细梗胡枝子提取物及其制备方法和应用

1.本发明属于医药技术领域，尤其涉及细梗胡枝子提取物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.细梗胡枝子，为豆科植物细梗胡枝子lespedezavirgata(thunb.)dc.的全草。分布于辽宁南部、华北、陕西至长江流域各省。具有清暑利尿，截疟之功效，用于治疗中暑、小便不利、疟疾、感冒、高血压等症。
3.细梗胡枝子全草可入药，其记载始见于《救荒本草》，书载曰：“胡枝子别名随军茶，生平泽中，有二种，叶形有大小，大叶者类黑豆叶，小叶者茎类耆草，叶似苜蓿叶而长大，花色有紫白，结子如粟粒大，气味与槐相类，性温。”对胡枝子性味归经的记载见于《福建民间草药》：甘、平，无毒；《闽东本草》：味微苦，性平，入心、肝二经。胡枝子入药古已有之，其民间药用价值在本草中有着详细记载，用于治疗肺热咳嗽，百日咳：胡枝子鲜草一至二两，冰糖五钱，酌冲开水炖一小时服，日服三次(《福建民间草药》)；《闽东本草》记载有：益筋骨，健脾驱湿，治头晕，脱力，蛇伤；于冰糖炖服治鼻衄；《江西民间草药》记录胡枝子治妇人赤白带下：胡枝子根一两，用瘦猪肉四两炖汤，以汤药煎服。而胡枝子最早用于治疗泌尿系统疾病始见于《福建民间草药》：润肺解热，利水通淋；治疗小便淋沥不尽可用胡枝子鲜草一至二两，车前草五至八钱，冰糖一两，酌加水煎，日服两次。
4.自上世纪30年代末至今，国内外学者对细梗胡枝子的化学成分进行了系统的研究，确定其主要含有生物碱、黄酮、甾醇等多种化学成分。文献报道，细梗胡枝子对肾功能不全有疗效，但有关细梗胡枝子及其提取物对炎症性疾病，尤其对肾炎的疗效和对细胞修复功能的影响尚无报道。为深入开发利用传统药物，阐释传统药物在治疗炎症性疾病中的作用，并为寻找活性更好的抗炎药物提供理论依据和实践经验，我们通过系统的药理和化学研究，发现并制备了细梗胡枝子炎症抑制活性的有效部位，并对其抗炎、抗肾炎进行了体内外活性评价。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供了细梗胡枝子提取物的制备方法，可得到含有大量药物活性成分的细梗胡枝子提取物。
6.本发明的目的还在于提供了细梗胡枝子提取物在制备治疗耳炎、肾炎的药物和用于细胞修复的药物中的应用。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
8.本发明提供了一种细梗胡枝子提取物的制备方法，包括以下步骤：
9.细梗胡枝子粉碎，加入水或乙醇溶剂回流提取0.5～3h，过滤，滤渣加入溶剂重复提取1～2次，过滤，合并滤液，减压浓缩得浓缩液。
10.优选的，所述水的添加量为2～5l/kg，所述醇溶液为20～60％醇溶液，其添加量为6～12l/kg。
11.优选的，所述浓缩液继续减压浓缩至干。
12.优选的，所述浓缩液依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，保留水溶部分，冷冻干燥。
13.优选的，所述浓缩液采用正丁醇萃取2～3次，保留水溶部分，冷冻干燥。
14.优选的，所述水溶部分以80％乙醇沉淀，醇溶部分冻干。
15.优选的，所述水溶部分以80％乙醇沉淀，沉淀部分用无水乙醇和/或丙酮洗涤，洗涤后剩余沉淀冻干。
16.本发明还提供了上述制备方法得到的细梗胡枝子提取物在制备治疗炎症的药物中的应用，所述炎症包括耳炎和/或肾炎。
17.本发明还提供了上述制备方法得到的细梗胡枝子提取物在制备用于细胞修复的药物中的应用。
18.优选的，所述药物包括细梗胡枝子提取物和药学上可接受的辅料。
19.本发明的有益效果：
20.本发明通过系统的化学和药理研究，所得细梗胡枝子提取物的制备方法简单，可操作性强，所得有效部位产率较高，产业化前景较好。
