一种空间代谢组高阶特征信息的提取、测量与质谱成像可视化方法

1.本发明属于生物分析检测技术领域，涉及一种临床前候选药物在体内活性作用部位及强度评估，或临床疾病病理诊断的质谱成像分析方法，可以应用于探究药物潜在作用部位、分子靶标及分子机理的预测和临床疾病分子病理诊断。


背景技术：

2.质谱成像(mass spectrometry imaging,msi)是一种将解吸离子化技术与质谱检测分析相结合的分子成像技术。通过对样本表面(多为生物组织样本)进行逐行或者逐点地解吸附、电离、与离子信号的质谱采集，将不同质荷比离子的信号强度值按照物理空间位置，依次重构出二维数据阵并以图像形式展示。它无需放射性同位素、荧光或免疫标记，不仅可以直接获得生物样本内药物及其代谢产物的空间分布信息，还可以提供复杂生物基质中内源性代谢物分子组成信息。因此，质谱成像在评价药物治疗效果、预测潜在毒副作用及探究分子机制等临床前药物研发领域具有重要的应用价值。
3.虽然质谱成像可以探究药物干预下，病灶部位的代谢物分子组成变化以及相关的感兴趣代谢物空间分布信息，但仅以任何单一代谢物作为药物治疗或毒副作用分子指标，仍不能全面描述药物对于机体的复杂影响。除了代谢物离子的相对丰度外，还有许多更抽象的生物信息无法从质谱图中直接读出，例如药物对机体整体代谢状态、代谢通路、某类结构代谢物或生物转化的影响变化等，而这些更抽象的生物信息有助于对药物的功效和安全性有更基本的了解，所以需要从众多代谢物离子信息中提取出可以反映上述抽象生物信息特征及其空间变化的新变量，以便更加客观地对临床前候选药物的药效与潜在毒副作用进行评价与比较。目前，尚未有相关质谱成像方法及软件开发，来直观展现空间可分辨的整体代谢轮廓状态、具体代谢功能的高阶代谢组特征，因此，本发明拟建立一种基于多维向量距离量度的空间代谢组高阶特征提取、测量与质谱成像可视化方法。


技术实现要素：

4.本发明要解决三方面的技术问题：(1)基于空间代谢轮廓差异的生物组织同质区域划分；(2)质谱成像代谢物离子信息库的建立；(3)空间代谢组高阶特征的提取与代谢扰动评分测量，该方法总体技术流程示意图见附图1。
5.为解决上述技术问题，本发明提供详细技术方案步骤如下：
6.步骤1.生物组织样本的质谱成像数据采集：
7.采用真空或常压敞开式离子源例如空气动力辅助离子化(afai)、解吸电喷雾离子化(desi)、基质辅助激光解吸离子化(maldi)、二次离子质谱(sims)，对完整整体动物组织冰冻切片或肿瘤组织冰冻切片进行解吸离子化，经过单一通道、极性全扫描采集(positive or negative full scan)或多通道、正负极性交替全扫描采集(alternatively positive and negative full scans)等方法收集质谱成像数据。
8.步骤2.质谱成像数据结构的前处理：
9.该步骤分为三个子步骤对步骤1采集到的质谱成像数据进行前处理
10.2.1数据结构转化：从生物组织样本中采集到质谱成像原始数据，是一个由采集行、采集列、不同质荷比所组成的多维阵列。首先，对多维阵列进行降维，转变成由生物组织样本全部像素点
×
全部代谢物离子强度组成的二维数据阵，并对每一个像素点所在的物理空间位置进行行、列索引编码，以便于提取二维数据阵的某列代谢物离子强度信息进行图像重构。
11.2.2同质区域划分：以步骤2.1得到的二维数据阵中的代谢物离子强度为输入特征变量，通过机器学习方法，对整个生物组织样本二维数据矩阵进行像素点所属区域识别，实现对整个生物组织样本的同质区域归划分，并标记每个像素点的同质区域类别标签；
12.2.3生物组织样本矩阵的拆分与重组：根据步骤2.2得到的生物组织样本内各像素点的同质区域类别标签，将各个生物组织样本的二维数据矩阵分别拆分为若干个同质区域子矩阵，将源于不同生物组织样本的同质区域子子矩阵重新组合为一个同质区域矩阵(附图2)；
