一种苦参碱型生物碱及其制备方法与在制备具有抗神经炎症作用的药物中的应用

1.本发明涉及药物化学技术领域，具体涉及一种苦参碱型生物碱及其制备方法和在制备具有抗神经炎症作用的药物中的应用。


背景技术：

2.随着我国人口老龄化速度加快，神经退行性疾病受到越来越多的关注。近年来的研究表明，神经炎症是引起诸多神经退行性疾病如阿尔兹海默症(ad)和帕金森病(pd)等的重要原因之一，而小胶质细胞的活化在神经炎症发生和发展的过程中十分关键。因此如果能发现小分子化合物可以抑制小胶质细胞激活及其细胞内炎症因子的表达，有可能能潜在应用于治疗神经炎症及其引起的诸多神经退行性疾病的治疗。
3.从中药中发现具有生物活性的化合物分子一直是药物发现的重要手段。苦参(拉丁名：sophora flavescens)为豆科(fabaceae)槐属(sophora)植物，作为一味传统中药在我国已经有千年用药的历史。苦参中主要成分苦参碱型生物碱在临床上有清热燥湿，消炎等作用。现代药理学研究结果也表明苦参碱型生物碱具有不同程度的抗炎活性。由于苦参碱型生物碱是否具有可以抑制神经炎症的活性报道较少，因此从苦参中开发出具有抗神经炎症活性的苦参碱型生物碱具有重要的应用价值。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种全新的苦参碱型生物碱；研究表明，本发明全新结构的苦参碱型生物碱具有优异的抗神经炎症作用。
5.本发明的技术方案如下：
6.本发明首先提供了一种苦参碱型生物碱，其具有式i、式ii或式iii所示的结构：
[0007][0008]
本发明在研究中发现，具有式i、式ii或式iii所示结构的苦参碱型生物碱其具有优异的抗神经炎症作用。尤其是，具有式i、式ii或式iii所示结构的苦参碱型生物碱在实验过程中对细胞存活率无明显影响，对细胞具有较低的毒性。
[0009]
本发明还提供了一种组合物，其包含式i、式ii或式iii所示结构的任意一种或一种以上的苦参碱型生物碱。
[0010]
本发明还提供了一种提取物，其包含式i、式ii或式iii所示结构的任意一种或一种以上的苦参碱型生物碱。
[0011]
优选地，所述的提取物包含式i、式ii和式iii所示结构的苦参碱型生物碱。
[0012]
优选地，式i、式ii和式iii所示结构的苦参碱型生物碱的总重量占提取物总重量的10％以上。
[0013]
进一步优选地，式i、式ii和式iii所示结构的苦参碱型生物碱的总重量占提取物总重量的20％～80％。
[0014]
优选地，所述的提取物为苦参提取物。
[0015]
本发明还提供了一种上述苦参碱型生物碱、组合物或提取物在制备具有抗神经炎症作用的药物中的应用。
[0016]
优选地，所述的苦参碱型生物碱、组合物或提取物在制备由神经炎症引起的神经退行性疾病中的应用。
[0017]
优选地，所述的神经退行性疾病包括阿尔兹海默症和帕金森病。
[0018]
优选地，所述的药物制成散剂、丸剂、片剂、胶囊剂、口服液、气雾剂或注射剂。
[0019]
有益效果：本发明提供了一种全新结构的苦参碱型生物碱；研究表明，本发明式i、式ii或式iii所示结构的苦参碱型生物碱其具有优异的抗神经炎症作用；尤其是还具有较低的毒性。因此，将式i、式ii或式iii所示结构的苦参碱型生物碱，或将含有式i、式ii或式iii所示结构的苦参碱型生物碱的组合物或提取物作为活性成分用于制备具有抗神经炎症作用的药物具有重要的应用价值。
附图说明
[0020]
图1为化合物sophflarine f的单晶结构图。
[0021]
图2为化合物sophflarine g的单晶结构图。
[0022]
图3为化合物sophflarine h的单晶结构图。
[0023]
图4为化合物sophflarine f的高分辨质谱图。
[0024]
图5为化合物sophflarine f的氢谱(600m,cdcl3)。
[0025]
图6为化合物sophflarine f的碳谱(150m,cdcl3)。
[0026]
图7为化合物sophflarine f的dept谱(150m,cdcl3)。
[0027]
图8为化合物sophflarine f的1h-1
h cosy谱。
[0028]
图9为化合物sophflarine f的hsqc谱。
[0029]
图10为化合物sophflarine f的hmbc谱。
[0030]
图11为化合物sophflarine g的高分辨质谱图。
[0031]
图12为化合物sophflarine g的氢谱(600m,cdcl3)。
[0032]
图13为化合物sophflarine g的碳谱(150m,cdcl3)。