21.本发明制备得到的细梗胡枝子提取物具有显著的抗炎作用，可显著改善小鼠耳部肿胀，对小鼠耳炎具有显著的疗效，有望开发成为治疗炎症性疾病的新药。
22.本发明制备得到的细梗胡枝子提取物在体内高剂量给药后可显著降低肾炎小鼠血清bun、cre水平及脾指数；具有降低血清cho水平、减少肾炎小鼠24h尿蛋白量的趋势；本发明制备得到的细梗胡枝子提取物在体外可显著缓解多柔比星诱导大鼠肾小管上皮nrk-52e细胞损伤，且随着浓度的提高，细梗胡枝子提取物的细胞恢复效果增强。体内、体外实验结果表明，本发明制备得到的细梗胡枝子提取物具有一定的细胞保护作用。对小鼠肾炎具较好的疗效。
具体实施方式
23.本发明提供了一种细梗胡枝子提取物的制备方法，包括以下步骤：细梗胡枝子粉碎，加入水或醇溶剂回流提取0.5～3h，过滤，滤渣加入溶剂重复提取1～2次，过滤，合并滤液，减压浓缩至滤液体积的5～15％，得浓缩液。
24.本发明所用细梗胡枝子为细梗胡枝子全草(中药材)。
25.本发明先对细梗胡枝子进行粉碎，粉碎后优选为过80～100目筛，然后加入溶剂进行回流提取。本发明对具体的粉碎方式不作限定。
26.在本发明中，所述溶剂包括水、20～60％的醇溶液，所述醇溶液可为含水乙醇溶液或含水甲醇溶液。本发明可通过添加水或20～60％的醇溶液对细梗胡枝子进行提取，分别得到细梗胡枝子水提取物或细梗胡枝子醇提取物。所述醇溶液的浓度优选为30～50％，更优选为40％；所述醇溶液优选为乙醇溶液。
27.在本发明中，所述溶剂为水时，根据细梗胡枝子的用量，溶剂的添加量为2～5l/kg，优选为3～4l/kg，更优选为3.4l/kg。
28.在本发明中，所述溶剂为40％乙醇溶液时，根据细梗胡枝子的用量，溶剂的添加量为6～12l/kg，优选为8～10l/kg，更优选为9l/kg。
29.本发明对细梗胡枝子进行回流提取，回流提取的时间为0.5～3h，所述溶剂为水时，回流提取时间优选为0.5～2h，更优选为40～60min，所述溶剂为醇溶液时，回流提取的时间优选为40～100min，更优选为50～60min。本发明通过水或醇溶液的回流提取，可以有效将细梗胡枝子中黄酮、槲素、山奈酸、三叶豆甙及异槲皮甙等药用活性成分提取出来。
30.本发明在回流提取结束后进行过滤，滤液保留备用，滤渣加入溶剂再次重复前述回流提取过程，所述重复提取次数优选为1次。本发明将每次回流提取得到的滤液进行合并，对滤液进行减压浓缩处理。
31.本发明将滤液减压浓缩至原滤液体积的5～15％，当所述溶剂为水时更优选为浓缩至滤液体积的6～14％，当所述溶剂为乙醇溶液时更优选为浓缩至滤液体积的5～10％，当所述溶剂为甲醇溶液时更优选为浓缩至滤液体积的6～10％。
32.本发明对上述制备得到的浓缩液继续减压浓缩至干，得到固体粉末状细梗胡枝子提取物，所述提取物中含有较多的药物活性成分，具有药理活性。
33.本发明对上述制备得到的浓缩液依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，保留水溶部分，冷冻干燥，得固体粉末状细梗胡枝子提取物。本发明通过对浓缩液的进一步萃取处理，除去可溶于石油醚、乙酸乙酯和正丁醇的杂质成分，进一步提纯得到具有更高药理活性的细梗胡枝子提取物。本发明对具体的萃取方式、萃取剂用量和冷冻干燥方式不作限定。
34.本发明对上述制备得到的浓缩液采用正丁醇重复萃取2～3次，保留水溶部分，冷冻干燥，得固体粉末状细梗胡枝子提取物。本发明通过对浓缩液的进一步萃取处理，除去可溶于正丁醇的杂质成分，进一步提纯得到具有更高药理活性的细梗胡枝子提取物。本发明对具体的萃取方式、萃取剂用量和冷冻干燥方式不作限定。