13.步骤3.质谱成像代谢物离子信息库的建立：在生物组织样本平均质谱图中选择相对丰度大于0.1％的离子质荷比，经过开源代谢组学数据库检索，对所有离子进行代谢物信息标注与结构鉴定；构建质谱成像代谢物离子的化学及生物信息数据，其录入条目包括离子精确质荷比、加合离子类型、所属代谢物结构类型、代谢通路、生物学功能、生物转化类型，并对这些信息条目按类别分别编辑检索索引，用于后续某一类特征代谢物的提取，信息库具体示例见附图3，录入的生物功能、代谢物类型、生物转化和代谢通路条目汇总见附表1。
14.步骤4.高阶特征信息的选择与提取，该步骤分为两个子步骤进行：
15.4.1高阶特征信息的选择：该步骤可以有两种具体实施方式：一种是非目标性高阶特征信息提取，该方式适用于候选药物体内作用预测与评价初级阶段，即没有特定关注的代谢通路、生物学功能、代谢物类型或生物转化类型，所以需要将步骤3中构建的质谱成像代谢物离子信息库中的全部离子信息来表征整体代谢轮廓，作为区域整体代谢轮廓矩阵；另一种是目标性的高阶特征信息提取，即只提取受关注代谢通路、生物学功能、生物转化类型、代谢物结构类型等生物信息的检索索引，组成检索向量，并利用该检索向量，提取区域矩阵中各像素对应的初级特征代谢物群，组成区域特征矩阵。
16.4.2高阶特征信息的提取：对步骤4.1中所述的整体代谢轮廓或初级特征代谢物群的离子强度信息进行线性或非线性降维，生成可反映整体代谢轮廓或特定代谢特征差异的新变量。降维方法包括提取主成分、非负矩阵因子化、t-分布邻域嵌入。
17.步骤5.在高阶特征空间内测量代谢扰动变化量：
18.将步骤4中多个代谢物组成的多维特征向量，降维到二维或三维高阶特征信息空间后，对二维或三维高阶特征信息空间中处于不同位置的生物组织样本像素点进行聚类，确定并计算对照组像素点簇的簇心，以及其他组生物组织样本各像素点到该簇心之间的距离，作为药物干预作用下各像素点对应空间位置的代谢扰动评分。
19.步骤6.代谢扰动变化量的可视化：
20.在步骤5得到各同质区域矩阵中的像素点代谢扰动评分后，按照各像素点所属生
物组织样本及像素位置索引，重新填充到对应的物理空间位置，即可得到药物作用下各生物组织样本代谢扰动图像。
21.有益技术效果：
22.本发明建立的空间代谢组高阶特征的提取、测量与质谱成像可视化方法，可以在候选药物临床前药效与毒副反应评估、分子机理研究方面产生有益技术效果。具体如下：(1)对候选药物在受试动物体内作用部位及作用强度进行可视化预测；(2)对候选药物在受试动物体内非靶器官或组织等造成的毒副作用进行可视化预测；(3)对候选药物在受试动物体内具体作用的代谢通路、代谢功能、生物转化等高阶代谢特征进行量化评估；(4)有助于发现新的药物作用靶标及潜在分子机制。
附图说明
23.图1.整体动物空间代谢组高级特征提取、测量与质谱成像可视化流程图。(a)在正/负切换质谱采集模式下从对照组和受试组整体动物切片中收集空间分辨代谢组学数据；(b)将采集到的各像素点质谱图转化为对照组和受试组代谢组数据矩阵，每个像素都分配有属于不同区域的标签索引，两个矩阵中来自同一类型区域的若干行像素数据被提取并重构为一个新的同质区域矩阵；(c)根据预先构建的代谢物信息库中的代谢物检索向量，提取同属于某一生物功能、代谢途径、生物转化或代谢物种类的若干代谢物离子数据(列)，构成区域特征矩阵；(d)利用降维方法，从区域特征矩阵的高维数据中提取出两个高阶特征；(e)将各像素按照其高阶特征值映射到二维或三维高阶特征空间，在该空间内计算参照组像素点簇的簇心，以及受试组各像素点到该簇心之间的距离；(f)通过计算受试组像素的距离平均值来得到主要器官的代谢扰动评分；(g)对所有生物组织像素点的距离值重新按物理空间位置进行重构得到的整体动物空间代谢扰动图像。
