一种与肺腺癌相关的血浆tRFs/tiRNAs标志物及其应用的制作方法

一种与肺腺癌相关的血浆trfs/tirnas标志物及其应用
技术领域
1.本发明属于生物诊断和医药领域，具体涉及一种与肺腺癌相关的血浆trfs/tirnas标志物及其应用。


背景技术：

2.长久以来，肺癌是世界上威胁人类生命最主要的恶性肿瘤，其中发病率最高的亚型是肺腺癌(luad)(sung et al.,2021；zhang et al.,2020)。尽管治疗取得了长足的进步，但luad的5年总生存率(os)不超过15％，因为很大一部分患者通常在症状变得明显时才被诊断出来(al-dherasi et al.,2021)。虽然低剂量计算机断层扫描(ldct)是现有的肺腺癌检出率最高的早期诊断技术，但其存在价格高、假阳性率高等明显不足(national lung screening trial research team et al.,2011)。传统的血清生物标志物如癌胚抗原(cea)和细胞角蛋白片段抗原21-1(cyfra21-1)由于特异性不足，往往无法实现肺腺癌的早期诊断(i and cho,2015)。因此，发现新的早期诊断生物标志物对于攻克肺腺癌具有重要意义，将为肺腺癌的及时发现、早期治疗乃至改善预后提供切实有效的帮助。
3.在高通量测序技术的帮助下，大量的非编码rna(ncrna)已被证实在癌症的发生和发展中发挥重要作用(zhou et al.,2011)。转移rna衍生的非编码小rna(tsrnas)受到广泛关注，其主要成员是trna衍生片段(trfs)和trna衍生的应激诱导rnas(tirnas)，它们是核酸酶通过对前体或成熟trna的特异性切割获得(xu et al.,2017；saikia and hatzoglou,2015)。对trfs/tirnas的研究可以追溯到19世纪70年代，当时borek e等人发现肿瘤组织中大量的trfs/tirnas来源于高周转的trna(borek et al.,1977)。此后，一系列研究在细胞、组织和体液中检测到了大量的trfs/tirnas(honda et al.,2015；sharma et al.,2016；godoy et al.,2018)，并证明了稳定存在的trfs/tirnas在基因表达、蛋白质翻译和表观遗传修饰中发挥重要的调节功能(kuscu et al.,2018；lyons et al.,2020；watanabe et al.,2011)。最新证据表明，trfs/tirnas在神经系统疾病、代谢疾病和癌症中异常表达(oberbauer et al.,2018)。具体的说，研究表明tirna-gln-ctg-003、tirna-his-gtg-001和trf-ala-agc-002在晚期卵巢癌组织中异常表达，5'-trf-lysctt在膀胱癌患者中明显过表达(chen et al.,2021；papadimitriou et al.,2020)。此外，shao y等表明trf-leu-cag在非小细胞肺癌肿瘤组织和细胞系中表达上调，并观察到其在非小细胞肺癌血清中的表达与肿瘤分期进展显著相关(shao et al.,2017)。li j等人发现非小细胞肺癌患者血清中trf-31-79mp9p9nh57sd表达升高，且其表达水平与临床分期和淋巴结恶性程度有关(li et al.,2022)。因此，有理由相信trfs/tirnas可以作为监测癌症的候选分子标志物。
4.目前，trfs/tirnas与肺腺癌方面的相关研究尚未见报道，如果能筛选到肺腺癌中异常表达的血浆trfs/tirnas作为生物标志物，并研发相应的诊断试剂盒，对肺腺癌的诊断现状将会有大大的推动。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种与肺腺癌相关的血浆trfs/tirnas标志物以及该标志物在制备用于诊断肺腺癌的试剂盒中的应用。另外，本发明还提供与肺腺癌相关的血浆trfs/tirnas标志物的特异性引物及其应用。
6.本发明的目的通过如下技术方案实现：
7.一种与肺腺癌相关的血浆trfs/tirnas标志物，所述的血浆trfs/tirnas标志物为trf-1:29-pro-agg-1-m6、trf-55:76-tyr-gta-1-m2中的一种或组合；所述trf-1:29-pro-agg-1-m6的核苷酸序列如seq id no：1所示；所述trf-55:76-tyr-gta-1-m2的核苷酸序列如seq id no：2所示。
8.所述血浆trfs/tirnas标志物在制备用于诊断肺腺癌的试剂盒中的应用。
9.本发明提供了一种诊断肺腺癌的试剂盒，它包括用于扩增所述trf-1:29-pro-agg-1-m6、trf-55:76-tyr-gta-1-m2中的一种或组合的引物。
10.其中，用于扩增所述trf-1:29-pro-agg-1-m6的引物的序列为：
11.f:5
’‑
gatcggctcgttggtctagg-3'(seq id no：3)，
12.r:5
’‑