35.本发明对上述石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取或正丁醇重复萃取所得的水溶部分以80％乙醇沉淀，醇溶部分冻干；沉淀部分用无水乙醇和/或丙酮洗涤，洗涤后剩余沉淀冻干。当同时使用无水乙醇和丙酮洗涤时，本发明对具体的洗涤顺序不作限定。本发明通过对水溶部分的进一步处理，可进一步提纯得到具有更高药理活性的细梗胡枝子提取物。本发明对具体的萃取方式、萃取剂用量和80％乙醇用量不作限定。
36.本发明还提供了上述制备得到的细梗胡枝子提取物在制备治疗耳炎的药物中的应用，细梗胡枝子提取物可显著改善小鼠耳部肿胀，具有显著的抗炎作用。
37.本发明还提供了上述制备得到的细梗胡枝子提取物在制备治疗肾炎的药物中的应用，细梗胡枝子提取物可显著降低肾炎小鼠血清bun、cre水平及脾指数，具有降低血清cho水平、减少肾炎小鼠24h尿蛋白量的趋势。作为一种可选的实施方式，本发明所述肾炎为多柔比星肾炎，可达到良好的抗多柔比星肾炎功效。
38.本发明还提供了上述制备得到的细梗胡枝子提取物在制备细胞修复的药物中的应用，细梗胡枝子提取物可显著缓解多柔比星诱导大鼠肾小管上皮nrk-52e细胞损伤，且随着浓度的提高，细梗胡枝子提取物的细胞恢复效果增强，表现出良好的细胞保护作用。
39.本发明还包括，用本发明的细梗胡枝子提取物作为药物活性成分制备成的药物组合物，所述药物可根据实际需要包括药学上可接受的辅料。
40.本发明的药物组合物可以是任何可药用的剂型，包括但不限于滴丸剂、片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。
41.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
42.在本发明实验结果表中：“*”表示与模型对照组比较p＜0.05，“**”表示与模型对照组比较p＜0.01，“***”表示与模型对照组比较p＜0.001；“#”表示与空白对照组比较p＜0.05，“##”表示与空白对照组比较p＜0.01，“###”表示与空白对照组比较p＜0.001。
43.实施例1
44.本实施例给出了细梗胡枝子水提取物的制备方法：
45.取细梗胡枝子500g，粉碎过80目筛，加入1.7l水煮沸，回流提取30min，过滤收集滤液；滤渣中再次加入1.7l水煮沸，回流提取30min，过滤；将两次所得滤液合并，减压浓缩至0.5l。
46.取0.25l浓缩液继续浓缩至干，得到细梗胡枝子水提取物，记为levh-1。
47.实施例2
48.本实施例取实施例1制备得到的另外0.25l浓缩液连续进行三次萃取处理：用0.1l石油醚萃取，分别保留萃取液和水溶部分；水溶部分再次用0.1l乙酸乙酯萃取，分别保留萃取液和水溶部分；水溶部分用0.1l正丁醇萃取，分别保留萃取液和水溶部分。三次萃取得到的萃取液分别减压浓缩至干，发泡成粉末，产物依次记为levh-2、levh-3、levh-4；三次萃取后得到的水溶部分直接冷冻干燥成粉末，得到细梗胡枝子水提取物，记为levh-5。
49.对实施例1～2制备得到的细梗胡枝子水提取物有效部位的提取记录见表1。(提取率＝提取得到的样品量
÷
原料总质量
×
100％)
50.表1 lev提取物记录表
[0051][0052]
实施例3
[0053]
取实施例2得到的细梗胡枝子水提取物(levh-5)10g，加入80％乙醇50ml进行沉淀，过滤分离沉淀，分别保留醇溶部分和沉淀部分。
[0054]
醇溶部分浓缩干燥得到固体产物，记为levh-6；
[0055]
沉淀部分继续用20ml 80％乙醇洗涤，洗涤液浓缩干燥得固体产物，记为levh-8；洗涤后的沉淀部分直接冷冻干燥，得细梗胡枝子水提取物，记为levh-7。
[0056]
对细梗胡枝子水提取物各有效部位的提取记录见表2。(提取率＝提取得到的样品量
÷
原料总质量
×
100％)