24.图2.质谱成像数据结构转化的示意图。
25.图3.质谱成像代谢物离子信息库的信息组成局部示意图。
26.图4.整体动物和肿瘤组织的同质区域识别结果。(a)机器学习方法预测的整体动物同质区域划分；(b)机器学习方法预测的肿瘤组织亚区域划分；(c)开发的机器学习模型对整体动物各个同质区域和肿瘤组织亚区域的预测结果。tpr：真阳性率；fnr：假阴性率；ppv：正预测值；fdr：错误发现率。
27.图5.用于表征药物对机体全身各器官整体代谢状态影响的代谢扰动评分图像.(a)健康对照组；(b)肿瘤模型组；(c)阳性对照药物组；(d)受试药物低剂量组；(e)受试药物中剂量组；(f)受试药物高剂量组
28.图6用于表征药物抗肿瘤代谢作用强度的代谢扰动评分图像.(a)健康对照组；(b)肿瘤模型组；(c)阳性对照药物组；(d)受试药物低剂量组；(e)受试药物中剂量组；(f)受试药物高剂量组
29.图7对肿瘤特定代谢途径的代谢扰动评分排序。(a)阳性对照药与受试药物对不同类型生物转化的影响排序；(b)阳性对照药与受试药物对不同代谢通路的影响排序；(c)阳性对照药与受试药物对不同类型代谢物的影响排序。pts：受试药物组；ptx：阳性对照药物组
具体实施方式
30.本发明以抗肿瘤药物紫杉醇(ptx)及候选药物
‑‑
紫杉醇衍生物(ptr)为实施例，总体流程如图1所示，将具体实现步骤做详细说明，但本实施例不以任何方式限定本发明。
31.1.生物组织冰冻切片的制备
32.采用leica cm3600大型冰冻切片机制备厚度为25μm的整体动物冰冻切片，采用leica cm1860型切片机制备厚度为12μm的异体移植瘤冰冻切片，实验样本分为制备健康对照组、移植瘤模型动物组、阳性对照药物组(ptx)和低、中、高三剂量受试药物(ptr)组，将制备的生物组织样本先置于-20摄氏度低温环境下的干燥皿中真空干燥1小时，再将干燥皿移至室温环境继续干燥2小时，切片温度恢复至室温，待用。
33.2.整体动物和肿瘤组织切片样本的质谱成像数据采集
34.将自主研发搭建的afai离子源与静电场轨道阱质谱仪(q orbitrap,thermo fisher公司)联用，进行整体动物和肿瘤组织切片样本的数据采集与成像分析。关键参数如下：喷针电压与传输管电压分别设置为
±
7.5kv和
±
3.0kv。喷雾溶剂为：乙腈-水(7:3,v/v)，喷雾溶剂流速5μl/min。质谱数据收集采用正、负离子全扫描(positive full scan/negative full scan)交替采集方法，分别对质荷比范围在m/z 100-1000内的代谢物离子进行数据采集，将动态采集模式(agc)设置关闭，以保证质谱扫描速度恒定，扫描速度设置为100ms。二维载物平移台的横向(x轴)移动速度为0.2mm/sec，纵向(y轴)的行间距设置为0.2mm，驱使生物组织样本不同物理空间位置的代谢物成分依次被afai离子源喷针解吸、电离并引入质谱。
35.采用thermo公司xcalibur软件自带的格式转换器(file converter)，先将raw格式原文件转换为cdf格式文件，并导入matlab2021a(mathworks公司)环境中，利用自带cdfread函数对cdf文件进行批量读取与保存。后续各步骤操作均在matlab2021a环境中利用利用自行编写的脚本代码执行。
36.3.质谱成像数据结构转换
37.对自建的质谱成像代谢物离子信息库中收录的共计1817个离子(1318个正离子，499个负离子)作为初始特征，对6组整体动物和肿瘤组织样本中检测到的上述离子进行图像重构(质荷比容差设定为
±
0.005)。先将全部图像保存在一个多维阵列中，再转化为“像素点-代谢物离子”二维数据矩阵，该矩阵共收集到来自6个不同组生物样本合计12764个像素点的1817个代谢物离子强度数据。
38.4.同质区域的划分