cttccgatctcgagaatcatacc-3’(seq id no：4)。
13.用于扩增所述trf-55:76-tyr-gta-1-m2的引物的序列为：
14.f:5
’‑
cagtccgacgatctcgaatcc-3'(seq id no：5)，
15.r:5
’‑
gctcttccgatcttggtccttc-3’(seq id no：6)。
16.所述的试剂盒，它还包括用于扩增内参u6的内参引物；所述内参引物的序列为：
17.f:5
’‑
gcttcggcagcacatatactaaaat-3’(seq id no：7)，
18.r:5
’‑
cgcttcacgaatttgcgtgtcat-3’(seq id no：8)。
19.本发明还提供一种与肺腺癌相关的血浆trfs/tirnas标志物的特异性引物，
20.所述trf-1:29-pro-agg-1-m6的特异性引物为：
21.f:5
’‑
gatcggctcgttggtctagg-3'，
22.r:5
’‑
cttccgatctcgagaatcatacc-3’；
23.所述trf-55:76-tyr-gta-1-m2的特异性引物为：
24.f:5
’‑
cagtccgacgatctcgaatcc-3'，
25.r:5
’‑
gctcttccgatcttggtccttc-3’。
26.本发明还提供所述的特异性引物在制备肺腺癌诊断试剂中的应用。
27.较之现有技术而言，本发明的优点在于：
28.本发明基于高通量测序技术，分析了肺腺癌患者和健康对照者的血浆trfs/tirnas表达谱。tirna-1:34-val-cac-2、trf-1:29-pro-agg-1-m6和trf-55:76-tyr-gta-1-m2被筛选成为候选trfs/tirnas，并通过定量实时聚合酶链式反应(qrt-pcr)进一步验证。此外，采用受试者工作特征曲线(roc)评估血浆trfs/tirnas的诊断效能。最后，本发明利用生物信息学技术预测了trfs/tirnas潜在的靶基因及其调控网络，并进一步探讨了它们在肺腺癌中的主要细胞生物学功能和相关分子机制。
29.本发明通过qrt-pcr筛选了7个trfs/tirnas，结果表明tirna-1:34-val-cac-2、trf-1:29-pro-agg-1-m6和trf-55:76-tyr-gta-1-m2在肺腺癌中表达，与测序结果相匹配。这三个被选为候选trfs/tirnas，并用于进一步的roc曲线分析。对候选trfs/tirnas的进一
步验证表明，与健康受试者相比，trf-55:76-tyr-gta-1-m2在肺腺癌中表达上调，而trf-1:29-pro-agg-1-m6的表达则出现明显下调。trf-1:29-pro-agg-1-m6和trf-55:76-tyr-gta-1-m2的auc分别达到0.882和0.896，在肺腺癌患者中表现出更好的诊断价值。本研究还评估了它们在肺腺癌中的表达水平与临床病理学特征之间的相关性。结果显示，肺腺癌患者中trf-55:76-tyr-gta-1-m2的表达明显升高，提示其与肺腺癌的恶性程度呈正相关。而trf-1:29-pro-agg-1-m6的表达水平与肺腺癌的临床分期呈负相关，表明其高表达在抑制肿瘤进展方面具有很大潜力。此外，与肺腺癌术前相比，肿瘤切除后患者trf-1:29-pro-agg-1-m6的表达下调，而trf-55:76-tyr-gta-1-m2的表达水平则反向升高。由此可以得出结论，trf-1:29-pro-agg-1-m6和trf-55:76-tyr-gta-1-m2的表达水平与肺腺癌患者手术前后肿瘤的存在密切相关。
30.本发明筛选并确定了trf-55:76-tyr-gta-1-m2和trf-1:29-pro-agg-1-m6在诊断肺腺癌中具有较高敏感性和特异性。
31.本发明获得了与肺腺癌相关的血浆trfs/tirnas标志物，通过血浆trfs/tirnas标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可使得肺腺癌的诊断更加方便易行，为临床治疗提供基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
32.本发明提出的与血浆trfs/tirnas标志物相关的试剂盒即诊断肺腺癌的试剂盒可用于肺腺癌患者的辅助早期诊断，有助于反映肺腺癌患者的疾病状态，为临床治疗提供更好的支持。
附图说明
33.图1是肺腺癌患者和健康对照者血浆中trfs/tirnas的表达谱；
34.其中，(a)所有样本的相关系数热图，面板中的颜色越深，表示两个样本之间的相关系数较高；(b)肺腺癌患者和健康对照之间trfs/tirnas表达谱的pca图；(c)韦恩图显示了在本项目中检测到并收集在trfdb中的trfs/tirnas的数量；(d)韦恩图显示了早期肺腺癌和健康对照、晚期肺腺癌和健康对照以及早期肺腺癌和晚期肺腺癌之间常见和特异性表达的trfs/tirnas。
35.图2是肺腺癌患者和健康对照的血浆trfs/tirnas亚型分析图；
