用于细菌表面展示的融合蛋白的制作方法

1.本发明一般涉及分子生物学和微生物学领域。本文提供了编码融合蛋白的表达构建体、融合蛋白和如本文定义的融合蛋白的用途。


背景技术：

2.细菌上蛋白质的表面展示在生物技术中有多种应用，包括生物传感；用于在药物发现中筛选蛋白质和肽文库；用于食品和化学加工中的生物催化；以及用于开发治疗胃肠道疾病的“活疗法”。特别是在生物医学和食品加工中，因为它们的食品级状态(根据美国食品和药物管理局“通常被认为是安全的”)和易于培养，乳酸菌(lab)是用于蛋白质展示的有利宿主。此外，许多来自乳杆菌属(lactobacillus)的lab菌株具有可以补充任何治疗用途的潜在的健康益处(例如“益生菌”)。
3.展示异源蛋白质的乳酸菌已被研究用于治疗用途，特别是用于治疗代谢和胃肠道疾病。lab上的蛋白质展示也可用于开发细菌疫苗载体，其中lab的先天免疫原性避免了对佐剂的需要。展示酶的乳酸菌可用作工业过程中的生物催化剂。
4.为了实现表面展示，通常将蛋白质或肽融合到结合宿主细菌细胞壁的锚定结构域。锚定结构域可以共价连接到细胞壁组分，或者它可以非共价结合。lab可以被基因工程化以用于表面展示，这通常是共价锚定所必需的，因为蛋白质表达、分泌和锚定依次发生在单个细胞中。然而，遗传修饰的细菌的使用会引起安全问题，并且可能会遇到较低的消费者接受度和更严格的监管审查，尤其是当包含在食品或药物制剂中时。
5.因此，通常希望克服或改善上述困难中的一个或多个。


技术实现要素：

6.本文公开了编码融合蛋白的表达构建体，该表达构建体包含编码用于表达的第一多肽和衍生自植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)lys2自溶素的细胞壁靶向区域的第二多肽的核酸，其中第一多肽和第二多肽连接形成融合蛋白。
7.本文公开了包含如本文定义的表达构建体的重组宿主细胞。
8.本文公开了由如本文定义的表达构建体编码的融合蛋白。
9.本文公开了在乳酸菌表面展示融合蛋白的方法，该方法包括以下步骤：a)在宿主细胞中表达如本文定义的融合蛋白，和b)将融合蛋白固定到乳酸菌的表面。
10.本文公开了包含附接到其表面的如本文定义的融合蛋白的乳酸菌。
11.本文公开了包含如本文定义的乳酸菌的组合物。
12.本文公开了用作药物的如本文定义的乳酸菌或组合物。
13.本文公开了治疗受试者的病况或疾病的方法，该方法包括向受试者施用如本文定义的乳酸菌或组合物。
14.本文公开了如本文定义的乳酸菌或组合物，其用于治疗受试者的病况或疾病。
15.本文公开了如本文定义的乳酸菌或组合物在制备用于治疗受试者的病况或疾病
的药物中的用途。
16.本文公开了预防受试者的病况或疾病的方法，该方法包括向受试者施用如本文定义的乳酸菌或组合物。
17.本文公开了如本文定义的乳酸菌或组合物，其用于预防受试者的病况或疾病。
18.本文公开了如本文定义的乳酸菌或组合物在制备用于预防受试者的病况或疾病的药物中的用途。
附图说明
19.以下仅通过非限制性示例的方式参考附图描述本发明的实施方案，其中：
20.图1显示了cad4a结构域用于在乳酸菌表面固定异源功能性蛋白质化合物的应用。
21.图2a显示了植物乳杆菌lys2蛋白的分子组织和cad4a锚定结构域的衍生。ss，信号序列；lc，低复杂度区域；mur，胞壁酸酶；r1-r5，sh3_5重复。图2b显示了包含cad4a结构域的本发明的蛋白质构建体的实例。
22.图3显示了本发明的构建体的序列结构域。lys2细胞壁靶向区域(cwt)以粗体显示。重复间区域带有下划线。功能结构域和锚定结构域之间的间隔区带有双下划线。对于合成间隔区，x优选为1-3个重复。
23.图4显示了在大肠杆菌中表达的纯化的cad4a蛋白构建体的sds-page(上图)和蛋白质印迹分析(中图)。功能结构域是sirius(3a)和超氧化物歧化酶(sod)(3b)。底部图中示意性地显示了蛋白质构建体。6h，组氨酸标签。
24.图5a显示了将不同的乳酸菌与sirius-cad4a混合后的细胞相关荧光。图5b显示了具有表面结合的sirius-cad4a的发酵乳杆菌(l.fermentum)的荧光显微照片。相对于对照，*p≤0.05；***p≤0.001。
25.图6比较了发酵乳杆菌在两个生长阶段的细胞相关荧光。相对于对照，***p≤0.001。
26.图7显示了细胞相关荧光与添加到固定细胞密度的发酵乳杆菌的sirius-cad4a浓度之间的相关性。该图用于确定每个细胞结合的蛋白质的最大量。
27.图8比较了用5m licl(以去除表面蛋白)或10％v/v tca(以去除细胞壁脂磷壁酸)预处理的发酵乳杆菌的细胞相关荧光。相对于对照，ns,p》0.05；***p≤0.001。
28.图9显示了发酵乳杆菌在不同混合条件下的细胞相关荧光的变化：温度(9a)、ph(9b)、盐浓度(9c)。
29.图10a显示了具有不同间隔区长度的不同sod-cad4a蛋白构建体的酶活性。图10b显示了发酵乳杆菌与sod-cad4a混合后细胞相关的sod活性。相对于对照，ns,p》0.05；***p≤0.01。
30.图11显示了封装在藻酸盐-壳聚糖珠中的sod包被的细菌经历模拟胃消化后残留的细胞相关sod活性。相对于对照，**p≤0.01。
31.图12a显示了包含不同数量的sh3_5重复的sirius-cad4a变体的设计。图12b是纯化的sirius-cad4a构建体的sds-page凝胶。图12c显示了在两个生长阶段将发酵乳杆菌与sirius-cad4a变体混合后的细胞相关荧光。相对于对照，ns,p》0.05；***p≤0.001。
32.发明详述
33.本说明书教导了一种编码融合蛋白的表达构建体。本文公开了一种编码融合蛋白的表达构建体，所述表达构建体包含编码用于表达的第一多肽和衍生自乳杆菌自溶素的细胞壁靶向区域的第二多肽的核酸，其中第一多肽和第二多肽连接形成融合蛋白。
34.在一个实施方案中，第二多肽衍生自植物乳杆菌lys2自溶素的细胞壁靶向区域。
35.在一个实施方案中，融合蛋白能够展示在乳酸菌的表面上。
36.术语“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用以指代核苷酸的聚合物，其可以是mrna、rna、crna、cdna或dna。该术语通常指长度为至少10个碱基的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式)的聚合形式。该术语包括单链和双链形式的dna。
37.术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用，并且指的是通过肽键或修饰的肽键连接的任何氨基酸聚合物(二肽或更多氨基酸的肽)。少于约10-20个氨基酸残基的多肽通常被称为“肽”。本发明的多肽可以包含非肽组分，例如碳水化合物基团。碳水化合物和其他非肽类取代基可以由产生多肽的细胞添加到多肽上，并且会随着细胞类型的不同而不同。多肽在本文中根据其氨基酸主链结构进行定义；取代基例如碳水化合物基团通常没有具体说明，但仍然可以存在。
[0038]“融合蛋白”是由包含至少两个基因的核苷酸序列的核酸分子表达的杂合蛋白。以这种方式，融合蛋白包含至少两个在自然界中彼此不相关的氨基酸序列。
[0039]