[0057]
表2 lev提取物记录表
[0058][0059]
实施例4
[0060]
取细梗胡枝子3000g，粉碎，加入10.2l水煮沸，回流提取30min，过滤收集滤液；滤渣中再次加入10.2l水煮沸，回流提取30min，过滤；将两次所得滤液合并，减压浓缩至3l。浓缩液冷却后，以1l正丁醇溶液萃取，保留水溶部分，水溶部分重复采用正丁醇萃取2次；合并萃取液，浓缩至干得固体产物，记为levh-4b；剩余水溶液继续浓缩至1l，取0.5l浓缩液继续浓缩至干，得到细梗胡枝子水提取物，记为levh-5b。
[0061]
实施例5
[0062]
取实施例4萃取后得到的另外0.5l浓缩液，加入80％乙醇2l进行沉淀，过滤分离沉淀，分别保留醇溶部分和沉淀部分。
[0063]
醇溶部分浓缩至干得固体产物，记为levh-6b；
[0064]
沉淀部分浓缩至干得固体产物，记为levh-7b。
[0065]
实施例6
[0066]
取实施例5制备得到的levh-7b样品5g(不含水)，依次用20ml无水乙醇和20ml丙酮洗涤，洗涤液浓缩至干分别得产物levh-8b和产物levh-9b。
[0067]
实施例7
[0068]
本实施例给出了细梗胡枝子乙醇提取物的制备方法：
[0069]
取细梗胡枝子500g，粉碎后放入10l圆底烧瓶，加入40％乙醇水5l，回流提取1h，过滤收集滤液；药渣中再加入40％乙醇水4l，回流1h，两次的滤液合并，浓缩至体积为700ml。
[0070]
取浓缩液350ml直接冻干，得细梗胡枝子乙醇提取物，记为leve-1。
[0071]
实施例8
[0072]
取实施例7剩余浓缩液350ml，连续进行三次萃取处理：用150ml石油醚萃取，分别保留萃取液和水溶部分；水溶部分再次用100ml乙酸乙酯萃取，分别保留萃取液和水溶部分；水溶部分用100ml正丁醇萃取，分别保留萃取液和水溶部分。三次萃取得到的萃取液分别减压浓缩至干得固体产物依次记为leve-2、leve-3、leve-4；萃取后得到的水溶部分继续浓缩干燥，得到细梗胡枝子乙醇提取物，记为leve-5。
[0073]
对实施例7～8制备得到的细梗胡枝子乙醇提取物有效部位的提取记录见表3。(提取率＝提取得到的样品量
÷
原料总质量
×
100％)
[0074]
表3 lev提取物记录表
[0075]
[0076]
实验例1
[0077]
本实施例研究了细梗胡枝子提取物对小鼠耳炎的保护作用。
[0078]
1.小鼠选择：
[0079]
动物品质：balb/c小鼠，雄性，spf级，18-20g，北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：(京)2012-0001。
[0080]
动物饲养环境：空调，室温21～25℃；湿度45
±
20％，通风10次/小时全新风。人工光照12小时。自由进食进水。
[0081]
实验前适应期：按要求引进并检验动物后，动物分笼饲养，每笼5只，适应观察3天，观察动物一般情况，适应期结束称量体重。
[0082]
采用巴豆油诱导小鼠耳炎模型，角叉菜胶耳炎模型，二硝基氟苯(dnfb)诱导小鼠迟发型超敏反应(dth)模型。
[0083]
2.实验仪器：
[0084]
分析天平：bs 224s型，satorius；酶标仪：power wave xs2，biotek；血生化分析仪：accute 40r，toshiba。
[0085]
3.实验方法：
[0086]
3.1组别与剂量设置：
[0087]
空白对照组：注射等剂量溶媒(生理盐水)；
[0088]
模型对照组：注射等剂量溶媒(生理盐水)；
[0089]
高剂量组：200mg/kg体重，皮下注射；
[0090]
中剂量组：100mg/kg体重，皮下注射；
[0091]
低剂量组：20mg/kg体重，皮下注射；
