和西北地区，分蘖性强，耐寒、耐盐碱、耐瘠薄(王比德.优良牧草-短芒大麦[j].中国草业科学，1981，4(1)：55-57；于卓，云锦凤，马有志，辛志勇.加拿大披碱草
×
野大麦三倍体杂种染色体的分子原位杂交鉴定[j].遗传学报，2004，31(7)：735-739)。野大麦不但可用于人工培育优良牧草品种(吕玉茹，李造哲，马青枝，李月强.披碱草和野大麦及其杂交新品系苗期耐盐性研究[j].黑龙江畜牧兽医，2021(06)：93-98+107；蒙农1号野大麦简介[j].草原与草业，2021，33(02)：5)，而且野大麦具有优良的耐逆性，也是小麦改良的重要基因资源。
[0004]
野大麦是四倍体物种。前人利用减数分裂染色体配对分析、有丝分裂核型分析和基因组原位杂交等方法对野大麦及其种间杂种后代的染色体组成进行了研究(t.，bothmer r.von，dewey d.r.genomic relationships in hordeum brevisubulatum complex[j].can.j.genet.and cytoi，1984，26：569-577；王照兰，杜建才，云锦凤.披碱草
与野大麦的属间杂交及f1代细胞学分析[j].草地学报，1997，5(4)：281-285；李造哲，云锦凤，于卓，何丽君.披碱草和野大麦杂种f_1与bc_1代细胞遗传学研究[j].草地学报，2005，13(4)：269-273；于卓，云锦凤，马有志，辛志勇.加拿大披碱草
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野大麦三倍体杂种染色体的分子原位杂交鉴定[j].遗传学报，2004，31(7)：735-739)。冯娜利用小麦的重复序列45s rdna、5s rdna、pscl 19.2和pasl等质粒dna探针对野大麦进行fish分析，发现这些重复序列在野大麦的染色体上具有独特的分布位点(冯娜，李景环.野大麦的分子核型分析[j].种子，2021，40(08)：15-19+24)。由于这些分析技术的识别精度有限，不能准确区分野大麦的全部染色体，同时更无法对野大麦的染色体核型及染色体变异进行精确分析。开发野大麦的专用寡核苷酸探针，利用寡核苷酸探针的高分辨性对野大麦的染色体核型进行深入分析，可为野大麦的染色体组成、物种起源进化等遗传研究，以及良种培育提供参考信息。
[0005]
南京农业大学开发了一系列针对小麦、大麦、玉米、黑麦、百萨偃麦草等物种染色体识别的寡核苷酸探针及试剂盒(见参考文献：du p，zhuang lf，wang yz，yuan l，wang q，wang dr，dawadondup，tan lj，shen j，xu hb，zhao h，chu cg，qi zj.development of oligonucleotides and multiplex probes for quick and accurate identification of wheat and thinopyrum bessarabicum chromosomes.genome，2017，60：93-103；zhu m，du p，zhuang l，chu c，zhao h，qi z.a simple and efficient non-denaturing fish method for maize chromosome differentiation using single-strand oligonucleotide probes.genome，2017，60(8)：657-664.)，并申请了专利保护(亓增军，杜培.一种利用寡聚核苷酸探针染液涂染染色体的新方法，专利授权号：zl201510428499.0)，为开发野大麦的寡核苷酸探针试剂盒提供了参考。
[0006]
本专利针对野大麦，采用根据蒙农1号野大麦基因组重测序序列开发的寡核苷酸探针fam-wbcl146、fam-wbcl37-1和fam-wbcl37-2，与onpm#7中可以在野大麦染色体上产生杂交信号的pas1衍生的寡核苷酸探针(tamra-pas1-1，tamra-pas1-3，tamra-pas1-4，tamra-pas1-6，tamra-afa-3，tamra-afa-4)和fam-gaa)