如本文所用的关于核酸的术语“衍生自”意指核酸(例如基因、基因部分、调节元件、多肽)的至少一部分也存在于(即或复制自)核酸所衍生自的生物来源中。衍生的核酸可以以提供所需序列的任何方式构建，包括衍生部分。例如，核酸可以使用限制酶或分子生物学的其他工具直接从生物来源获得，或通过从生物来源扩增(例如通过聚合酶链式反应)获得，或通过诸如化学合成的技术获得。虽然在许多情况下，衍生自生物来源的核酸不是直接从该来源获得，但其序列和/或特征与来自生物来源的序列的一部分基本相同。
[0040]
如本文定义的融合蛋白可包含一个或多个保守氨基酸置换。
[0041]“保守氨基酸置换”应理解为意指其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的置换。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义，它们通常可以如下表“氨基酸分类”所示进行细分：
[0042]
氨基酸亚分类
[0043][0044]
保守氨基酸置换还包括基于侧链的分组。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；以及具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。例如，可以合理地预期用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、用谷氨酸取代天冬氨酸、用丝氨酸取代苏氨酸或用结构相关的氨基酸类似取代氨基酸不会对所得变体多肽的特性产生重大影响。氨基酸变化是否会产生功能性多肽可通过测定其活性容易地确定。
[0045]
保守置换也显示在下表中(示例性和优选的氨基酸置换)。落入本发明范围内的氨基酸置换通常通过选择在其对于维持(a)置换区域中的肽主链结构，(b)分子在靶位点的电荷或疏水性，或(c)侧链的主体的效果没有显著差异的置换来实现。引入置换后，可以使用本领域技术人员已知的方法，包括本文别处描述的那些方法，筛选变体特异性结合ngf的能力。
[0046]
示例性和优选的氨基酸置换
[0047][0048][0049]
术语“构建体”是指重组遗传分子，包括来自不同来源的一个或多个分离的核酸序列。因此，构建体是嵌合分子，其中两种或更多种不同来源的核酸序列组装成单个核酸分子，并且包括含有以下的任何构建体：(1)核酸序列，包括在自然界中不一起发现的调节和编码序列(即，至少一个核苷酸序列相对于至少一个其他核苷酸序列是异源的)，或(2)编码非天然连接的功能性rna分子或蛋白质部分的序列，或(3)非天然连接的启动子部分。代表性构建体包括任何重组核酸分子，例如质粒、黏粒、病毒、自主复制的多核苷酸分子、噬菌体或线性或环状单链或双链dna或rna核酸分子，衍生自任何来源，能够进行基因组整合或自
主复制，包含其中一个或多个核酸分子已可操作地连接的核酸分子。本发明的构建体通常包括指导也包含在该构建体中的感兴趣的核酸序列的表达的必需元件。此类元件可包括控制元件或调节序列，例如启动子，其可操作地连接至(以便指导转录)感兴趣的核酸序列，并且通常也包括聚腺苷酸化序列。在本发明的某些实施方案中，构建体可以包含在载体中。除了构建体的组分之外，载体可以包含例如一种或多种选择标记、一个或多个复制起点例如原核和真核起点、至少一个多克隆位点和/或促进构建体稳定整合到宿主细胞的基因组中的元件。两个或更多个构建体可包含在单个核酸分子例如单个载体内，或可包含在两个或更多个分开的核酸分子例如两个或更多个分开的载体内。“表达构建体”通常至少包括可操作地连接至感兴趣的核苷酸序列的控制序列。以这种方式，例如，在表达构建体中提供与待表达的核苷酸序列可操作连接的启动子以用于在生物体或其部分包括宿主细胞中的表达。对于本发明的实践，用于制备和使用构建体和宿主细胞的常规组合物和方法是本领域技术人员众所周知的，参见例如，molecular cloning:a laboratory manual,第3版卷1,2,和3.j.f.sambrook,d.w.russell,和n.irwin,cold spring harbor laboratory press,2000。
[0050]
术语“编码(encode)”或“编码(encoding)”包括提及在转录和/或翻译意义上对应于其他核苷酸或氨基酸的核苷酸和/或氨基酸。
[0051]
如本文所用，“控制元件”、“控制序列”、“调节序列”以及类似术语意指在特定宿主细胞中表达可操作连接的编码序列所必需的核酸序列(例如，dna)。适用于原核细胞的控制序列例如包括启动子和任选地顺式作用序列例如操纵子序列和核糖体结合位点。适用于真核细胞的控制序列包括转录控制序列，例如启动子、聚腺苷酸化信号、转录增强子、翻译控制序列例如翻译增强子和内部核糖体结合位点(ires)、调节mrna稳定性的核酸序列，以及将转录的多核苷酸编码的产物靶向至细胞内的细胞内区室或细胞外环境的靶向序列。
[0052]
术语“表达”是指涉及产生rna和蛋白质以及适当时分泌蛋白质的细胞过程，在适用的情况下包括但不限于例如转录、转录物加工、翻译和蛋白质折叠、修饰和加工。
[0053]“接头”意指连接两个分子并通常用于将两个分子置于所需构型的分子或分子组(例如单体或聚合物)。在具体实施方案中，“接头”是指连接第一多肽和第二多肽的氨基酸序列，并且可以提供与第一多肽和第二多肽的间距相容的间隔区功能以允许第一多肽展示在乳酸菌的表面。在其他实施方案中，“接头”是指化学接头。
[0054]
在一个实施方案中，第一多肽和第二多肽由接头多肽分开。接头多肽可以是任何长度。接头多肽的长度可为约10-50个氨基酸，或约10-30个氨基酸。接头长度和特性可以是任意的，并且可以针对感兴趣的蛋白质进行定制。通常，“接头”是被选择或设计为非结构化和灵活的肽。例如，可以选择不形成特定二级结构的氨基酸。或者，可以选择氨基酸，使得其不形成稳定的三级结构。或者，氨基酸接头可以形成无规卷曲。此类接头包括但不限于富含gly、ser、thr、gln、glu或其他经常与天然蛋白质中的非结构化区域相关的氨基酸的合成肽。
[0055]
接头多肽例如可以是vtttssndtttsevttdtsattntstssttkka(seq id no：8)。接头多肽也可以是(ggsgggsgggsg)
x
(seq id no:9)，其中x是整数，例如1、2、3或更大。其他示例包括(gs)5或(gs)
10
。
[0056]
在一个替代实施方案中，第一多肽和第二多肽由化学接头分开。
[0057]
在一个实施方案中，第一多肽位于第二多肽的上游。在一个实施方案中，第一多肽位于第二多肽的下游。
[0058]
第二多肽可衍生自乳杆菌自溶素的细胞壁靶向区域。在一个实施方案中，乳杆菌自溶素包含细胞壁靶向区域。在一个实施方案中，乳杆菌自溶素是植物乳杆菌lys2自溶素。植物乳杆菌lys2自溶素可以是genbank登录号为ccc80137.1的植物乳杆菌lys2自溶素。乳杆菌自溶素可包含与seq id no：1的氨基酸序列具有至少70％(包括至少71％至99％和其间的所有整数百分比)序列同一性的氨基酸序列或由其组成。
[0059]