[0033]
图14为化合物sophflarine g的dept谱(150m,cdcl3)。。
[0034]
图15为化合物sophflarine g的1h-1
h cosy谱。
[0035]
图16为化合物sophflarine g的hsqc谱。
[0036]
图17为化合物sophflarine g的hmbc谱。
[0037]
图18为化合物sophflarine h的高分辨质谱图。
[0038]
图19为化合物sophflarine h的氢谱(600m,cdcl3)。
[0039]
图20为化合物sophflarine h的碳谱(150m,cdcl3)。
[0040]
图21为化合物sophflarine h的dept谱(150m,cdcl3)。
[0041]
图22为化合物sophflarine h的1h-1
h cosy谱。
[0042]
图23为化合物sophflarine h的hsqc谱。
[0043]
图24为化合物sophflarine h的hmbc谱。
[0044]
图25为sophflarine f、sophflarine g、sophflarine h的药理实验结果图。
[0045]
图26为sophflarine f的结构编号图。
[0046]
图27为sophflarine g的结构编号图。
[0047]
图28为sophflarine h的结构编号图。
具体实施方式
[0048]
以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。
[0049]
实施例1苦参碱型生物碱的制备
[0050]
(1)取苦参干燥根药材30kg，加入5倍量95％(v/v)乙醇，热回流提取2次，过滤，滤液减压回收溶剂，得到总浸膏2000g；将总浸膏加水混悬，用1％的hcl调ph至3，搅拌，静置，用氯仿萃取除杂，再将除杂后的酸水层用2％的氨水调ph至10，搅拌，静置，用氯仿重新萃取，减压浓缩氯仿萃取液得到800g总碱；
[0051]
(2)将总碱用体积分数为30％乙醇混悬，上d101大孔树脂柱，然后依次用30％、50％、70％和95％乙醇进行梯度洗脱，分别得到四个馏分，命名大孔树脂柱馏分一至馏分四；
[0052]
(3)将大孔树脂柱馏分一进一步上硅胶柱层析，依次用二氯甲烷-甲醇体系(90:10,80:20,70:30,50:50,v:v)进行梯度洗脱，基于各个梯度比例分别得到四个馏分，命名硅胶柱馏分一至馏分四；
[0053]
(4)将硅胶柱馏分二进一步上ods反向柱层析，依次用甲醇-水体系(10:90,20:80,30:70,50:50,v:v)进行梯度洗脱，基于各个梯度比例分别得到四个馏分，命名ods柱馏分一至馏分四；
[0054]
(5)将ods柱馏分三采用制备型高效液相色谱(采用c18反相柱)进行分离得式i、式ii以及式iii所示结构的苦参碱型生物碱；式i所示结构的苦参碱型生物碱命名为：sophflarine f；式ii所示结构的苦参碱型生物碱命名为：sophflarine g；式iii所示结构的苦参碱型生物碱命名为：sophflarine h；
[0055]
其中，制备型高效液相色谱的条件均为乙腈：水＝90:10，流速6ml/min，检测波长254nm，收集保留时间60.1min的色谱峰，得化合物sophflarine f；收集保留时间71.1min的色谱峰，得化合物sophflarine g；收集保留时间80.3min的色谱峰，得化合物sophflarine h。
[0056]
sophflarine f、g、h的结构鉴定：
[0057]
所分离化合物sophflarine f、sophflarine g、sophflarine h均为无色块状晶体，比旋光度分别为体，比旋光度分别为uv光谱显示最大吸收均在205nm附近，结合苦参碱类结构的紫外吸收特点可推出仅有酰胺键官能团；高分辨质谱结合碳谱表明前两个化合物具有相同的分子式，为c
15h22
n2o3，则多一个氧原子单元，为c
15h22
n2o4，不饱和度计算值均为6。
[0058]
化合物sophflarine f的
13
c nmr结合dept谱可知15个碳信号分别为1个酰胺羰基(δ
c 172.0),一个次甲基(δ
c 56.7),10个亚甲基(δ
c 47.5
×
2,47.1,30.8,27.5,25.6,22.1,19.8,19.1,16.8),和3个连氧季碳信号(δ
c 84.0,83.9,81.8)；以上数据再结合1h nmr谱中典型的c-17位信号[δ
c 47.5,δ