36.其中，(a-c)trfs/tirnas亚型在健康对照组、早期肺腺癌和晚期肺腺癌中的分布；(d-f)健康对照组、早期肺腺癌和晚期肺腺癌中与trna异构体对应的trfs/tirnas亚型数量；(g-i)健康对照组、早期肺腺癌和晚期肺腺癌中trfs/tirnas的亚型频率与其长度的关系。
37.图3是早期肺腺癌、晚期肺腺癌和健康对照中trfs/tirnas的差异表达分析结果图。
38.其中，(a)层次聚类热图显示了早期肺腺癌和健康对照、晚期肺腺癌和健康对照、早期肺腺癌和晚期肺腺癌之间差异表达的trfs/tirnas；(b)早期肺腺癌和健康对照、晚期肺腺癌和健康对照、早期肺腺癌和晚期肺腺癌之间差异表达trfs/tirnas的火山图；(c)7个trfs/tirnas(tirna-1:34-val-cac-2,trf-1:15-ala-agc-2-m11,trf-1:24-ser-aga-1-m7、trf-1:29-pro-agg-1-m6、trf-55:76-tyr-gta-1-m2、trf-59:75-trp-cca-1-m5和trf-61:77-thr-agt-1-m2)在健康对照、早期肺腺癌和晚期肺腺癌中的相对表达水平；*p《
0.05，**p《0.01和***p《0.001；ns，没有意义。
39.图4是肺腺癌中候选血浆trfs/tirnas的表达水平和诊断价值图；
40.其中，(a-c)与正常对照相比，肺腺癌患者中tirna-1:34-val-cac-2、trf-1:29-pro-agg-1-m6和trf-55:76-tyr-gta-1-m2的相对表达水平；(d,e)trf-1:29-pro-agg-1-m6和trf-55:76-tyr-gta-1-m2在肺腺癌患者中的诊断效能。
41.图5是候选血浆trfs/tirnas在肺腺癌术前和术后中的表达水平和诊断价值图；
42.其中，(a-c)tirna-1:34-val-cac-2、trf-1:29-pro-agg-1-m6和trf-55:76-tyr-gta-1-m2在肺腺癌患者术前和术后中的相对表达量；(d,e)trf-1:29-pro-agg-1-m6和trf-55:76-tyr-gta-1-m2在肺腺癌患者术前和术后中的诊断效能。
43.图6是trf-1:29-pro-agg-1-m6和trf-55:76-tyr-gta-1-m2的生物信息学分析图；
44.其中，(a,b)trf-1:29-pro-agg-1-m6和trf-55:76-tyr-gta-1-m2在trna的三叶草二级结构中的位置以及它们的目标靶点。(c)trf-1:29-pro-agg-1-m6和trf-55:76-tyr-gta-1-m2的靶基因。(d)trf-1:29-pro-agg-1-m6和trf-55:76-tyr-gta-1-m2的go富集分析。(e)trf-1:29-pro-agg-1-m6和trf-55:76-tyr-gta-1-m2的kegg通路分析。
45.图7是trf-1:29-pro-agg-1-m6、trf-55:76-tyr-gta-1-m2以及u6的扩增曲线。
46.图8是trf-1:29-pro-agg-1-m6、trf-55:76-tyr-gta-1-m2以及u6的熔解曲线。
具体实施方式
47.下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：
48.1.材料和方法
49.1.1临床信息
50.本发明涉及的所有血浆样本均采集自2021年1月至2022年3月在福建省立医院就诊的肺腺癌患者和健康人。
51.所有肺腺癌患者均经组织病理学证实，排除高血压、糖尿病、严重肝肾疾病、转移瘤以及其他全身性疾病，其中男19例，女28例，年龄28～80岁，平均年龄56.02
±
10.42岁。根据2010年国际癌症控制联盟(uicc)/美国癌症联合委员会(ajcc)的肿瘤-淋巴结-转移(tnm)分期系统对肺腺癌进行分期。
52.健康对照者均排除肺部疾病、肿瘤及其他全身性疾病，男9例，女12例，年龄26～77岁，平均47.71
±
12.48岁。
53.从所有实验对象中随机抽取4名早期肺腺癌、4名晚期肺腺癌和4名健康对照者的血浆样本进行测序分析，其余样本留作后续研究。
54.选择47名肺腺癌患者的血浆样本进行定量实时聚合酶链反应(qrt-pcr)分析。
55.选择12名肺腺癌患者的血浆样本用于评估trfs/tirnas在肺腺癌手术切除前后的表达水平和潜在价值。
56.收集并详细记录所有参与者的相关临床资料。
57.本研究获得所有参与者的书面知情同意，并获得福建省立医院伦理委员会批准(k2021-03-054)。
58.2.血浆rna的提取和预处理
59.首先，使用trizol ls试剂从血浆中提取总rna。然后，用nanodrop nd-1000分光光
度计评估每个rna样品的浓度和纯度。接着，测量在260和280nm波长处所有rna样品的吸光度，并计算od260/od280的比值(比值要求为1.8～2.1)。再使用琼脂糖凝胶电泳检查rna完整性。此外，对总rna进行预处理，以去除一些干扰小rna测序文库构建的rna修饰。该过程如下：3'-氨基酰基(带电荷)脱酰基为3'-oh，用于3'-接头连接；3'-cp(2'，3'-环磷酸酯)为3'-oh，用于3'-接头连接；5'-oh(羟基)磷酸化为5'-p，用于5'-接头连接；m1a和m3c去甲基化以实现高效逆转录。