在一个实施方案中，第二多肽能够将融合蛋白锚定到细菌例如乳酸菌的表面上。在一个实施方案中，第二多肽包含sh3类型5基序多肽或由其组成。在一个实施方案中，第二多肽包含与seq id no：2、seq id no：3、seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6或其组合(例如seq id no：2和3，seq id no：2、3和4，seq id no：2、3、4和5，seq id no：2、3、4、5和6，seq id no：3和4，seq id no：3、4和5，seq id no：3、4、5和6，seq id no：4和5，seq id no：4、5和6，seq id no：5和6)具有至少70％(包括至少71％至99％和其间的所有整数百分比)序列同一性的氨基酸序列或由其组成。
[0060]
在一个实施方案中，第二多肽包含与seq id no：7的氨基酸序列具有至少70％(包括至少71％至99％和其间的所有整数百分比)序列同一性的氨基酸序列或由其组成。
[0061]
如本文所用，术语“序列同一性”是指序列在比较窗口中在逐个核苷酸的基础上或逐个氨基酸的基础上相同的程度。因此，“序列同一性百分比”通过以下步骤计算：在比较窗口中比较两个最佳比对的序列，确定相同的核酸碱基(例如，a、t、c、g和i)或相同的氨基酸残基(例如，ala、pro、ser、thr、gly、val、leu、ile、phe、tyr、trp、lys、arg、his、asp、glu、asn、gln、cys和met)在两个序列中出现的位置的数量以产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数(即，窗口大小)，并将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。
[0062]
用于描述两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列关系的术语包括“参考序列”、“比较窗口”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“基本同一性”。“参考序列”的长度为至少12个，但通常为15至18个，并且通常至少为25个单体单元，包括核苷酸和氨基酸残基。因为两个多核苷酸可能各自包含(1)在两个多核苷酸之间相似的序列(即，仅完整多核苷酸序列的一部分)，和(2)在两个多核苷酸之间不同的序列，两个(或更多个)多核苷酸之间的序列比较通常通过在“比较窗口”上比较两个多核苷酸的序列以鉴定和比较序列相似性的局部区域来进行。“比较窗口”是指至少6个，通常约50至约100个，更通常约100至约150个连续位置的概念性区段，其中将序列与具有相同数量的连续位置的参考序列在最佳对齐两个序列后进行比较。比较窗可包含与参考序列(不包含添加或删除)相比约20％或更少的添加或删除(即，缺口)，以用于两个序列的最佳比对。用于比对比较窗口的序列的最佳比对可以通过算法的计算机化实施(wisconsin genetics software package release 7.0,genetics computer group,575science drive madison,wi,usa中的gap、bestfit、fasta和tfasta)或通过检查和由所选的各种方法中的任何一种产生的最佳比对(即，在比较窗口中产生最高百分比的同源性)来进行。还可以参考blast系列程序，例如如altschul等人,1997,nucl.acids res.25:3389公开的。序列分析的详细讨论可以在ausubel等人,“current protocols in molecular biology”,john wiley&sons inc,1994-1998的第15章的第19.3
单元中找到。
[0063]
第一多肽可以是具有生物学意义的任何多肽(例如生物学活性或治疗性多肽或抗原性多肽)。第一多肽可以是抗病毒多肽、抗细菌多肽、抗真菌多肽或与病毒、细菌或真菌结合的多肽，包括抗体、抗体片段或单链抗体。第一多肽可以是来自病毒、细菌或真菌的抗原性多肽。
[0064]
病毒的实例包括但不限于逆转录病毒科(例如，人类免疫缺陷病毒，例如hiv-1(也称为htlv-iii、lav或htlv-iii/lav，或hiv-iii))；和其他分离株，例如hiv-lp；小核糖核酸病毒科(例如，脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒；肠道病毒、人类柯萨奇病毒、鼻病毒、埃可病毒)；杯状病毒科(例如，引起胃肠炎的毒株)；披膜病毒科(例如，马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(例如，登革热病毒、脑炎病毒、黄热病病毒)；冠状病毒科(例如，冠状病毒，包括sars-cov-2病毒)；弹状病毒科(例如，水疱性口炎病毒、狂犬病病毒)；丝状病毒科(例如，埃博拉病毒)；副粘病毒科(例如，副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(例如，流感病毒)；布尼亚病毒科(bungaviridae)(例如，汉坦病毒、布尼亚病毒(bunga virus)、白蛉病毒(phlebovirus)和内罗病毒(nairo virus))；沙粒病毒科(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(例如，呼肠孤病毒、环状病毒(orbiviurses)和轮状病毒)；双rna病毒科(bimaviridae)；嗜肝dna病毒科(乙型肝炎病毒)；细小病毒科(细小病毒)；乳多空病毒科(乳头瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(单纯疱疹病毒(hsv)1和2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(cmv)、疱疹病毒)；痘病毒科(天花病毒、牛痘病毒、痘病毒)；和虹彩病毒科(例如非洲猪瘟病毒)；丙型肝炎病毒；和未分类的病毒(例如，丁型肝炎病原体(被认为是乙型肝炎病毒的缺陷卫星)；诺沃克病毒和相关病毒，以及星状病毒)。
[0065]