[0092]
高、中、低剂量组均采用实施例1～4制备得到的细梗胡枝子提取物粉末1g，分别溶于5，10，50ml生理盐水中，得到注射用药。
[0093]
3.2模型建立及给药：
[0094]
3.2.1巴豆油诱导小鼠耳炎模型
[0095]
balb/c小鼠随机分组，每组10只，皮下注射细梗胡枝子提取物(200mg/kg)1次，对照组给予等体积的药物溶媒。末次给药1h后，于小鼠右耳两面涂巴豆油0.02ml致炎，左耳作为正常对照。致炎1h后颈部脱臼处死小鼠，用直径6mm打孔器分别取下左右耳相同位置的耳片，称重，左右耳片质量差值表示炎性肿胀度，利用肿胀度计算各组对小鼠巴豆油耳炎的抑制率(ir％)＝(模型组平均耳肿胀度-给药组耳肿胀度)/模型组平均耳肿胀组
×
100％]，结果见表4。
[0096]
表4 lev提取物对小鼠巴豆油耳炎的抑制作用
[0097][0098]
由表4可知，与模型组比较，leve-1(p＜0.01)，leve-5(p＜0.05)，levh-1(p＜0.001)，levh-2(p＜0.01)，levh-4(p＜0.001)，levh-5(p＜0.001)，levh-6(p＜0.001)，levh-7(p＜0.001)。
[0099]
结果显示，leve-1，leve-5，levh-1，levh-2，levh-4，levh-5，levh-6，levh-7样品给药可显著改善小鼠巴豆油耳炎，其他组给药后对小鼠巴豆油耳炎均未见显著影响。
[0100]
3.2.2dnfb诱导的小鼠dth模型
[0101]
balb/c小鼠随机分组，每组10只，皮下注射细梗胡枝子提取物(100mg/kg)1次，对照组给予等体积的药物溶媒。给药1h后，对照组以不含dnfb的溶剂处理，dth组以5g/l dnfb腹部致敏、耳廓激发的方法建立模型。激发后48h，用直径6mm打孔器分别取下左右耳相同位置的耳片，称重，左右耳片质量差值表示炎性肿胀度，利用肿胀度计算各组抑制率(ir％)，各组对小鼠dth复筛结果见表5。
[0102]
表5 lev提取物对小鼠dth模型的抑制作用
[0103][0104]
由表5可知，与模型组比较，leve-1(p＜0.05)，levh-1(p＜0.05)，levh-2(p＜0.05)，levh-7(p＜0.01)。
[0105]
表5结果显示，leve-1，levh-1，levh-2，levh-7样品给药可显著改善小鼠耳部肿胀，其他组给药后对小鼠耳部肿胀未见显著影响。
[0106]
3.2.3角叉菜胶诱导小鼠耳炎模型
[0107]
balb/c小鼠随机分组，每组10只，皮下注射细梗胡枝子提取物(20mg/kg的给药剂量皮下注射胡枝子提取物，每天1次，连续6天)，对照组给予等体积的药物溶媒。末次给药1h后，于小鼠右耳两面涂角叉菜胶0.02ml致炎，左耳作为正常对照。致炎1h后颈部脱臼处死小鼠，用直径6mm打孔器分别取下左右耳相同位置的耳片，称重，左右耳片质量差值表示炎性肿胀度，利用肿胀度计算各组抑制率(ir％)，各组对小鼠角叉菜胶炎症复筛结果见表6。
[0108]
表6 lev提取物对小鼠角叉菜胶炎症模型的作用
[0109][0110]
由表6可知，与模型组比较，levh-7样品给药可显著改善小鼠耳部肿胀(p＜0.05)，其他组给药后对小鼠耳部肿胀未见显著影响。
[0111]
综上结果显示，leve-1，leve-5，levh-1，levh-2，levh-4，levh-5，levh-6，levh-7可显著改善小鼠巴豆油耳炎；在二硝基氟苯(dnfb)诱导的小鼠迟发型超敏反应(dth)模型中，胡枝子提取物中剂量组给药后，leve-1，levh-1，levh-2，levh-7样品给药可显著改善小鼠耳部肿胀；在小鼠角叉菜胶耳炎模型中，胡枝子提取物低剂量组给药后，levh-7样品给药可显著改善小鼠耳部肿胀。可见，胡枝子提取物对小鼠耳炎具有一定的疗效。