60.3.文库制备和trfs/tirnas测序
61.预处理后的总rna用于制备测序文库。首先，将每个样本的总rna依次连接到3'和5'小rna接头上。然后使用illumina的专有rt引物和扩增引物合成和扩增cdna。随后，从page凝胶中提取和纯化134～160bp的pcr扩增片段。最后，通过agilent 2100 bioanalyzer对完成的文库进行量化。这些文库被变性为单链dna分子，在illumina流动细胞上被捕获，作为测序簇原位扩增，并按照制造商的说明在illumina nextseq 500系统上测序50个循环。
62.4.trfs/tirnas测序的数据分析
63.使用solexa pipeline v1.8(off-line base caller software,v1.8)进行图像分析和碱基调用。测序质量由fastqc检查。fastqc格式的原始数据文件由illumina测序仪生成。为了检查测序质量，绘制了每个样本的质量得分图。质量得分q与碱基调用错误概率(p)呈对数相关。用illumina检查测序质量后，对测序读数进行5'、3'-adaptor修剪，去除无用的读数(长度《14nt或长度》40nt)，并以fasta格式记录。经fasta格式修剪的读数仅允许1个与成熟trna序列不匹配，然后使用bowtie软件对齐未映射的读数，仅允许1个与前体trna序列不匹配。剩余的读数被比对，仅允许1个与mirdeep2的mirna参考序列不匹配。使用它们的测序计数评估trfs/tirnas的丰度，并将其标准化为每百万分之一的对齐读取计数(cpm)。基于比对统计分析(比对率、读长、片段序列偏差)，我们确定结果是否可用于后续数据分析。如果可以，则计算表达谱和差异表达的trfs/tirnas和mirnas。倍数变化≥1.5和p值≤0.05用于筛选差异表达的trfs/tirnas。用r或perl语言对差异表达trfs/tirnas的主成分分析(pca)、相关性分析、饼图、韦恩图、层次聚类、散点图和火山图进行统计计算和图形绘制。
64.5.qrt-pcr分析
65.按照制造商的说明，分别使用rtstar
tm
trf&tirna pretreatment kit和rtstar
tm
first-strand cdna synthesis kit进行rna预处理和cdna合成。根据2
×
pcr master mix kit制造商的方案，在lightcycler480实时定量pcr系统(roche，switzerland)上通过qrt-pcr对合成的cdna进行分析。所有反应一式三份，trfs/tirnas的相对表达水平采用2-δδct
和2-δct
方法进行计算，以u6作为内参。其中，用于扩增序列的特异性引物见表1。
66.5.1、将所有cdna样品分别配置realtime pcr反应体系。体系配置如下：
67.68.轻弹管底将溶液混合，5000rpm短暂离心。
69.5.2、加样
70.a.将8ul混合液加到384-pcr板对应的每个孔中。
71.b.再加入对应的2μl cdna。
72.c.小心粘上sealing film封口膜，并短暂离心混合。
73.d.在设置pcr程序前将准备好的pcr板放在冰上。
74.5.3、将上述384-pcr板置于realtime pcr仪上进行pcr反应。
75.所有的指标均按以下程序进行：95℃，10min；40个pcr循环(95℃，10秒；60℃，60秒(收集荧光))。为了建立pcr产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按(95℃，10秒；60℃，60秒；95℃，15秒)；并从60℃缓慢加热到95℃(仪器自动进行-ramp rate为0.075℃/秒)。
76.5.4、结果与计算
77.各样品的目的基因和管家基因(u6)分别进行realtime pcr反应。根据绘制的梯度稀释dna标准曲线，各样品目的基因和管家基因的浓度结果直接由机器生成。每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度，即为此样品此基因的校正后的相对含量。
78.如图7所示，正常对照血样和肺腺癌血样中，trf-1-29-pro-agg-1-m6(图7a)、trf-55-76-tyr-gta-1-m2(图7b)、内参u6((图7c)均得到有效扩增，与基因测序的结果一致。图8为trf-1-29-pro-agg-1-m6(图8a)、trf-55-76-tyr-gta-1-m2(图8b)以及内参u6(图8c)的熔解曲线。各熔解曲线均为单一特异性峰说明对应的引物的特异性好。
79.表1qrt-pcr的引物序列
[0080][0081]
其中，f代表正向(上游引物)；r代表反向(下游引物)
[0082]