10
(du p，zhuang lf，wang yz，yuan l，wang q，wang dr，dawadondup，tan lj，shen j，xu hb，zhao h，chu cg，qi zj.development of oligonucleotides and multiplex probes for quick and accurate identification ofwheat and thinopyrum bessarabicum chromosomes.genome，2017，60：93-103)，以及onpm#8中的tamra-act)10和fam-hvcl43-1(见参考文献：王佳奇.基于串联重复序列fish的西藏青稞地方品种染色体多样性分析[d].南京：南京农业大学，2020)组配出一个新的寡核苷酸探针试剂盒onpm#10，利用该试剂盒，通过fish分析可以识别野大麦、披碱草和小麦的全部染色体，显著提高了野大麦和披碱草染色体的鉴定效率和准确性，从而为野大麦牧草品种改良及小麦-野大麦染色体工程育种提供了有力的工具。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的在于公开一种检测野大麦染色体寡核苷酸探针试剂盒及其用法，为牧草和小麦染色体工程育种及遗传研究提供了有力工具。
[0008]
本发明的目的通过以下技术方案实现：
[0009]
1.利用蒙农1号基因组重测序数据，鉴定出野大麦基因组特异的的重复序列2种及
披碱草相似重复序列1种，并据此开发了3个新的寡核苷酸探针(fam-wbcl146、fam-wbcl37-1、fam-wbcl37-2)，与从小麦和大麦上已经开发的寡核苷酸探针中能在野大麦染色体上产生信号的其它9个探针结合(见参考文献：du p，zhuang lf，wang yz，yuan l，wang q，wang dr，dawadondup，tan lj，shen j，xu hb，zhao h，chu cg，qi zj(2017)development of oligonucleotides and multiplex probes for quick and accurate identification of wheat and thinopyrum bessarabicum chromosomes.genome，60：93-103和王佳奇.基于串联重复序列fish的西藏青稞地方品种染色体多样性分析[d].南京：南京农业大学，2020.)，组配了一个包括12个寡核苷酸探针(tamra-pas1-1，tamra-pas1-3，tamra-pas1-4，tamra-pas1-6，tamra-afa-3，tamra-afa-4，tamra-act)
10
及fam-hvcl43-1，，fam-(gaa)
10
，fam-wbcl146，fam-wbcl37-1，fam-wbcl37-2)的寡核苷酸探针试剂盒onpm#10，通过fish，可以准确识别野大麦全部染色体及染色体臂，同时也能区分小麦和披碱草染色体。所用的寡核苷酸探针序列特征如下所示：
[0010]
表1所用的寡核苷酸探针名称、序列及用量
[0011][0012][0013]
2.一种用于检测野大麦染色体的寡核苷酸探针试剂盒onpm#10的使用方法，包括
以下步骤：
[0014]
(1)杂交液配制和变性：探针干粉每管用30μl的ddh2o溶解，然后按表1中对应的用量在离心管中将不同探针混匀，并按表2用量加入缓冲液各成分(dfa(去离子甲酰胺)，ssdna(鲑鱼精dna)，50％dextran sulfate(硫酸葡聚糖)，20
×
ssc)。将装有杂交液的离心管于105℃变性13min，再迅速移至-20℃乙醇中静置10min；
[0015]
(2)制片变性：将染色体制片放入变性液(70％酒精+3g氢氧化钠)，于42℃的水浴中变性5min。室温下，将制片于70.0％，70.0％，100.0％的酒精中各放置5min，气干；
[0016]
表2杂交液组分及用量
[0017][0018]
(3)杂交：将变性的杂交液加在制片上(17.37μl/张)，盖上盖玻片。将制片平放入杂交盒内，置于37℃的培养箱，处理8h以上；