hα
3.68(d,j＝13.0hz)；δ
hβ
3.40(d,j＝13.0hz)]，为苦参碱c-5位被羟基取代而得，以上1d nmr信息结合剩余的5个不饱和度，表明化合物sophflarine f为一类新型的五环体系苦参碱型生物碱。从h
2-17至c-5/c-6，从h-11至c-6/c-7以及从h
2-2/h
2-10至c-6的hmbc远程相关确定c-5/c-6/c-7为连氧位点；最后使用x-ray单晶衍射的方法
确定sophflarine f的平面结构为一个新颖的6/6/6/6/4五环体系苦参碱型生物碱，结构式如式i所示。
[0059]
化合物sophflarine g的1h nmr谱和
13
c nmr谱数据与sophflarine f较为相似，结合hsqc谱可知仅在化学位移上有些许差异，且主要体现在h
2-2/h
2-10/h
2-17和c-11这些碳氢位点上。利用二维相关对其碳氢全归属后，确定两者具有相同的平面结构；最终通过x-ray单晶衍射的方法验证了化合物sophflarine g为一个新颖的6/6/6/6/4五环体系苦参碱型生物碱，结构式如式ii所示。
[0060]
化合物sophflarine h的nmr数据与sophflarine f基本相似，区别在于sophflarine f上c-14位的亚甲基(δ
c 31.3)被sophflarine h上一个连氧的次甲基(δ
c 68.6)所替代，结合sophflarine h的分子式也比sophflarine f多16个质量单位，以及sophflarine h中从h
2-12至c-14和从h-14至c-12/c-15两组hmbc相关峰，可以推出sophflarine h为sophflarine f的c-14位处羟基取代衍生物。最终也通过x-ray单晶衍射的方法验证了化合物sophflarine g为一个新颖的6/6/6/6/4五环体系苦参碱型生物碱，结构式如式iii所示。
[0061]
表1化合物sophflarine f-h的氢谱和碳谱归属如表(cdcl3,δin ppm,j in hz)a[0062][0063]a注解：重叠峰未进行多重峰分析归属
[0064]
化合物sophflarine f-h的理化性质数据如下：
[0065]
sophflarine f：无色块状晶体；mp 138
–
139℃；比旋光值[α]
25d-16.8(c 0.10,ch3oh)；紫外uv(ch3oh)λ
max
(logε)206(3.24)nm；1h nmr(600mhz,cdcl3)和
13
c nmr(150mhz,cdcl3),见表1；高分辨质谱hresims m/z 279.1693[m+h]
+
(计算值c
15h23
n2o3,279.1703)。
[0066]
sophflarine g：无色块状晶体；mp 140
–
141℃；比旋光值[α]
25d
+29.6(c 0.10,ch3oh)；紫外uv(ch3oh)λ
max
(logε)205(3.23)nm；1h nmr(600mhz,cdcl3)和
13
c nmr(150mhz,cdcl3),见表1；高分辨质谱hresims m/z 279.1704[m+h]
+
(计算值c
15h23
n2o3,279.1703)。
[0067]
sophflarine h：无色块状晶体；mp 146
–
147℃；比旋光值[α]
25d
+21.0(c 0.10,ch3oh)；紫外uv(ch3oh)λ
max
(logε)206(3.02)nm；1h nmr(600mhz,cdcl3)和
13
c nmr(150mhz,cdcl3),见表1；高分辨质谱hresims m/z 295.1642[m+h]
+
(计算值c
15h23
n2o4,295.1652)。
[0068]
实验例
[0069]
(1)细胞活力测定：
[0070]
a.小鼠小胶质细胞bv-2细胞株的培养同文献[journal of natural products,2021,84(7):1898-1903]中描述方法。
[0071]
b.配制mtt工作液：使用电子天平称量0.5g mtt，溶于100m l磷酸缓冲液(pbs)中，使mtt终浓度为5mg/m l。0.22μm过滤器过滤后分装，-20℃避光保存。
[0072]
c.待细胞密度达80-90％时，胰酶消化细胞，调整细胞悬液浓度，使每100μl细胞悬液中含有5000个细胞，铺96孔板，每孔100μl细胞悬液。于37℃，5％co2细胞培养箱培养至细胞完全贴壁后，加入不同浓度的苦参碱型生物碱(sophflarine f、sophflarine g、sophflarine h)，分别作用24h、48h和72h。对照组加入等体积的pbs，每组处理设置6个复孔。