6.电化学发光法测定血清中cea、nse和scc的表达
[0083]
按照制造商的说明，使用原装试剂盒在cobas e602机器(roche diagnostics，switzerland)上定量测定血清cea、nse和scc的表达水平。cea、nse和scc的临界值分别为5ng/ml、16.3ng/ml和2.7ng/ml。
[0084]
7.trfs/tirnas的生物信息学分析
[0085]
根据gtrnadb数据库(http://gtrnadb.ucsc.edu/)确定衍生trna二级结构中每个trf的确切位置。然后通过targetscan(http://www.targetscan.org/vert_72/)和miranda(http://www.microrna.org/microrna/)数据库挖掘trfs/tirnas的潜在靶基因。使用kobas 3.0软件对trfs/tirnas进行基因本体论(go)和京都基因和基因组百科全书(kegg)富集分析。
[0086]
8.统计分析
[0087]
采用spss statistics 24.0(spss,chicago,il)和graphpad prism 8.0软件(graphpad software,la jolla,ca)进行统计分析。采用非配对t检验来评估所有肺腺癌患者和健康对照组之间的差异。采用配对t检验评估肺腺癌患者术前和术后的差异。通过受试者工作特征(roc)曲线计算曲线下面积(auc)确定诊断价值。所有测量数据均以平均值和平均值的标准误差(sem)进行表示。约登指数用于计算trfs/tirnas的最佳截止值。p《0.05被认为具有统计学意义。
[0088]
9.结果
[0089]
9.1血浆中trfs/tirnas的表达谱
[0090]
作为衡量样本选择合理性和可靠性的核心标准，样本相关系数的值越接近1，任意两个样本之间的相似度就越高。本研究通过计算样本相关系数，表明选取的12份血浆样本适合本次测序分析，结果准确可靠(图1a)。pca的结果显示肺腺癌患者和健康对照组间的trfs/tirnas表达谱存在显著差异(图1b)。如图1c所示，通过对trfs/tirnas进行测序分析，共鉴定出506个trna衍生物，包括431个未在trfdb数据库中注释的新型trna衍生物。此外，如图1d所示，在早期肺腺癌和健康对照组、晚期肺腺癌和健康对照组、早期和晚期肺腺癌之间存在共同和特异性表达的trfs/tirnas。
[0091]
9.2血浆trfs/tirnas亚型分析
[0092]
亚型trfs/tirnas分布的饼图显示每个亚型trfs/tirnas的数量在早期肺腺癌、晚期肺腺癌和健康对照组中有所不同(图2a、2b、2c)。与正常对照组相比，早期和晚期肺腺癌中trf-1、trf-3a、trf-3b和trf-5a的数量增加。此外，与早期肺腺癌相比，晚期肺腺癌中trf-1和trf-5b显著升高。从图2的d、e和f部分可以看出，肺腺癌中包含的arg-tct、leu-taa、phe-gaa和ser-cga，是健康对照中不存在的四种trna异构体。此外，尽管trna异构体具有相同的反密码子，但在健康对照组、早期肺腺癌和晚期肺腺癌中，trfs和tirnas亚型的类型和数量并不相同。不同序列长度的trnas中trfs/tirnas亚型的频率也不相同。如图2g、2h和2i所示，本研究进一步发现，在对照组、早期和晚期肺腺癌中，具有相同序列长度的trfs/tirnas亚型的频率也存在显著差异。
[0093]
9.3trfs/tirnas的差异表达分析
[0094]
无监督的层次聚类热图显示了健康对照组、早期肺腺癌组和晚期肺腺癌组中任意两组之间trfs/tirnas表达有明显变化(图3a)。如图3的b部分所示，早期肺腺癌患者和健康对照之间有40个上调和34个下调trfs/tirnas；在晚期肺腺癌和健康对照之间差异表达的trfs/tirnas中，有24个上调，25个下调；与早期肺腺癌相比，晚期肺腺癌患者的trfs/tirnas表达增加的有23个，减少的有16个。根据cpm的结果，挑选出7个在不同组间表现出较高均一性和异质性的trfs/tirnas(tirna-1:34-val-cac-2,trf-1:15-ala-agc-2-m11,trf-1:24-ser-aga-1-m7、trf-1:29-pro-agg-1-m6、trf-55:76-tyr-gta-1-m2、trf-59:75-trp-cca-1-m5和trf-61:77-thr-agt-1-m2)，并通过qrt-pcr对其表达水平进行评估。结果表明，tirna-1:34-val-cac-2、trf-1:24-ser-aga-1-m7、trf-1:29-pro-agg-1-m6、trf-55:76-tyr-gta-1-m2和trf-61:77-thr-agt-1-m2在肺腺癌中存在差异表达(图3c)。最后，本项目根据每个trfs/tirnas的相对表达量，选择了3个差异表达最显著的trfs/tirnas(tirna-1:34-val-cac-2,trf-1:29-pro-agg-1-m6和trf-55:76-tyr-gta-1-m2)作为候选trfs/