[0019]
(4)洗片及镜检：将制片取出，移去盖玻片。42℃水浴条件，依次用两份2
×
ssc缓冲液浸洗制片5min，然后用纯水浸洗2min，吹干后用抗荧光猝灭剂dapi胶(6.5μl/张)套染，再盖上盖玻片。在荧光显微镜下观察、拍照。
[0020]
本发明的有益效果：
[0021]
1、本发明建立了一种便捷、准确的野大麦染色体鉴定方法，可以促进野大麦染色体多样性研究及向小麦中的转移与利用；
[0022]
2、本发明开发的寡核苷酸探针试剂盒onpm#10可以检测野大麦、小麦和披碱草染色体，为小麦、野大麦和披碱草基因组进化分析及其染色体工程与种质创新应用提供了便利；
附图说明
[0023]
图1：野大麦基因组特异寡核苷酸探针在蒙农1号上的杂交
[0024]
图2：基于寡核苷酸探针套onpm#10的蒙农1号染色体fish及核型
[0025]
图3：基于onpm#10的东北野大麦染色体fish及核型
[0026]
图4：基于onpm#10的小麦品种苏麦3号染色体fish
[0027]
图5：基于onpm#10的披碱草染色体fish及核型
具体实施方式
[0028]
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
[0029]
实施例1、野大麦重复序列寡核苷酸探针套开发与染色体定位分析
[0030]
提取野大麦叶片dna，利用二代dna测序技术(illumina pair-end)对野大麦进行低深度测序获得4gb序列，使用生物信息学软件tandem repeat analyzer(tarean)
(http：//www.repeatexplorer.org)对野大麦基因组dna序列中各种串联重复序列进行聚类分析，筛选野大麦基因组dna序列中高拷贝数的微卫星重复序列，然后在ncbi的nr数据库对野大麦的微卫星重复序列进行blast比对(megablasthttps：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，筛选出2种野大麦基因组特异的重复序列(wbcl110和wbcl146)和1种与披碱草相似的重复序列wbcl37，基于oligo7(https：//www.oligo.net/downloads.html)利用上述三条重复序列设计了5条寡核苷酸探针，对这些探针在野大麦染色体上的分布进行fish分析，发现3条探针(fam-wbcl37-1、fam-wbcl37-2和fam-wbcl146)可以在野大麦染色体上产生清晰的杂交信号，其信号主要分布于染色体端部(图1)，因此可以作为识别野大麦染色体的特异探针。
[0031]
为了提高野大麦核型清晰度，分别利用用于小麦染色体检测的onpm#7(chen j，tang y，yao l，wu h，tu x，zhuang l，qi z.cytologieal and molecular characterization of thinopyrum bessarabicum chromosomes and structural rearrangements introgressed in wheat[j].molecular breeding，2019，39：146.)和用于大麦染色体检测的onpm#8(王佳奇.基于串联重复序列fish的西藏青稞地方品种染色体多样性分析[d].南京：南京农业大学，2020.)对野大麦蒙农1号染色体进行fish分析，发现onpm#7和onpm#8中的寡核苷酸探针pasl-1、pasl-3、pas1-4、pas1-6、afa-3、afa-4、(act)10、(gaa)10和hvcl43-1可以在野大麦染色体上产生清晰的杂交信号，这些探针与新开发的三个探针组合形成了一个新的寡核苷酸探针试剂盒onpm#10，包括pas1-1、pas1-3、pas1-4、pas1-6、afa-3、afa-4、(act)
10
、(gaa)10、hvcl43-1、wbcl37-1、wbcl37-2和wbcl146，在蒙农1号和东北野大麦全部染色体上产生清晰和丰富的杂交信号，可以识别野大麦全部染色体及其染色体臂(图2，3)。
[0032]
onpm#10使用方法包括以下步骤：
[0033]