[0112]
实验例2
[0113]
本实施例研究了细梗胡枝子提取物对小鼠多柔比星肾炎的保护作用。
[0114]
1.小鼠选择：
[0115]
动物品质：balb/c小鼠，雄性，spf级，18-20g，北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：(京)2012-0001。
[0116]
动物饲养环境：空调，室温21～25℃；湿度45
±
20％，通风10次/小时全新风。人工光照12小时。自由进食进水。
[0117]
实验前适应期：按要求引进并检验动物后，动物分笼饲养，每笼5只，适应观察3天，观察动物一般情况，适应期结束称量体重。
[0118]
2.多柔比星：纯度98％，货号t1020，cas号25316-40-9，target mol公司。
[0119]
3.实验方法：
[0120]
3.1组别与剂量设置：
[0121]
空白对照组：等剂量溶媒(生理盐水)；
[0122]
模型对时组：等剂量溶媒(生理盐水)；
[0123]
高剂量组：5.0g/kg，0.5g/ml，0.1ml/10g；
[0124]
低剂量组：2.5g/kg，0.25g/ml，0.1ml/10g；
[0125]
(高剂量组中，5.0g/kg是每千克小鼠给药质量；0.5g/ml是表示每ml溶媒溶解0.5g提取物；0.1ml/10g是指每10克小鼠用0.1ml溶媒；低剂量组同理。高低剂量组中药物均选择实施例3中制备得到的levh-7)
[0126]
3.2模型建立及给药：
[0127]
balb/c小鼠40只，随机分成4组，每组10只，称重。除空白对照组(给予等体积溶媒)外，各组动物一次性尾静脉注射阿霉素(10mg/kg)建立小鼠阿霉素肾炎模型；于造模后第8天开始灌胃给药，每天1次，连续21天；末次给药后，收集尿液，24h后处死小鼠，取材，进行指标检测。
[0128]
4.实验结果：
[0129]
4.1动物一般生长情况：
[0130]
动物每7天称体重1次，体重0为造模前初始体重，体重1为造模后体重，体重2为第一周后体重，体重3为第二周后体重，体重4为第三周后体重，观察药物对体重的影响情况，
结果见表7。
[0131]
表7.lev提取物对多柔比星肾炎小鼠体重的影响(mean
±
std,n＝10)
[0132][0133]
由表7可知，与空白对照组比较，模型对照组造模后体重显著降低(p＜0.05或0.01)；与模型组比较，细梗胡枝子提取物给药后对造模体重的减低未见显著影响(p＞0.05)。
[0134]
4.2 24h尿蛋白量：
[0135]
细梗胡枝子提取物对多柔比星肾炎小鼠24小时尿蛋白量检测结果见表8。
[0136]
表8.lev提取物对肾炎小鼠24h尿蛋白量的影响(mean
±
std,n＝3)
[0137][0138]
由表8可知，与空白对照组比较，多柔比星造模型后小鼠尿蛋白量显著增高(p＜0.01)；而与模型组对照组比较，细梗胡枝子提取物可降低肾炎小鼠24小时尿蛋白量，但未见显著性差异(p＞0.05)。
[0139]
4.3血生化检测：
[0140]
对小鼠血清的各生化指标进行检测，结果见表9。
[0141]
表9.lev提取物对肾炎小鼠血清生化检测结果的影响(mean
±
std,n＝10)
[0142][0143]
由表9可知，与空白对照组比较，多柔比星肾炎小鼠血清bun、cre以及cho水平显著升高(p＜0.05或0.01)；细梗胡枝子提取物给药后可降低肾炎小鼠血清bun、cre以及cho水平，其中，高剂量组bun和cre与模型组比较差异有显著性(p＜0.05或0.01)。
[0144]
4.4脏器指数：
[0145]