细菌的示例包括但不限于幽门螺杆菌(helicobacter pyloris)、伯氏疏螺旋体(borelia burgdorferi)、嗜肺军团菌(legionella pneumophila)、分枝杆菌属的几个种(mycobacteria sps)(例如，结核分枝杆菌(m.tuberculosis)、鸟分枝杆菌(m.avium)、胞内分枝杆菌(m.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(m.kansaii)、戈登分枝杆菌(m.gordonae))、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、淋病奈瑟菌(neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(neisseria meningitidis)、单核细胞增生李斯特菌(listeria monocytogenes)、酿脓链球菌(streptococcus pyrogenes)(a群链球菌)、无乳链球菌(streptococcus agalactiae)(b群链球菌)、链球菌(草绿色群)、粪链球菌(streptococcus faecalis)、牛链球菌(streptococcus bovis)、链球菌(厌氧种)、肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)、致病性弯曲杆菌属的种、肠球菌属的种(enterococcussp.)、流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae)、炭疽杆菌(bacillus anthracis)、白喉棒状杆菌(corynebacterium diphtheriae)、棒状杆菌属的种(corynebacterium sp.)、猪红斑丹毒丝菌(erysipelothrix rhusiopathiae)、产气荚膜梭菌(clostridium perfringens)、破伤风梭菌(clostridium tetani)、产气肠杆菌(enterobacter aerogenes)、肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae)、多杀性巴氏杆菌(pasturella multocida)、拟杆菌属的种(bacteroides sp.)、具核梭杆菌(fusobacterium nucleatum)、大肠杆菌(escherichia coli)的致病菌株、念珠状链杆菌(streptobacillus moniliformis)、密螺旋体(treponema pallidium)、纤细螺旋体(treponema pertenue)、细螺旋体(leptospira)和以色裂放线菌(actinomyces israelli)。
[0066]
真菌的示例包括但不限于新型隐球菌(cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(histoplasma capsulatum)、粗球孢子菌(coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(blastomyces dermatitidis)、沙眼衣原体(chlamydia trachomatis)和白色念珠菌(candida albicans)。
[0067]
如本文所用，术语“抗原”及其在语法上的等价表达(例如，“抗原性”)是指可被特定体液或细胞免疫的产物(例如抗体分子或t细胞受体)特异性结合的多肽、组合物或物质。抗原可以是任何类型的分子，包括例如半抗原、简单的中间代谢物、糖(例如寡糖)、脂质和激素以及大分子例如复合碳水化合物(例如多糖)、磷脂和蛋白质。
[0068]“治疗性蛋白质”或“治疗性多肽”包括宿主不产生但需要的蛋白质或多肽；宿主通常不会产生但具有治疗活性的蛋白质；宿主产生但产生量不足的蛋白质；宿主产生但以无活性形式或与通常与蛋白质相关的活性相比活性降低的蛋白质；或宿主产生足够量且具有与该蛋白质相关的正常活性的蛋白质。治疗性蛋白质包括天然存在的蛋白质和氨基酸序列不同于天然存在的对应蛋白质的重组蛋白质，重组蛋白质相对于天然存在的蛋白质具有基本相同、改变的活性或增强的活性。具有治疗活性的蛋白质包括但不限于细胞因子，包括但不限于白细胞介素、内皮素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子和干扰素；激素，包括但不限于生长激素、胰岛素；生长因子，包括但不限于人生长因子、胰岛素样生长因子；生物活性肽；营养素；神经营养因子；可溶性形式的膜蛋白，包括但不限于可溶性cd4；酶；调节蛋白；结构蛋白；凝血因子，包括但不限于因子xiii；促红细胞生成素；组织纤溶酶原激活物；等等。
[0069]
第一多肽可以是酶。例如，酶可以是超氧化物歧化酶(sod)、纤维素酶、淀粉酶、脂肪酶或蛋白酶。
[0070]
在一个实施方案中，第一多肽是超氧化物歧化酶(sod)。在一个实施方案中，第一多肽可包含与seq id no：10的氨基酸序列具有至少70％(包括至少71％至99％和其间的所有整数百分比)序列同一性的氨基酸或由其组成。
[0071]
本文公开了包含如本文定义的表达构建体的重组宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌或乳酸乳球菌(lactococcus lactis)。
[0072]
可以通过本领域技术人员已知的任何方法将表达构建体引入宿主细胞。例如，可以通过转化、电穿孔或转染引入表达构建体。
[0073]
本文公开了编码融合蛋白的重组宿主细胞，所述融合蛋白包含用于表达的第一多肽和衍生自乳杆菌自溶素的细胞壁靶向区域的第二多肽，其中第一多肽和第二多肽连接形成融合蛋白。
[0074]
术语“宿主”、“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指其中已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞及其衍生的后代，无论传代数如何。后代细胞的核酸含量可能与亲代细胞不完全相同，但可能包含突变。具有与在最初转化的细胞中筛选或选择的相同功能或生物活性的突变后代包括在本文中。宿主细胞是可用于产生本发明的融合蛋白的任何类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞，例如细菌细胞，例如埃希氏菌属(例如大肠杆菌)、乳球菌属(例如乳酸乳球菌)、芽孢杆菌属、乳杆菌属、假单胞菌属、链霉菌属、棒状杆菌和嗜盐菌，哺乳动物培养细胞，例如cho细胞，bhk细胞，ns0细胞，sp2/0细胞，yo骨髓瘤细胞，p3x63小鼠骨髓瘤细胞，per细胞，per.c6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细
胞(仅举几例)，还有包含在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中的细胞。
[0075]
本文公开了由如本文定义的表达构建体编码的融合蛋白。在一个实施方案中，融合蛋白是重组融合蛋白。
[0076]
在一个实施方案中的是编码融合蛋白的核酸，该融合蛋白包含用于表达的第一多肽和衍生自乳杆菌自溶素的细胞壁靶向区域的第二多肽，其中第一多肽和第二多肽连接形成融合蛋白。
[0077]
本文公开了一种融合蛋白，其包含用于表达的第一多肽和衍生自乳杆菌自溶素的细胞壁靶向区域的第二多肽，其中第一多肽和第二多肽连接形成融合蛋白。
[0078]
在一个实施方案中，提供了如本文定义的融合蛋白用于展示在乳酸菌表面上的用途。融合蛋白可以是如本文定义的异源融合蛋白。
[0079]
在一个实施方案中，提供了用于在乳酸菌表面表达异源蛋白质的系统。
[0080]
本文公开了在乳酸菌表面展示融合蛋白的方法，该方法包括以下步骤：a)在宿主细胞中表达如本文定义的融合蛋白，和b)将融合蛋白固定到乳酸菌表面上。
[0081]
在一个实施方案中，该方法包括在步骤b)之前分离和/或纯化融合蛋白。
[0082]