39.以全部的1817个离子作为输入变量，通过t-sne算法对各组样本的全部像素点进行无监督聚类分析，在整体动物和肿瘤样本光学图像的指导下，并初步标记各个像素点的类别标签，剔除明显标记错误的像素点数据，仅保留标记可信度高的像素点数据，作为机器学习模型建立中的训练数据，类别标签如下：心(label＝1)、肺(label＝2)、脾(label＝3)、肾(label＝4)、脑(label＝5)、肝(label＝6)、胃(label＝7)、肠道(label＝8)、肌肉(label＝9)、胸腺(label＝10)、皮肤(label＝11)、唾液腺(label＝12)、下颌(label＝13)、肠道内容物(label＝14)、骨骼(label＝15)肿瘤实质区(label＝16)、坏死区(label＝17)、基座(label＝18)。
40.先将全部像素点按照70％：15％：15％比例随机划分为训练集、验证集和测试集，
在matlab2021a的分类学习应用中(classification learner app)，考察k-均聚类(kmeans)、k-近邻算法(knn)、随机森林(rf)、支持向量机(svm)、线性判别分析(lda)、浅层神经网络(nn)模型的训练与预测效果，以受试者工作曲线下面积(area under curve，auc)、真阳性率(true positive rate,tpr)、假阴性率(false negative rate,fnr)；正预测值(positive prediction value,ppv)、错误发现率(false discovery rate,fdr)等指标作为训练模型对同质区域预测性能的指标，最终选择knn作为最佳机器学习模型，预测结果见附图4。经过机器学习，将6组整体动物和肿瘤组织内的不同区域像素点进行了准确标记，根据像素点的区域类别标签，将各个生物组织样本二维数据阵拆分为若干个子矩阵，并将相同类别标签的子矩阵重组为一个区域矩阵，最终整体动物及肿瘤组织内共计生成18个同质区域矩阵。
41.6.高阶特征信息的提取与代谢扰动变化量测量
42.在候选药物体内作用预测与评价初级阶段，选取全部的1817个代谢物离子表征整体代谢轮廓，在特定生物功能、代谢通路、代谢物类型或生物转化影响评价时，根据质谱成像代谢物离子信息库中录入的57个类型(见表1)，依次提取相应的初级特征代谢物群，通过t-sne方法先将上述18个同质区域矩阵中的12764个像素点数据，降维到二维或三维高阶特征空间，采用高斯混合模型(gaussian mixed model，gmm)方法计算对照组像素点簇的簇心，采用欧氏距离(euclidean distance)作为测度，计算每一个同质区域矩阵内各像素点到簇心之间的距离，作为药物干预作用下各像素点对应空间位置的代谢扰动评分。
43.表1
44.45.[0046][0047]
7.代谢扰动变化量的可视化
[0048]
在分别得到18个同质区域矩阵中的12764个像素点代谢扰动评分后，重新按照各像素点所属的6组样本及组内像素位置索引，重新填充到对应的物理空间位置，即可得到药物作用下各生物组织样本代谢扰动图像。肿瘤代谢及药物干预下，整体动物层次的整体代谢轮廓扰动图像见附图5，由此图可以判断出，受试药物ptr对脾脏代谢具有显著影响，且随药物剂量增强，提示该受试药物应对脾脏区域的毒副反应予以重点关注。肿瘤代谢及药物干预下，肿瘤层次的整体代谢轮廓扰动图像见附图6，由此图可以判断出，阳性对照药ptx和受试药物ptr均能够有效抑制肿瘤代谢，两种药物具有对肿瘤代谢具有较大影响的代谢通路、代谢物类型、代谢功能和生物转化途径见附图7。

技术特征：