tirnas用于后续研究。
[0095]
9.4候选血浆trfs/tirnas在肺腺癌中的表达水平和诊断效能
[0096]
通过qrt-pcr进一步分析tirna-1:34-val-cac-2、trf-1:29-pro-agg-1-m和trf-55:76-tyr-gta-1-m2在肺腺癌患者血浆中的具体表达水平。与正常对照组相比，肺腺癌中trf-1:29-pro-agg-1-m6的表达水平显著下调，而trf-55:76-tyr-gta-1-m2的表达水平则出现明显上调。(图4b、4c)。然而，如图4a所示，与健康对照相比，肺腺癌中血浆tirna-1:34-val-cac-2的表达没有明显差异。在此基础上进一步分析trf-1:29-pro-agg-1-m6和trf-55:76-tyr-gta-1-m2在肺腺癌中的诊断价值。其中，trf-1:29-pro-agg-1-m6和trf-55:76-tyr-gta-1-m2的auc分别为0.882(95％ci＝0.794-0.970)和0.896(95％ci＝0.821-0.970)。此外，trf-1:29-pro-agg-1-m6和trf-55:76-tyr-gta-1-m2的最佳截止值为0.9575(敏感性85.7％，特异性76.6％)和2.277(敏感性78.7％，特异性85.7％)。由此得出结论，trf-1:29-pro-agg-1-m6和trf-55:76-tyr-gta-1-m2在肺腺癌的诊断中具有巨大潜力。
[0097]
9.5trf-1:29-pro-agg-1-m6和trf-55:76-tyr-gta-1-m2的表达水平与临床病理特征的相关性
[0098]
进一步评估了trf-1:29-pro-agg-1-m6和trf-55:76-tyr-gta-1-m2的表达水平与临床病理特征的相关性。如表2所示，trf-1:29-pro-agg-1-m6的表达与tnm分期、n分期、cea的表达水平有关，而与年龄、性别、t分期、m分期、直径以及nse和scc的表达水平无明显相关性。此外，trf-55:76-tyr-gta-1-m2在肺腺癌中的表达与tnm分期、t分期、n分期、m分期、直径以及cea和scc的表达水平显著相关，但与年龄、性别和nse的表达水平无关。
[0099]
表2trf-1-29-pro-agg-1-m6和trf-55-76-tyr-gta-1-m2的表达水平与肺腺癌患者临床病理特征的相关性
[0100][0101]
9.6trf-1:29-pro-agg-1-m6和trf-55:76-tyr-gta-1-m2在肺腺癌术前与术后中的表达及潜在价值
[0102]
通过分析3个候选trfs/tirnas在肺腺癌的12对术前和术后血浆样本中的表达来评估它们在监测肺腺癌治疗中的价值。尽管肺腺癌手术前后tirna-1:34-val-cac-2的表达没有差异，但与肺腺癌患者术前相比，肺腺癌术后trf-1:29-pro-agg-1-m6和trf-55:76-tyr-gta-1-m2的表达分别出现明显下调和上调。进一步roc分析证明肺腺癌手术前后trf-1:29-pro-agg-1-m6和trf-55:76-tyr-gta-1-m2的表达水平可以有效帮助区分患者的治疗状态,它们的auc分别为0.899(95％ci＝0.770
–
1.000)和0.896(95％ci＝0.745
–
1.000)。上述的研究结果证实trf-1:29-pro-agg-1-m6和trf-55:76-tyr-gta-1-m2可作为判断肺腺癌患者手术效果的有价值的血浆标志物。
[0103]
9.7trf-1:29-pro-agg-1-m6和trf-55:76-tyr-gta-1-m2潜在靶基因的预测及功能分析
[0104]
除了在其相应trna的三叶草二级结构上展示了trf-1:29-pro-agg-1-m6和trf-55:76-tyr-gta-1-m2的位置外，图6a和图6b还显示了它们各自的目标靶点。trf-1:29-pro-agg-1-m6和trf-55:76-tyr-gta-1-m2的调控网络图显示，一个tsrna能够对应多个mrna(图6c)。go功能分析表明，trf-1:29-pro-agg-1-m6和trf-55:76-tyr-gta-1-m2的靶基因广泛分布于细胞质、细胞核和核质中，并在细胞核中发挥重要作用。此外，二者的靶基因还能通过促进蛋白质结合和相同蛋白质结合等生物过程在细胞生长和发育中发挥作用(图6d)。kegg通路富集分析表明，trf-1:29-pro-agg-1-m6和trf-55:76-tyr-gta-1-m2的靶基因主要富集于癌症相关的信号通路，包括代谢通路、嘧啶代谢、mapk信号通路、钙信号通路和
hif-1信号通路等(图6e)。
[0105]
10.对本发明进行分析
[0106]