固定可以在25至37℃的温度范围内进行。如果使用活菌作为宿主，固定温度可以在细菌培养物的温度范围内进行。固定可在5至7的ph范围内进行。如果使用活菌作为宿主，固定ph可在细菌培养物的ph范围内进行。固定可以在生理盐浓度下进行，例如约50至200mm氯化钠。
[0083]
该方法可包括预处理乳酸菌以增加与细胞表面结合的融合蛋白的量。例如，用去污剂、有机溶剂、酸和盐对细菌进行预处理可以选择性地去除细胞壁的组分而不影响肽聚糖。这可能会在细胞壁上暴露更多位点以用于与融合蛋白结合。
[0084]
在一个实施方案中，乳酸菌是乳球菌属或乳杆菌属细菌。乳酸菌例如可以是乳酸乳球菌、干酪乳杆菌(lactobacillus casei)、发酵乳杆菌(lactobacillus fermentum)、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)。在一个实施方案中，乳酸菌是发酵乳杆菌。
[0085]
在一个实施方案中，使用通过热、uv、伽马辐射或化学处理灭活的非活细胞代替乳酸菌。
[0086]
本文公开了一种乳酸菌，其包含附接到其表面的如本文定义的融合蛋白。融合蛋白可以是如本文定义的异源融合蛋白。融合蛋白可以固定在乳酸菌的表面上。
[0087]
乳酸菌可以是活的、灭活的、不能存活的、非复制性的或死的。
[0088]
本文公开了包含如本文定义的乳酸菌的组合物。该组合物可以是食物组合物、药物组合物或免疫调节组合物。
[0089]
当预期用途是引发或增加免疫反应时，该组合物被称为“免疫原性”或“免疫调节”组合物。这样的组合物包括预防组合物和治疗组合物。因此，可以将本发明的免疫调节组合物施用于接受者以用于预防、改善、缓和或治疗目的。
[0090]
本公开内容还提供了包含如本文定义的乳酸菌的组合物，包括食物组合物、药物组合物或免疫调节组合物。代表性组合物可以包括缓冲剂，并且还可以包括适合预期用途的其他物质。
[0091]
本领域技术人员可以容易地选择适用于预期用途的合适的缓冲液，其中很多种是
本领域已知的。在一些情况下，组合物可以包含药学上可接受的赋形剂，其中多种是本领域已知的并且不需要在本文中详细讨论。药学上可接受的赋形剂已在各种出版物中得到充分描述，包括，例如，a.gennaro(2000)“remington:the science and practice of pharmacy”,第20版,lippincott,williams,&wilkins；pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems(1999)h.c.ansel等人,eds 7.sup.th ed.,lippincott,williams,&wilkins；和handbook of pharmaceutical excipients(2000)a.h.kibbe等人,eds.,3.sup.rd ed.amer.pharmaceutical assoc。
[0092]
在一个实施方案中，该组合物是食物组合物。为了防止蛋白质脱离，可以将具有表面结合蛋白质的细菌与缓冲环境变化的食物基质或食品级生物材料混合。食物基质包括乳制品和发酵食品。食品级生物材料可以是可食用聚合物和肠溶胶囊。食物组合物可以是乳汁、酸奶、凝乳、奶酪、发酵奶、基于乳汁的发酵产品、冰淇淋、基于发酵谷物的产品、基于乳汁的粉末、婴儿配方食品或在动物的情况下宠物食品。
[0093]
在一个实施方案中，乳酸菌被封装。乳酸菌可以例如被封装在壳聚糖包被的藻酸盐珠中。
[0094]
在一个实施方案中，组合物是冷冻干燥或水合的组合物。乳酸菌可以以水合或干燥的形式使用。干燥过程可以是保持细菌细胞壁和结合的蛋白的完整性的任何系统，包括冷冻干燥和喷雾干燥。
[0095]
在一个实施方案中，组合物包含固定的融合蛋白。融合蛋白可以固定在组合物的基质内。具有表面固定的融合蛋白的宿主细菌可用于生物转化的工业过程。
[0096]
具有如本文定义的组成的乳酸菌作为益生菌的用途。
[0097]
本文公开了用作药物的如本文定义的乳酸菌或组合物。药物可以例如是疫苗(例如粘膜疫苗)。
[0098]
本文公开了一种治疗受试者的病况或疾病的方法，该方法包括向受试者施用如本文定义的乳酸菌或组合物。
[0099]
在一个实施方案中，该方法包括向受试者施用治疗有效量的如本文定义的乳酸菌或组合物。
[0100]
如本文所用，术语“治疗有效量”在其含义内包括无毒但足量的乳酸菌或组合物以提供所需的治疗效果。所需的确切量将因受试者而异，取决于因素例如所治疗的物种、受试者的年龄和一般状况、所治疗病况的严重程度、所施用的特定药物和施用方式等。因此，不可能指定确切的“有效量”。然而，对于任何给定的情况，合适的“有效量”可以由本领域普通技术人员仅使用常规实验来确定。
[0101]
术语“治疗”、“医治”和类似术语在本文中可互换使用以意指减轻、减少、缓解、改善或以其他方式抑制病况，包括病况的一种或多种症状。术语“阻止”、“防止”、“预防”、“预防的”、“预防性”和类似术语在本文中可互换使用以意指预防或延迟病况的发作，或发展病况的风险。
[0102]
术语“治疗”、“医治”和类似术语还包括减轻、减少、缓解、改善或以其他方式抑制病况的影响至少一段时间。还应理解，术语“治疗”、“医治”和类似术语并不意味着该病况或其症状被永久减轻、减少、缓解、改善或以其他方式抑制，因此也包括暂时减轻、减少、缓解、改善或以其他方式抑制病况或其症状。
[0103]
在本文中可互换使用的术语“受试者”、“患者”、“宿主”或“个体”是指任何受试者，特别是脊椎动物受试者，甚至更特别是哺乳动物受试者，其需要治疗或预防。落在本发明范围内的合适的脊椎动物包括但不限于脊索动物亚门的任何成员，包括灵长类动物(例如，人类、猴子和猿，并且包括猴子的物种，例如来自猕猴属(例如，食蟹猴，诸如食蟹猕猴(macaca fascicularis)和/或恒河猴(macaca mulatta))和狒狒(豚尾狒狒(papio ursinus))，以及狨猴(来自狨属的物种)、松鼠猴(来自松鼠猴属的物种)和绢毛猴(来自柽柳猴属的物种)，以及猿的物种，例如黑猩猩(pan troglodyte))、啮齿动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠)、兔形动物(例如兔子、野兔)、牛科动物(例如牛)、绵羊动物(例如绵羊)、山羊动物(例如山羊)、猪科动物(例如猪)、马科动物(例如、马)、犬科动物(例如狗)、猫科动物(例如猫)、鸟类(例如鸡、火鸡、鸭、鹅、伴侣鸟诸如金丝雀、虎皮鹦鹉等)、海洋哺乳动物(例如海豚、鲸鱼)、爬行动物(蛇、青蛙、蜥蜴等)和鱼。在一个实施方案中，受试者是人类受试者。
[0104]
本文公开了如本文定义的乳酸菌或组合物，其用于治疗受试者的病况或疾病。
[0105]
本文公开了如本文定义的乳酸菌或组合物在制备用于治疗受试者的病况或疾病的药物中的用途。
[0106]
在一个实施方案中，病况或疾病是炎性肠病(例如慢性结肠炎、克罗恩病或溃疡性结肠炎)、口腔粘膜炎、癌症或过敏反应。在一个实施方案中，病况或疾病是肠道病况或疾病。在一个实施方案中，病况或疾病是口腔疾病或病况。
[0107]
本文公开了一种预防受试者的病况或疾病的方法，该方法包括向受试者施用如本文定义的乳酸菌或组合物。