对小鼠的肾脏、胸腺和脾脏脏器指数进行检测，结果见表10。
[0146]
表10.lev提取物对肾炎小鼠脏器指数的影响(mean
±
std,n＝10)
[0147][0148]
由表10可知，与空白对照组比较，多柔比星肾炎小鼠脾指数显著增高，而细梗胡枝子提取物给药后可显著降低肾炎小鼠脾指数(p＜0.05或0.01)；细梗胡枝子提取物给药后对肾炎小鼠肾指数及胸腺指数均未见显著影响。
[0149]
综上结果显示，细梗胡枝子提取物高剂量组给药后可显著降低肾炎小鼠血清bun、cre水平及脾指数；具有降低血清cho水平、减少肾炎小鼠24h尿蛋白量的趋势。表明细梗胡枝子提取物对多柔比星诱导小鼠肾炎具有一定的疗效。
[0150]
实验例3
[0151]
本实施例研究了细梗胡枝子提取物对大鼠肾小管上皮nrk-52e细胞损伤的保护作用。
[0152]
1.实验仪器和材料
[0153]
dmso：solarbio d8371，二甲基亚砜，细胞培养；
[0154]
多柔比星：纯度98％，货号t1020，cas号25316-40-9，target mol公司；
[0155]
地塞米松：dexamethasone，cas号50-02-2，货号b76795，innochem，1g；
[0156]
万分之一电子天平：me-104，mettler；超声波清洗机：深超洁。
[0157]
2.实验模型构建
[0158]
细胞系：nrk-52e cell
[0159]
采用多柔比星诱导大鼠肾小管上皮nrk-52e细胞损伤模型。
[0160]
3.实验方法：
[0161]
3.1实验步骤：
[0162]
将处于对数生长期的nrk-52e细胞调整密度至0.5
×
105个/ml，1
×
105个/ml，按每孔100μl的密度接种于96孔板，37℃，5％co2的培养箱中培养4h贴壁；每孔分别加入等剂量溶媒或胡枝子提取物组预孵育1h；空白对照组加入等剂量溶媒，其他组加入0.5ug/ml阿霉素处理24h；cck8检测细胞活性。
[0163]
3.2组别与剂量设置：
[0164]
空白对照组：等剂量溶媒(生理盐水)；
[0165]
模型对照组：等剂量溶媒(生理盐水)；
[0166]
阳性对照组：10um地塞米松；
[0167]
提取物低剂量组：10ug/ml；
[0168]
提取物中低剂量组：50ug/ml；
[0169]
提取物中高剂量组：100ug/ml；
[0170]
提取物高剂量组：200ug/ml；
[0171]
(提取物均选择提取工艺部分实施例3中制备得到的levh-7)
[0172]
4.实验结果
[0173]
细梗胡枝子提取物对多柔比星诱导大鼠肾小管上皮nrk-52e细胞损伤模型的影响见表11。
[0174]
表11.lev提取物对多柔比星诱导大鼠肾小管上皮nrk-52e细胞损伤模型的影响(mean
±
sd,n＝6)
[0175][0176]
由表11可知，与正常对照组比较，多柔比星诱导后nrk-52e细胞活性显著降低(p＜0.001)；与模型对照组相比，阳性药地塞米松可以显著增加多柔比星诱导后的nrk-52e细胞活性(p＜0.001)；与模型对照组相比，细梗胡枝子提取物的低、中低、中高、高浓度均可显著减轻多柔比星诱导大鼠肾小管上皮nrk-52e细胞损伤(p＜0.001)，且随着浓度的升高，细梗胡枝子提取物的作用效果越好；且在低、中低、中高、高浓度浓度下，细梗胡枝子提取物均未表现出明显的细胞毒性。表明，细梗胡枝子提取物可显著缓解多柔比星诱导大鼠肾小管上皮nrk-52e细胞损伤，且随着浓度的提高，细梗胡枝子提取物的细胞恢复效果增强。
[0177]
实验例4
[0178]
本实施例提供了一种含细梗胡枝子提取物的胶囊剂：取细梗胡枝子提取物20g，加入糊精29.5g，硬脂酸镁0.5g，充分拌均匀后，按胶囊制备法制成1000粒，填装于50mg胶囊，每粒含细梗胡枝子提取物20mg。