[0073]
d.苦参碱型生物碱作用至设定时间后，吸去孔中培养基，pbs洗2次孔中细胞后，向每孔加入20μl mtt溶液，继续培养4h。
[0074]
e.4h后终止培养，吸去孔内培养基，每孔加入150μl dmso溶液，锡箔纸包住96孔板避光，置摇床上孵育10min，使结晶物充分溶解。
[0075]
f.多功能酶标仪检测od 570nm处各孔的吸光值。
[0076]
(2)bv-2细胞中no释放抑制实验：培养基中no生成浓度按照市售检测试剂盒说明书提供的方法测定。用50μl的griess试剂(0.1％n-1-萘乙二胺二盐酸盐,1％磺胺)与等体积培养细胞上清液共孵育后，在微孔板上测定吸光度(540nm)。根据4个浓度(6.25～100μm)的抑制率，采用非线性回归分析计算各试验化合物的ic
50
值。相同浓度下的实验均重复3次。
[0077]
药理实验结果：
[0078]
神经退行性疾病的发生源于诸多的神经炎症反应。在神经炎症的状态下，小胶质细胞(bv-2)过度活化，诱导一氧化氮合酶(inos)过表达一氧化氮(no)。如图25所示，从苦参中分离得到的新生物碱sophflarine f、sophflarine g、sophflarine h在100μm高浓度时对bv-2细胞的细胞存活率无明显影响，但在6.25-100μm浓度范围内可以剂量依赖性的抑制lps诱导后bv-2细胞过表达产生的no的释放，与不给药的lps组以及空白组的no释放量有显著差异。本实验中使用的阳性对照，地塞米松(dexamethasone，简称dex)，在10μm浓度对lps诱导后bv-2细胞过表达产生的no的释放抑制率为42.5％，这说明本发明所述的化合物在25μm浓度时表现出与阳性对照相当的活性，而在高浓度时能表现出比阳性对照更优异的对神经炎症因子no的抑制作用。以上结果综合表明式i、式ii以及式iii所示结构的苦参碱型生物碱具有抗神经炎症的作用，能作为潜在的神经炎症抑制剂用于治疗神经退行性疾病。

技术特征：
1.一种苦参碱型生物碱，其特征在于，具有式i、式ii或式iii所示的结构：2.一种组合物，其特征在于，包含式i、式ii或式iii所示结构的任意一种或一种以上的苦参碱型生物碱。3.一种提取物，其特征在于，包含式i、式ii或式iii所示结构的任意一种或一种以上的苦参碱型生物碱。4.根据权利要求3所述的提取物，其特征在于，所述的提取物包含式i、式ii和式iii所示结构的苦参碱型生物碱。5.根据权利要求4所述的提取物，其特征在于，式i、式ii和式iii所示结构的苦参碱型生物碱的总重量占提取物总重量的10％以上；进一步优选地，式i、式ii和式iii所示结构的苦参碱型生物碱的总重量占提取物总重量的20％～80％。6.根据权利要求3所述的提取物，其特征在于，所述的提取物为苦参提取物。7.权利要求1～6任一项所述的苦参碱型生物碱、组合物或提取物在制备具有抗神经炎症作用的药物中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的苦参碱型生物碱、组合物或提取物
在制备由神经炎症引起的神经退行性疾病中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的神经退行性疾病包括阿尔兹海默症和帕金森病。10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的药物制成散剂、丸剂、片剂、胶囊剂、口服液、气雾剂或注射剂。

技术总结
本发明具体公开了一种苦参碱型生物碱及其制备方法和在制备具有抗神经炎症作用的药物中的应用。所述的苦参碱型生物碱，具有式I、式II或式III所示的结构。所述的组合物和提取物，包含式I、式II或式III所示结构的任意一种或一种以上的苦参碱型生物碱。研究表明，本发明式I、式II或式III所示结构的苦参碱型生物碱其具有优异的抗神经炎症作用；尤其是还具有较低的毒性。因此，将式I、式II或式III所示结构的苦参碱型生物碱，或将含有式I、式II或式III所示结构的苦参碱型生物碱的组合物或提取物作为活性成分用于制备具有抗神经炎症作用的药物具有重要的应用价值。物具有重要的应用价值。物具有重要的应用价值。


技术研发人员：罗钉 王昊 张玉波 王国才 代小勇 李药兰 范春林 邹加文 尹文静
受保护的技术使用者：暨南大学
技术研发日：2022.09.05
技术公布日：2023/8/4