[0108]
本文公开了如本文定义的乳酸菌或组合物，其用于预防受试者的病况或疾病。
[0109]
本文公开了如本文定义的乳酸菌或组合物在制备用于预防受试者的病况或疾病的药物中的用途。
[0110]
在一个实施方案中，病况或疾病是病原体感染。病原体感染可以是细菌、病毒、真菌、原生动物或朊病毒的感染。
[0111]
本文公开了一种调节受试者的免疫反应的方法，该方法包括向受试者施用如本文定义的乳酸菌或组合物。
[0112]
如本文所用，“免疫反应”是指受试者的免疫系统的反应。例如，免疫反应可以针对受试者的免疫系统识别为外来的(例如，非自身抗原)或自身的(例如，识别为外来的自身抗原)的抗原/免疫原。免疫反应可以是体液的，涉及免疫球蛋白或抗体的产生，或细胞的，涉及各种类型的b和t淋巴细胞、树突细胞、巨噬细胞、抗原呈递细胞等，或两者。免疫反应也可能涉及各种效应分子如细胞因子的产生或加工。术语“免疫反应”包括导致、激活、引发、刺激或诱导针对受试者中特定抗原(例如，致病生物体的抗原)或生物体(例如，致病微生物)的免疫反应的免疫原性反应，以及抑制、阻止、减少或消除对过敏原或自身抗原或表达这种抗原的细胞、组织或器官的免疫反应或使免疫系统对过敏原或自身抗原或表达这种抗原的细胞、组织或器官无反应或延迟对过敏原或自身抗原或表达这种抗原的细胞、组织或器官的免疫反应的发生或开始的免疫抑制或致耐受性免疫反应。
[0113]
本文公开了如本文定义的乳酸菌或组合物，其用于调节受试者的免疫反应。
[0114]
本文公开了如本文定义的乳酸菌或组合物在制备用于调节受试者免疫反应的药物中的用途。
[0115]
本文公开了包含如本文定义的表达构建体、融合蛋白或乳酸菌的试剂盒。
[0116]
冠词“一个”和“一种”在本文中用于指代冠词的语法对象的一个或多个/一种或多种(即，至少一个/至少一种)。举例来说，“表达构建体”意指一个/种表达构建体或多于一个/种的表达构建体。
[0117]“大约”是指相对于参考量、水平、值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、数额、重量、位置或长度变化多至10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％的量、水平、值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、数额、重量、位置或长度。
[0118]
贯穿本说明书和随后的陈述，除非上下文另有要求，否则词语“包含”以及诸如“包括”和“含有”的变体将被理解为暗示包括规定的整数或步骤或整数或步骤组，但不排除任何其他整数或步骤或整数或步骤组。
[0119]
本说明书中对任何先前出版物(或从中得出的信息)或任何已知事项的引用不是并且也不应被视为认可或承认或任何形式的暗示该先前出版物(或从中得出的信息)或已知事项构成本说明书相关领域的公知常识的一部分。
[0120]
本领域的技术人员将理解，除了具体描述的之外，这里描述的本发明可以进行变化和修改。应当理解，本发明包括落入精神和范围内的所有此类变化和修改。本发明还包括本说明书中单独或共同提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任何两个或更多个所述步骤或特征的任何和所有组合。
[0121]
现在将参考以下实施例描述本发明的某些实施方案，这些实施例仅用于说明的目的，而不是用于限制上文描述的一般性的范围。
实施例
[0122]
实施例1
[0123]
cad4a基因构建体的设计和蛋白质构建体的表达
[0124]
pfam数据库的搜索揭示了跨乳杆菌属和乳球菌属及其噬菌体的87个sh3_5同系物。选择了先前未表征的lys2(lp_3093)(一种来自植物乳杆菌wcfs1菌株的胞壁酸酶)中的细胞锚定结构域。全长胞壁酸酶是860个氨基酸的蛋白质，预期分子量为84kda，在其c末端有跨越残基471和860的5个sh3_5重复；每个重复是60个残基。
[0125]
为了评估这个五重复sh3_5结构域的表面展示潜力，sirius蓝色荧光蛋白被用作报告因子。选择sirius是因为它在低ph值(pka《3)下的光稳定性，这在后来的模拟消化实验中是有利的。五重复结构域被克隆到pet22b质粒中的sirius下游，但融合蛋白不溶且难以纯化。仅包含r1-r3的截短结构域(此后称为cad4a)提供更易处理的表达，并且通过sds-page和针对n末端his标签的蛋白质印迹很容易检测sirius缀合物(si-cad4a)。在表达过程中有一些蛋白质降解，但大部分可溶性部分是全长蛋白质。
[0126]
细菌菌株、培养条件和质粒组装
[0127]
本实施例中使用的细菌菌株和质粒列于表1。在大肠杆菌turbo中进行克隆，在大肠杆菌bl21(de3)中表达蛋白质，如下一节详述的。在补充了100μg/ml羧苄青霉素的lb琼脂上选择大肠杆菌。乳酸菌在37℃的静态未通气mrs肉汤(sigma，usa)中生长。
[0128]
表2列出了本研究中使用的质粒、引物和合成基因片段。引物和基因片段由integrated dna technologies(usa)合成。gibson组装用于构建所有质粒。蛋白质构建体
在图4a和4b的底部图中示意性说明。简而言之，蛋白质包含n端6
×
his标签和c端cad4a结构域。功能结构域和cad4a结构域之间的间隔区长度为12、24或36个残基，序列在序列9中给出。
[0129]
对于sirius构建体，pet22b质粒首先用引物f1和r1线性化，并与片段g10组装成pet22b-sirius。pet22b-sirius用引物f1和r7或r6线性化，在与基因片段g5组装后分别得到pet22b-si-cad4a12或-si-cad4a24。使用引物f15和r5从pet22b-si-cad4a24亚克隆cad4a，然后与用f1和r26线性化的pet-sirius组装，得到pet22b-si-cad4a36。
[0130]
对于sod构建体，g29用引物f18和r37扩增，pet22b-sirius用引物f1和r4线性化；然后将两个片段组装成pet22b-sod。pet22b-sod用引物f1和r24或r25线性化，在与基因片段g5组装后分别得到pet22b-sod-cad4a12或-sod-cad4a24。使用引物f15和r5从pet22b-si-cad4a24亚克隆cad4a，然后与用f1和r27线性化的pet-sod组装，得到pet22b-sod-cad4a36。
[0131]
蛋白表达
[0132]
过夜大肠杆菌培养物在terrific broth中按1:100稀释，并生长至光密度od
600
～0.8。此时，将温度降至20℃，并添加山梨糖醇至0.4m的浓度。添加山梨糖醇仅用于cad4a蛋白缀合物的表达，以减少蛋白聚集。用0.2mm iptg诱导表达，并允许在20℃下进行6小时。然后将细胞以4000g沉淀10分钟，重悬于tris缓冲液(50mm tris，0.3m nacl，ph8)，并进行一次冻融循环然后在冰上用探头超声仪(microson xl2000，10s on，10s off，8个循环)裂解。将裂解物在4℃下以12,000g沉淀30分钟，并在pd-10柱中的ni-nta树脂(qiagen，usa)上分离。his标记的蛋白质用150mm咪唑洗脱，然后浓缩并缓冲液交换到1