[0179]
实验例5
[0180]
本实施例提供了一种含细梗胡枝子提取物的片剂：取细梗胡枝子提取物20g，加入淀粉20g，糊精16g，蔗糖3g，充分搅拌混匀，制成颗粒，在60℃以下干燥，加入适量硬脂酸镁、滑石粉，混匀，压制成1000片，包糖衣或薄膜衣，即得。
[0181]
实验例6
[0182]
本实施例提供了一种含细梗胡枝子提取物的颗粒剂：取细梗胡枝子提取物20g，加入适量蔗糖和糊精，按颗粒剂制法制成颗粒，干燥，制得1000g。
[0183]
实验例7
[0184]
本实施例提供了一种含细梗胡枝子提取物的口服液：取细梗胡枝子提取物20g，加水溶解，以5％氢氧化钠调节ph值至7.0，搅匀，4℃冷藏48小时，滤过，滤液加入蔗糖60g，搅匀使溶解，再加入适量香精并调节ph值至7.0，加水制成1000ml，搅匀，静置12小时，滤过，灌
装，灭菌，即得。
[0185]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种细梗胡枝子提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：细梗胡枝子粉碎，加入水或醇溶剂回流提取0.5～3h，过滤，滤渣加入溶剂重复提取1～2次，过滤，合并滤液，减压浓缩得浓缩液，即为细梗胡枝子提取物。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述水的添加量为2～5l/kg，所述醇溶液为20～60％醇溶液，其添加量为6～12l/kg。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述浓缩液继续减压浓缩至干。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述浓缩液依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，保留水溶部分，冷冻干燥。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述浓缩液采用正丁醇萃取2～3次，保留水溶部分，冷冻干燥。6.根据权利要求4～5任一项所述的方法，其特征在于，所述水溶部分以80％乙醇沉淀，醇溶部分冻干。7.根据权利要求4～5任一项所述的方法，其特征在于，所述水溶部分以80％乙醇沉淀，沉淀部分用无水乙醇和/或丙酮洗涤，洗涤后剩余沉淀冻干。8.权利要求1～7任一项所述制备方法得到的细梗胡枝子提取物在制备治疗炎症的药物中的应用，优选，所述炎症包括耳炎和/或肾炎。9.权利要求1～7任一项所述制备方法得到的细梗胡枝子提取物在制备用于细胞修复的药物中的应用。10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有有效剂量的权利要求1-7任一项所述制备方法得到的细梗胡枝子提取物和药学上可接受的辅料。

技术总结
本发明提供了一种细梗胡枝子提取物及其制备方法和应用，属于医药技术领域。本发明将细梗胡枝子粉碎，加入溶剂回流提取0.5～3h，过滤，滤渣加入溶剂重复提取1～2次，过滤，合并滤液，减压浓缩至滤液体积的5～15％，得浓缩液。本发明对浓缩液进行分别纯化处理得到细梗胡枝子提取物。本发明通过将细梗胡枝子提取物和医学上可接受的辅料配比，可得到用于治疗耳炎和/或肾炎的药物，并且所得细梗胡枝子提取物对细胞损伤有保护作用，可用于制备细胞修复的药物。药物。


技术研发人员：郑稳生 姚春所 林明宝 李鹤 张秀立 侯琦 李艳秋 张宇佳 谭晓川 孟雅
受保护的技术使用者：中国医学科学院药物研究所
技术研发日：2022.01.26
技术公布日：2023/8/4