(1)杂交液配制和变性：探针干粉每管用30μl的ddh2o溶解，然后按表1中对应的用量在离心管中将不同探针混匀，并按表2加入缓冲液(dfa(去离子甲酰胺)，ssdna(鲑鱼精dna)，50％dextran sulfate(硫酸葡聚糖)，20
×
ssc)。将装有杂交液的离心管于105℃变性13min，再迅速移至-20℃乙醇中静置10min；
[0034]
(2)制片变性：将染色体制片放入变性液(70％酒精+3g氢氧化钠)，于42℃的水浴中变性5min。室温下，将制片于70.0％，70.0％，100.0％的酒精中各放置5min，气干；
[0035]
(3)杂交：将变性的杂交液加在制片上(17.37μl/张)，盖上盖玻片。将制片平放入杂交盒内，置于37℃的培养箱，处理8h以上；
[0036]
(4)洗片及镜检：将制片取出，移去盖玻片。42℃水浴条件，依次用两份2
×
ssc缓冲液浸洗制片5min，然后用纯水浸洗2min，吹干后用抗荧光猝灭剂dapi胶(6.5μl/张)套染，再盖上盖玻片。在荧光显微镜下观察、拍照。
[0037]
本发明在研究初期曾利用前人已开发的onpm#7或onpm#8对蒙农1号野大麦染色体进行了fish分析，但染色体杂交信号较少，无法准确区分蒙农1号全部染色体。利用本技术组配的onpm#10对蒙农1号fish分析表明，该探针套不但在蒙农1号各条染色体，且在东北野大麦全部染色体上也能产生清晰稳定的杂交信号，并可以识别野大麦全部染色体，并构建了蒙农1号(图2)和东北野大麦参考核型(图3)。核型比较显示，两种野大麦均为四倍体，但根据染色体多态性和杂合性，推断野大麦为部分同源四倍体，同时，蒙农1号和东北野大麦
两个材料间存在明显的染色体多态性，显示了不同野大麦选系间存在明显的染色体变异，说明该本探针套不但可以有效识别、追踪野大麦染色体，还可以用于野大麦染色体及基因组进化分析。
[0038]
实施例2、小麦染色体分析
[0039]
onpm#10包括tamra-pas1-1，tamra-pas1-3，tamra-pas1-4，tamra-pas1-6，tamra-afa-3，tamra-afa-4，tamra-(act)
10
及fam-hvcl43-1，fam-(gaa)
10
，fam-wbcl146，fam-wbcl37-1，fam-wbcl37-2，探针干粉各1管。
[0040]
使用方法包括以下步骤：
[0041]
(1)杂交液配制和变性：探针干粉每管用30μl的ddh2o溶解，然后按表1中对应的用量在离心管中将不同探针混匀，并按表2加入缓冲液(dfa(去离子甲酰胺)，ssdna(鲑鱼精dna)，50％dextran sulfate(硫酸葡聚糖)，20
×
ssc)。将装有杂交液的离心管于105℃变性13min，再迅速移至-20℃乙醇中静置10min；
[0042]
(2)制片变性：将染色体制片放入变性液(70％酒精+3g氢氧化钠)，于42℃的水浴中变性5min。室温下，将制片于70.0％，70.0％，100.0％的酒精中各放置5min，气干：
[0043]
(3)杂交：将变性的杂交液加在制片上(17.37μl/张)，盖上盖玻片。将制片平放入杂交盒内，置于37℃的培养箱，处理8h以上；
[0044]
(4)洗片及镜检：将制片取出，移去盖玻片。42℃水浴条件，依次用两份2
×
ssc缓冲液浸洗制片5min，然后用纯水浸洗2min，吹干后用抗荧光猝灭剂dapi胶(6.5μl/张)套染，再盖上盖玻片。在荧光显微镜下观察、拍照。
[0045]
图4为利用onpm#10得到的小麦(以苏麦3号为例)的fish图，可准确区分小麦全部染色体，说明本探针套可高效、准确地鉴定小麦染色体，且全部染色体与野大麦染色体可以清晰区分，从而为小麦-野大麦远缘杂交转移和利用野大麦有利基因提供了便利。
[0046]
实施例3、披碱草染色体分析
[0047]
onpm#10包括tamra-pas1-1，tamra-pas1-3，tamra-pas1-4，tamra-pas1-6，tamra-afa-3，tamra-afa-4，tamra-(act)
10
及fam-hvcl43-1，fam-(gaa)
10
，fam-wbcl146，fam-wbcl37-1，fam-wbcl37-2，探针干粉各1管。