×
pbs(ph7.4)中，并在4℃下储存直至使用。
[0133]
sds-page和蛋白质印迹
[0134]
使用bradford试剂(biorad)测定蛋白质浓度。按照制造商的方案，在nupage 4
–
12％ bis-tris凝胶(life technologies)上分析蛋白质样品。凝胶用instantblue(expedeon)染色或使用半干法在20v下持续20分钟转移到硝酸纤维素膜上(trans-blot，bio-rad)。膜用tbst(1
×
tbs，0.1％ tween20)洗涤，在室温下用tbst中的5％w/v脱脂奶粉封闭1小时，然后在室温下暴露于1:10,000稀释的hrp缀合的抗-his抗体(merck)1小时，然后使用制造商的方案使用clarity western ecl印迹底物(bio-rad)进行检测。凝胶图像是在chemidoc mp成像系统(bio-rad)上采集的，印迹是在imagequant las 500成像仪(ge healthcare)上成像的。图4给出了所有纯化蛋白的sds-page和蛋白质印迹分析。
[0135]
表1.本实施例中使用的细菌菌株和质粒。
[0136]
[0137][0138]
表2.本实施例中使用的引物和合成基因片段。
[0139]
[0140]
[0141][0142]
实施例2
[0143]
sirius-cad4a在乳酸菌上的异源展示
[0144]
sirius-cad4a与乳酸菌的锚定
[0145]
将干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和乳酸乳球菌培养至对数中期(od
600 0.8-1.2)或静止期(过夜培养)，用10％甘油洗涤一次，然后重悬于mrs和20％甘油的50:50混合物中，等分并冷冻用于后续细胞结合研究。除非另有说明，否则以下方案用于本实施例中的结合研究。对数期细胞用结合缓冲液(1
×
pbs，ph5)洗涤两次，稀释至od
600
＝1.5，并重悬于含有2μm sirius-cad4a12的75μl结合缓冲液中。将混合物在37℃下在不摇动的情况下孵育1.5小时，然后用相同的结合缓冲液沉淀并洗涤两次，然后转移到黑色96孔聚苯乙烯板中进行荧光测量。在分光光度计(tecan，usa)上测量细胞相关荧光，激发波长为355nm，发射波长为424nm。减去细胞的背景荧光以获得相对荧光单位(rfu)的读数。所有研究一式三份进行。使用dapi过滤器和60
×
油浸镜头在nikon eclipse ni-u显微镜上进行细胞成像。图5a显示了所有五种测试的lab菌株的细胞相关荧光。将cad4a添加到sirius后，发酵乳杆菌上的细胞相关荧光至少增加两倍。图5b显示了荧光蛋白在发酵乳杆菌上的分布，使用荧光显微镜成像。
[0146]
实施例3
[0147]
影响cad4a与发酵乳杆菌的结合的因素
[0148]
细胞预处理的影响
[0149]
发酵乳杆菌在37℃下在摇动的情况下用5m licl或10％v/v三氯乙酸(tca)处理1小时。在结合实验(如上所述)之前，细胞用ph7 pbs洗涤两次，并用ph5 pbs洗涤一次。tca水解磷壁酸(ta)，一种主要的细胞壁成分，而5m licl去除非共价结合的表面蛋白。如图8所示，用licl处理导致细胞锚定增加两倍，因为表面蛋白的去除暴露了针对cad4a的更多的肽聚糖结合位点。tca处理没有显著影响cad4a结合，因此锚定结构域不靶向细胞壁ta。
[0150]
细胞生长期、盐浓度、ph和结合温度的影响
[0151]
在对数中期和静止期用发酵乳杆菌研究了细胞生长期对cad4a结合能力的影响。盐浓度对cad4a与发酵乳杆菌结合的影响使用补充nacl至终浓度为0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4m nacl的磷酸盐缓冲液(ph5)进行测试。使用ph 4.5、5、5.5、6、6.5、7、8和9的pbs评估ph值的影响。结合温度的影响在25℃、30℃和37℃下测试，每半小时时间点测试直到3小时。这些研究中的蛋白质浓度为2μm；如上所述进行蛋白质结合和荧光测量。
[0152]
图6比较了对数期和静止期发酵乳杆菌的表面展示，显示后者的蛋白质结合较少。图9a在3小时内跟踪cad4a结合，显示在30℃和37℃下，在1.5小时内实现了最大结合。图9b显示cad4a锚定在发酵乳杆菌上的最佳ph为5及以下。图9c显示高盐浓度(》200mm nacl)对锚定产生负面影响，可能是通过破坏cad4a和肽聚糖之间的非共价相互作用。
[0153]
实施例4
[0154]
cad4a对发酵乳杆菌结合能力的测定
[0155]
发酵乳杆菌的新鲜过夜培养物用结合缓冲液(ph5 pbs)洗涤两次，稀释至od
600
＝1.5，并与70μl不同浓度的sirius-cad4a12(0、0.5、1、2、3、4、5μm)一起孵育。这用于建立标准曲线以在存在细胞的情况下将rfu与蛋白质浓度相关联。随后，沉淀细胞混合物并如上所述测定细胞荧光。所有数据点代表至少三个实验的平均值。对于cad4a与细胞壁的结合假定langmuir吸附等温线。使用非线性回归分析将结合数据拟合到langmuir模型以确定b
max
，即饱和时的蛋白质浓度。使用b
max
和标准曲线计算结合容量。图7给出了给定细胞密度(～109个细胞/ml)1.05μm蛋白质的饱和浓度或每个细胞平均5
×
105个分子的饱和浓度。
[0156]
实施例5
[0157]
sod-cad4a在发酵乳杆菌上的异源展示及间隔区长度对sod活性的影响
[0158]
间隔区长度对表面展示的超氧化物歧化酶活性的影响
[0159]
来自银光委陵菜(potentilla atrosanguinea)的超氧化物歧化酶(sod)用c端cad4a和在酶和锚定结构域之间的三个不同的间隔区长度(12、24和36个残基)进行工程化。蛋白质在大肠杆菌中表达，蛋白质结合如实施例2中所述用对数生长期发酵乳杆菌进行。洗涤后，将细胞重悬于结合缓冲液中用于sod活性测定。根据制造商的方案，使用商业sod试剂盒(sigma-aldrich 19160)进行测定。来自一式三份的前10分钟(线性范围)的平均梯度用于计算每个样品的活性。图10a比较了三种sod变体的活性，显示最短的间隔区的酶活性的下降。所有三个间隔区变体在细胞锚定后都具有非常相似的活性(图10b)，因此，12-36个残基的间隔区长度在锚定后对蛋白质功能的影响最小。
[0160]
实施例6
[0161]
模拟胃消化下包封的细菌中表面展示的稳定性
[0162]
细胞包封
[0163]
包封改编自先前描述的方案。低粘度藻酸盐(sigma-aldrich)在蒸馏水中制成6％w/v原液。将低分子量壳聚糖(sigma-aldrich)溶解在0.1m乙酸中，得到0.5％w/v的浓度，并将最终ph值调节至5。发酵乳杆菌的新鲜过夜培养物用结合缓冲液(ph5 pbs)洗涤两次，稀释至od
600