1.一种空间代谢组学高维度特征信息的提取测量与质谱成像可视化分析方法，主要包括以下步骤：(1)生物组织样本的质谱成像数据采集：采用真空或常压敞开式离子源对若干组生物组织样本进行解吸离子化和质谱数据采集，将获得的质谱数据进行代谢物离子图像重构；(2)质谱成像数据结构的前处理：(i)数据结构转化：将采集到的全部代谢物离子图像集，转化为“生物组织像素点-代谢物离子”二维数据矩阵；(ii)像素索引编辑：对生物组织样本像素点在图像中的空间位置编辑行、列索引；(iii)同质区域划分：对生物组织样本各像素点采集到的代谢物离子作为输入特征，并通过机器学习方法，对生物组织样本的全部像素点进行聚类分析，并标记区域类别标签；(iv)生物组织样本矩阵的拆分与重组：根据生物组织样本内各像素点的区域类别标签，将各个生物组织样本矩阵拆分为若干个子矩阵，并将各生物组织样本相同类别标签的子矩阵重组为一个区域矩阵；(3)质谱成像代谢物离子信息库的建立：构建质谱成像所检出全部代谢物的化学及生物信息数据，并对这些信息条目按类别分别编辑检索索引，用于后续某一类特征代谢物的提取；(4)初级特征信息的选择与高阶特征信息的提取：将质谱成像代谢物离子信息库中的全部离子作为被选取的特征以表征整体代谢轮廓，组成区域整体代谢轮廓矩阵；或者在质谱成像代谢物离子信息库中，找出与某一特定代谢通路、生物学功能、生物转化类型或化学结构类型相关的检索索引，组成检索向量，利用检索向量，提取区域矩阵中各像素对应的初级特征代谢物群，组成区域特征矩阵；将区域整体代谢轮廓矩阵或者区域特征矩阵中，由特征代谢物组成的多维特征向量，降维到二维或三维高阶特征信息空间；(5)在高阶特征信息空间内测量代谢扰动变化量：对二维或三维高阶特征信息空间中处于不同位置的各组生物组织样本像素点进行聚类，计算对照组像素点簇的簇心，以及其他组生物组织样本各像素点到该簇心之间的距离，作为药物干预或疾病病理作用下各像素点对应空间位置的代谢扰动评分；(6)代谢扰动变化量的可视化：将各区域矩阵中的像素点代谢扰动评分，按照所属生物组织样本及像素索引，重新填充到对应的空间位置，得到药物作用下各生物组织样本代谢扰动图像。2.根据权利要求1的分析方法，其特征在于，在(1)所述的生物组织样本的质谱成像数据采集，所述的生物组织样本包括临床前试验动物来源的实质脏器或空腔脏器、异体移植实体瘤、整体动物全器官切片；所述实质脏器包括心、脑、肾、肝、脾、肺、胸腺，所述空腔脏器包括食管、胃、小肠、大肠；所述的生物组织样本包括临床术后组织或腔镜取样的组织，保留术后肿瘤组织、癌旁组织、正常组织或其他病变组织。3.根据权利要求1的分析方法，其特征在于，在(1)所述生物组织样本的质谱成像数据采集，所述真空或常压敞开式离子源，包括空气动力辅助离子化(air-flow assisted ionization，afai)、解吸电喷雾离子化(desorption electrospray ionization，desi)、基质辅助激光解吸离子化(matrix-assisted laser desorption ionization，maldi)、二次离子质谱(secondary ionization，si)、激光剥蚀电喷雾离子化(laser ablation electrospray ionization，laesi)。4.根据权利要求1的分析方法，其特征在于，在(1)所述生物组织样本的质谱成像数据
的采集，所述质谱数据采集，用于采集代谢物离子的信息，包括靶向选择离子检测、多反应监测、全扫描采集、靶向选择离子检测与正负离子全扫描交替采集。5.根据权利要求1的分析方法，其特征在于，在(1)所述生物组织样本的质谱成像数据采集，所述代谢物包括氨基酸、寡肽、碳水化合物、嘌呤、嘧啶、酯酰肉碱、脂肪酸、甘油酯类、磷脂类、鞘酯类、胆固醇酯、维生素、有机酸、多胺、酮体。6.