[0048]
使用方法包括以下步骤：
[0049]
(1)杂交液配制和变性：探针干粉每管用30μl的ddh2o溶解，然后按表1中对应的用量在离心管中将不同探针混匀，并按表2加入缓冲液(dfa(去离子甲酰胺)，ssdna(鲑鱼精dna)，50％dextran sulfate(硫酸葡聚糖)，20
×
ssc)。将装有杂交液的离心管于105℃变性13min，再迅速移至-20℃乙醇中静置10min；
[0050]
(2)制片变性：将染色体制片放入变性液(70％酒精+3g氢氧化钠)，于42℃的水浴中变性5min。室温下，将制片于70.0％，70.0％，100.0％的酒精中各放置5min，气干；
[0051]
(3)杂交：将变性的杂交液加在制片上(17.37μl/张)，盖上盖玻片。将制片平放入杂交盒内，置于37℃的培养箱，处理8h以上；
[0052]
(4)洗片及镜检：将制片取出，移去盖玻片。42℃水浴条件，依次用两份2
×
ssc缓冲液浸洗制片5min，然后用纯水浸洗2min，吹干后用抗荧光猝灭剂dapi胶(6.5μl/张)套染，再盖上盖玻片。在荧光显微镜下观察、拍照。
[0053]
图5为利用onpm#10构建的披碱草的参考核型，可准确区分披碱草全部染色体，说
明本探针套可高效、准确地鉴定披碱草属物种的染色体，为研究小麦族植物染色体进化提供了有力工具。
[0054]
可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种用于检测野大麦染色体并能同时检测小麦和披碱草染色体的寡核苷酸探针试剂盒onpm#10的设计方法，其特征在于，所述的onpm#10包括寡核苷酸探针干粉12管(1 od/管)。2.一种如权利要求1所述的检测野大麦染色体并能同时检测小麦和披碱草染色体的寡核苷酸探针试剂盒onpm#10的设计方法，其特征在于，所述的寡核苷酸探针干粉，包括tamra标记的(act)
10
，pas1-1，pas1-3，pas1-4，pas1-6，afa-3，afa-4和fam标记的(gaa)
10
，hvcl43-1，wbcl37-1，wbcl37-2和wbcl146各一管，其序列特征如下表：表1所用寡核苷酸探针名称、序列及用量表2杂交液组分及用量
3.用于检测野大麦染色体并能同时检测小麦和披碱草染色体的onpm#10的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)杂交液配制和变性：探针干粉每管用30μl的ddh2o溶解，然后按表1中对应的用量在离心管中将不同探针混匀，并按表2加入缓冲液(dfa(去离子甲酰胺)，ssdna(鲑鱼精dna)，50％dextran sulfate(硫酸葡聚糖)，20
×
ssc)，之后将装有杂交液的离心管于105℃变性13min，再迅速移至-20℃乙醇中静置10min；(2)制片变性：将染色体制片放入变性液(70％酒精+3g氢氧化钠)，于42℃的水浴中变性5min。室温下，将制片于70.0％，70.0％，100.0％的酒精中各放置5min，气干；(3)杂交：将变性的杂交液加在制片上(17.37μl/张)，盖上盖玻片，然后将制片平放入杂交盒内，置于37℃的培养箱，处理8h以上；(4)洗片及镜检：将制片取出，移去盖玻片，在42℃水浴条件下，依次用两份2
×
ssc缓冲液浸洗制片5min，然后用纯水浸洗2min，吹干后用抗荧光猝灭剂dapi胶(6.5μl/张)套染，再盖上盖玻片，最后在荧光显微镜下观察、拍照。4.上述权利要求1、2和3所述探针试剂盒及其用法在商业育种和检测中的应用。

技术总结
本发明属于生物技术领域，新开发了寡核苷酸探针试剂盒ONPM#10，可以准确识别、追踪野大麦全部染色体，在披碱草和普通小麦染色体上也能产生清晰且不同的杂交信号，从而为上述物种的染色体自动化、高通量分析提供了有力工具，并在小麦-野大麦染色体工程与种质创新及牧草育种中具有重要应用潜力。育种中具有重要应用潜力。育种中具有重要应用潜力。


技术研发人员：冯祎高 李存鑫 夏雅婷 何梓铭 亓增军 沈霞 赵姝楠 李依依 殷沁炜 安雨婷
受保护的技术使用者：南京农业大学
技术研发日：2023.06.06
技术公布日：2023/8/4