＝1.5，并与2μm sod-cad4a36一起孵育。洗涤后，将2ml细胞重悬于1.2ml 4％低粘度藻酸盐(用结合缓冲液稀释的6％原液)中并剧烈混合。使用21g针将混合物逐滴挤出到0.15m cacl2浴(ph5)中，将珠子在室温下搅拌1小时，然后用结合缓冲液冲洗一次。随后将珠子添加到0.5％壳聚糖中并搅拌10分钟，然后用结合缓冲液洗涤两次并保持在4℃直至使用。空珠子和含有1μm sod(不含细胞)的珠子作为对照。
[0164]
体外消化
[0165]
如先前所述，将模拟胃液(sgf)制备为1
×
浓缩物。胃蛋白酶(sigma-aldrich p6887)和所有必需的化学品均购自sigma-aldrich。将柠檬酸钠以0.15m的浓度溶解在pbs(ph5)中。每种测试条件使用10个藻酸盐-壳聚糖珠子。将珠子悬浮在125μl蒸馏水和等体积
的sgf中，添加cacl2(终浓度0.075mm)和胃蛋白酶(终浓度0.5mg/ml)。将混合物在37℃下振荡孵育2小时，然后用pbs(ph7)冲洗两次。将珠子与ph5 pbs一起孵育作为对照。将珠子分散在40℃的250μl柠檬酸盐缓冲液中，然后以10,000g离心10分钟。将细胞沉淀重悬于250μl1
×
pbs(ph5)中用于sod测定。残留活性表示相对于pbs对照的sgf处理的珠子的细胞相关酶活性。图11显示，在模拟胃消化后，超过90％的细胞相关酶活性得以保留，因此聚合物基质为表面展示的酶提供了实质性保护。
[0166]
实施例7
[0167]
包含不同数量的sh3_5重复的sirius-cad4a变体的异源展示具有不同数量的sh3_5重复的si-cad4a变体的表达
[0168]
构建了包含lys2细胞壁靶向结构域中的1到5个sh3_5重复的cad4a的变体，所有这些变体都与sirius荧光蛋白缀合，由12个残基的间隔区分隔开(图12a)。这些变体在大肠杆菌中表达并纯化用于在sds-page凝胶上进行分析。如图12b所示，在一个重复和五个重复的变体(分别为cad4a1r和cad4a5r)的表达过程中，存在锚定结构域的明显切割。后者的产率也明显低于其他构建体。两个和四个重复的变体(cad4a2r、cad4a4r)的产率与三个重复的变体(cad4a3r)相似，在表达过程中切割最少。
[0169]
具有不同数量的sh3_5重复的si-cad4a变体的异源展示
[0170]
然后比较si-cad4a变体锚定到对数生长期和静止生长期(如实施例2所述)的发酵乳杆菌的能力。如图12c所示，对于cad4a4r观察到最低的细胞相关荧光，而cad4a2r在静止期细菌中给出最好的锚定效果。cad4a2r和cad4a3r在对数期细胞中都提供了类似的良好锚定。

技术特征：
1.一种编码融合蛋白的表达构建体，所述表达构建体包含编码用于表达的第一多肽和衍生自植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)lys2自溶素的细胞壁靶向区域的第二多肽的核酸，其中第一多肽和第二多肽连接形成融合蛋白。2.权利要求1的表达构建体，其中所述第一多肽和第二多肽由接头多肽分开。3.权利要求1的表达构建体，其中所述第一多肽位于所述第二多肽的上游。4.权利要求1-3中任一项的表达构建体，其中所述第一多肽位于所述第二多肽的下游。5.权利要求1-4中任一项的表达构建体，其中乳杆菌自溶素包含细胞壁靶向区域。6.权利要求1-5中任一项的表达构建体，其中乳杆菌自溶素包含与seq id no：1的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。7.权利要求1-6中任一项的表达构建体，其中所述第二多肽包含sh3类型5基序多肽。8.权利要求1-7中任一项的表达构建体，其中所述第二多肽包含与seq id no：2、seq id no：3、seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6或其组合的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。9.权利要求1-8中任一项的表达构建体，其中所述第二多肽包含与seq id no：7的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。10.权利要求1-9中任一项的表达构建体，其中所述第一多肽是超氧化物歧化酶(sod)。11.一种重组宿主细胞，其包含前述权利要求中任一项的表达构建体。12.权利要求11的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌(escherichia coli)或乳酸乳球菌(lactococcus lactis)。13.一种由权利要求1-10中任一项的表达构建体编码的融合蛋白。14.一种在乳酸菌表面展示融合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：a)在宿主细胞中表达权利要求13的融合蛋白，和b)将融合蛋白固定到乳酸菌表面。15.权利要求14的方法，其中所述方法包括在步骤b)之前分离和/或纯化所述融合蛋白。16.权利要求14或15的方法，其中所述乳酸菌是乳球菌属(lactococcus)或乳杆菌属(lactobacillus)细菌。17.权利要求16的方法，其中所述乳酸菌是发酵乳杆菌(lactobacillus fermentum)。18.一种乳酸菌，其包含附着于其表面的权利要求13的融合蛋白。19.一种包含权利要求18的乳酸菌的组合物。20.权利要求19的组合物，其中所述组合物是冷冻干燥或水合的组合物。21.权利要求18的乳酸菌或权利要求19或20的组合物，其用作药物。22.一种治疗受试者的病况或疾病的方法，所述方法包括向受试者施用权利要求18的乳酸菌或权利要求19或20的组合物。23.权利要求18的乳酸菌或权利要求19或20的组合物，其用于治疗受试者的病况或疾病。24.权利要求18的乳酸菌或权利要求19或20的组合物在制备用于治疗受试者的病况或疾病的药物中的用途。25.权利要求22的方法、权利要求23的乳酸菌或权利要求24的用途，其中所述病况或疾病是炎性肠病、口腔粘膜炎、癌症或过敏反应。
26.一种预防受试者的病况或疾病的方法，所述方法包括向受试者施用权利要求18的乳酸菌或权利要求19或20的组合物。27.权利要求18的乳酸菌或权利要求19或20的组合物，其用于预防受试者的病况或疾病。28.权利要求18的乳酸菌或权利要求19或20的组合物在制备用于预防受试者的病况或疾病的药物中的用途。29.权利要求26的方法、权利要求27的乳酸菌或权利要求28的用途，其中所述病况或疾病是病原体感染。

技术总结
本发明一般涉及分子生物学和微生物学领域。本文提供了一种编码融合蛋白的表达构建体。在一个实施方案中，提供了一种编码融合蛋白的表达构建体，所述表达构建体包含编码用于表达的第一多肽和衍生自植物乳杆菌Lys2自溶素的细胞壁靶向区域的第二多肽的核酸，其中第一多肽和第二多肽连接形成融合蛋白。在特定实施方案中，第二多肽包含CAD4a结构域，其是仅包含Lys2自溶素的五重复SH3_5结构域的R1-R3的截短结构域。本文还提供了如本文定义的融合蛋白和融合蛋白的用途。白和融合蛋白的用途。白和融合蛋白的用途。


技术研发人员：郑培坤 区栩维
受保护的技术使用者：新加坡科技研究局
技术研发日：2021.09.10
技术公布日：2023/8/4