根据权利要求1的分析方法，其特征在于，在(2)所述的质谱成像数据结构的前处理，所述的同质区域，包括整体动物组织样本中属于同一类型的区域，或某一器官内的亚结构区域，或某一组织内的微区域，所述的同一类型的区域包括心、肝、肾、脾、脑、肺、肠道、胃、皮肤、生殖腺、胸腺、骨骼肌、食管；所述的某一器官内的亚结构区域包括脑或肾的皮质和髓质区域；所述的某一组织内的微区域包括肿瘤组织的新生区域或坏死区域。7.根据权利要求1的分析方法，其特征在于，在(2)所述的质谱成像数据结构的前处理，所述的机器学习方法，包括以k-均聚类、k-近邻算法、随机森林、支持向量机、判别分析、浅层神经网络为代表的的有监督学习算法；主成分分析、k均聚类分析、系统聚类分析、自组织映射、高斯混合模型为代表的无监督学习算法；以及以深层神经网络、卷积神经网络为代表的深度学习模型。8.根据权利要求1的分析方法，其特征在于，在(3)所述质谱成像代谢物离子信息库的建立，所述信息库，其录入条目包括离子精确质荷比、加合离子类型、化学结构、官能团、所属代谢通路、生物学功能及生物转化类型。9.根据权利要求1的分析方法，其特征在于，在(4)所述的初级特征信息的选择与高阶特征信息的提取，所述初级特征信息的选择，是指在质谱成像代谢物离子信息库中，以非目标地选择全部条目，或目标性地选择若干在功能、通路、结构类型或生物转化方面相关联的代谢物离子，以组成多维初级特征向量的过程。10.根据权利要求1的分析方法，其特征在于，在(4)所述的初级特征信息的选择与高阶特征信息的提取，所述高阶特征信息的提取，是指对采集到的全部代谢物或具有一定关联的若干代谢物的丰度信息进行线性或非线性组合，生成可反映整体代谢轮廓或特定代谢特征差异的新变量的过程。11.根据权利要求1的分析方法，其特征在于，在(4)所述的初级特征信息的选择与高阶特征信息的提取，所述初级特征代谢物群，是指若干个参与某一代谢通路，承担某一生物学功能，具有相同结构母核、官能团、或生物转化的代谢物。12.根据权利要求1的分析方法，其特征在于，在(5)所述在高阶特征空间内测量代谢扰动变化量，所述降维，包括提取主成分、非负矩阵因子化、t-分布邻域嵌入方法。13.根据权利要求1的分析方法，其特征在于，在(5)所述在高阶特征空间内测量代谢扰动变化量，所述高阶特征空间，是指经过(4)所述高阶特征信息提取步骤，将若干代谢物组成的多维信息降维得到的到二维或三维空间。14.根据权利要求1的分析方法，其特征在于，在(5)所述在高阶特征空间内测量代谢扰动变化量，所述对照组，是指未经过造模过程的健康对照组，或经过疾病模型构建，但未给予药物处置的模型对照组。15.根据权利要求1的分析方法，其特征在于，在(5)所述在高阶特征空间内测量代谢扰动变化量，所述像素点簇的簇心，是指在高阶特征空间中，处于同一生物组织来源的像素点
簇的几何中心或重心。16.根据权利要求1的分析方法，其特征在于，在(5)所述在高阶特征空间内测量代谢扰动变化量，所述距离，是指欧氏距离、马氏距离、曼哈顿距离、夹角余弦，及所述代谢扰动评分的测量结果，其生物学意义在于衡量药物干预或疾病病理作用下，特定代谢物群或整体代谢轮廓的特征改变程度。

技术总结
本发明属于生物分析检测技术领域，公开了一种空间代谢组高阶特征信息的提取、测量与质谱成像可视化方法。具体涉及一种临床前候选药物在体内活性作用部位及作用强度评估的质谱成像分析方法，可以应用于探究药物潜在作用部位、分子靶标及分子机理的预测。该发明引入的指标“代谢扰动评分”，可以用于测量空间代谢组高阶特征的变化，并将不同空间位点的代谢变化进行可视化的图像表征，可以客观评估候选药物作用下，体内各部位的总体代谢状态变化，还可以用于评估药物对于特定的代谢途径、物种、功能或生物转化类型的影响，有助于解释药物作用的潜在分子机制，并加速制药行业新药物靶点和临床适应症的发现。临床适应症的发现。


技术研发人员：贺玖明 宋肖炜 再帕尔
受保护的技术使用者：中国医学科学院药物研究所
技术研发日：2022.01.26
技术公布日：2023/8/4