肺腺癌是目前癌症患者人数最多的肺癌亚群。导致肺腺癌预后不良的关键原因在于很多患者无法得到及时有效的诊断和治疗。tsrna作为新兴的生物标志物，因其在体液循环中稳定存在而被越来越多的研究人员发现，并积极用于疾病的诊断、治疗和监测(xu et al.,2017；zhang et al.,2021)。最新研究表明，tsrna的关键成员trfs和tirnas是具有巨大潜力的生物标志物，它们可以通过作用于肿瘤细胞中的蛋白质翻译和基因表达来影响肿瘤的发生和发展(ivanov et al.,2011；haussecker et al.,2010；zhu et al.,2020)。本发明基于高通量测序技术分析了肺腺癌患者血浆中trfs/tirnas的表达谱。意外发现431个新的trfs/tirnas在trfdb数据库中没有注释，对它们进行更深入的研究将有助于发掘它们在肺腺癌中的价值。此外，与健康对照组相比，在早期肺腺癌和晚期肺腺癌中分别有350和344个差异表达的trfs/tirnas。trfs/tirnas的互补亚型鉴定表明，肺腺癌患者的trf-1、trf-3a、trf-3b和trf-5a表达水平异常升高。进一步分析发现，与trna异构体arg-tct、leu-taa、phe-gaa和ser-cga分别对应的亚型trf-1、trf-3a、trf-3b和trf-5a，虽然在健康对照组不表达，但却在肺腺癌中异常表达。此外，有研究指出trfs/tirnas在肺腺癌的组织样本中有差异表达。本研究则从另外一个角度揭示了trfs/tirnas在肺腺癌患者的血浆样本中存在异常表达，这也为探索trfs/tirnas作为肺腺癌潜在的生物标志物提供支持。
[0107]
本发明通过qrt-pcr筛选了7个trfs/tirnas，结果表明tirna-1:34-val-cac-2、trf-1:29-pro-agg-1-m6和trf-55:76-tyr-gta-1-m2在肺腺癌中表达，与测序结果相匹配。这三个被选为候选trfs/tirnas，并用于进一步的roc曲线分析。对候选trfs/tirnas的进一步验证表明，与健康受试者相比，trf-55:76-tyr-gta-1-m2在肺腺癌中表达上调，而trf-1:29-pro-agg-1-m6的表达则出现明显下调。相比之下，trf-1:29-pro-agg-1-m6和trf-55:76-tyr-gta-1-m2的auc分别达到0.882和0.896，在肺腺癌患者中表现出更好的诊断价值。更令人鼓舞的是，本发明还评估了它们在肺腺癌中的表达水平与临床病理学特征之间的相关性。结果显示，肺腺癌患者中trf-55:76-tyr-gta-1-m2的表达明显升高，提示其与肺腺癌的恶性程度呈正相关。而trf-1:29-pro-agg-1-m6的表达水平与肺腺癌的临床分期呈负相关，表明其高表达在抑制肿瘤进展方面具有很大潜力。此外，与肺腺癌术前相比，肿瘤切除后患者trf-1:29-pro-agg-1-m6的表达下调，而trf-55:76-tyr-gta-1-m2的表达水平则反向升高。由此可以得出结论，trf-1:29-pro-agg-1-m6和trf-55:76-tyr-gta-1-m2的表达水平与肺腺癌患者手术前后肿瘤的存在密切相关。本发明筛选并确定了trf-55:76-tyr-gta-1-m2和trf-1:29-pro-agg-1-m6在诊断肺腺癌中具有较高敏感性和特异性。
[0108]
本发明探索trf-55:76-tyr-gta-1-m2和trf-1:29-pro-agg-1-m6的下游调控机制发现它们参与了多种关键的生物学信号通路，如代谢通路、嘧啶代谢、钙信号通路、mapk信号通路和hif-1信号通路。结果表明trf-55:76-tyr-gta-1-m2和trf-1:29-pro-agg-1-m6将通过这些肿瘤相关信号通路影响肺腺癌的发生和进展，为我们进一步探索其机制提供方向。
[0109]
总之，本发明的研究揭示了肺腺癌患者血浆中trfs/tirnas的表达谱，并确定trf-55:76-tyr-gta-1-m2和trf-1:29-pro-agg-1-m6可作为诊断肺腺癌的新型生物标志物。

技术特征：
1.一种与肺腺癌相关的血浆trfs/tirnas标志物，其特征在于：所述的血浆trfs/tirnas标志物为trf-1:29-pro-agg-1-m6、trf-55:76-tyr-gta-1-m2中的一种或组合；所述trf-1:29-pro-agg-1-m6的核苷酸序列如seq id no：1所示；所述trf-55:76-tyr-gta-1-m2的核苷酸序列如seq id no：2所示。2.一种血浆trfs/tirnas标志物在制备用于诊断肺腺癌的试剂盒中的应用，其特征在于：所述的血浆trfs/tirnas标志物为trf-1:29-pro-agg-1-m6、trf-55:76-tyr-gta-1-m2中的一种或组合；所述trf-1:29-pro-agg-1-m6的核苷酸序列如seq id no：1所示；所述trf-55:76-tyr-gta-1-m2的核苷酸序列如seq id no：2所示。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：用于扩增所述trf-1:29-pro-agg-1-m6的引物序列为：f:5
’‑
gatcggctcgttggtctagg-3'，r:5
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cttccgatctcgagaatcatacc-3’；用于扩增所述trf-55:76-tyr-gta-1-m2的引物序列为：f:5
’‑
cagtccgacgatctcgaatcc-3'，r:5
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gctcttccgatcttggtccttc-3’。4.一种诊断肺腺癌的试剂盒，其特征在于：它包括用于扩增所述trf-1:29-pro-agg-1-m6、trf-55:76-tyr-gta-1-m2中的一种或组合的引物。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：用于扩增所述trf-1:29-pro-agg-1-m6的引物的序列为：f:5
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gatcggctcgttggtctagg-3'，r:5
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cttccgatctcgagaatcatacc-3’。6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：用于扩增所述trf-55:76-tyr-gta-1-m2的引物的序列为：f:5
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cagtccgacgatctcgaatcc-3'，r:5
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gctcttccgatcttggtccttc-3’。7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：它还包括用于扩增内参u6的内参引物；所述内参引物的序列为：f:5
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gcttcggcagcacatatactaaaat-3’，r:5
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cgcttcacgaatttgcgtgtcat-3’。8.一种与肺腺癌相关的血浆trfs/tirnas标志物的特异性引物，其特征在于：所述的血浆trfs/tirnas标志物为trf-1:29-pro-agg-1-m6、trf-55:76-tyr-gta-1-m2中的一种或组合；所述trf-1:29-pro-agg-1-m6的特异性引物为：f:5
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gatcggctcgttggtctagg-3'，r:5
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cttccgatctcgagaatcatacc-3’；所述trf-55:76-tyr-gta-1-m2的特异性引物为：f:5
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cagtccgacgatctcgaatcc-3'，r:5
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gctcttccgatcttggtccttc-3’。9.如权利要求8所述的特异性引物在制备肺腺癌诊断试剂中的应用。

技术总结
本发明涉及与肺腺癌相关的血浆tRFs/tiRNAs标志物及其应用，血浆tRFs/tiRNAs标志物为tRF-1:29-Pro-AGG-1-M6、tRF-55:76-Tyr-GTA-1-M2中的一种或组合；所述tRF-1:29-Pro-AGG-1-M6的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述tRF-55:76-Tyr-GTA-1-M2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明获得了与肺腺癌相关的血浆tRFs/tiRNAs标志物，通过所述标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可使得肺腺癌的诊断更加方便易行，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。分子药物靶标提供帮助。分子药物靶标提供帮助。


技术研发人员：陈良远 尤剑彬 陈发林 黄舒宇 徐驯宇 康艳丽 杨国溜 江颖锋 甘雨涵
受保护的技术使用者：福建省立医院
技术研发日：2022.08.22
技术公布日：2023/8/4