一种脱细胞外基质及其制备方法和应用

1.本发明涉及生物医学工程技术领域，尤其涉及一种脱细胞外基质及其制备方法和应用。


背景技术：

2.脱细胞外基质是指采用特定的方法脱除组织/器官中的细胞后获得的生物大分子混合物，其不仅避免组织/器官中后期可能会引起炎症等不良排斥反应，还保留了组织/器官内的三维结构(如胶原和弹性蛋白)和功能生物大分子(如氨基葡聚糖、蛋白聚糖和生长因子等)，具有良好的生物相容性、诱导组织再生性以及可降解性，近年来在组织修复以及再生医学领域受到了广泛关注。
3.一般来说，制备脱细胞外基质时首先是将软组织切小或者切碎，然后用物理方法、化学方法或生物方法破坏细胞膜，最后用dna酶处理，去除免疫原性的dna。其中，物理方法如超声、反复冻融和机械搅拌等无法彻底的去除细胞。化学方法是借助化学溶剂来改变细胞膜的通透性，但由于化学溶剂与细胞外基质中的蛋白质相互作用，从而导致脱细胞外基质中的成分存在一定程度损失。生物方法主要是利用酶对细胞进行水解，但是酶浓度过高或者作用时间过长时，也会对细胞外基质中的蛋白质有一定程度的破坏。此外，目前通常需要将软组织切碎为小块状以实现对细胞的脱除，无法得到大块整张的膜状脱细胞外基质。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种脱细胞外基质及其制备方法和应用，本发明提供的方法处理效率高，对脱细胞外基质内活性物质损伤较小，且能够获得整张大块膜状脱细胞外基质。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一种脱细胞外基质的制备方法，包括以下步骤：
7.将软组织置于第一有机溶剂中进行浸泡处理，得到浸泡软组织；
8.将所述浸泡软组织与第二有机溶剂混合，在超临界二氧化碳存在条件下进行脱细胞处理，得到脱细胞外基质。
9.优选地，所述软组织为动物膜状组织。
10.优选地，所述软组织为猪皮、牛皮或鱼皮。
11.优选地，所述第一有机溶剂和第二有机溶剂为醇类溶剂。
12.优选地，所述浸泡处理的温度为25～45℃，时间为0.5～12h。
13.优选地，所述浸泡软组织与第二有机溶剂的用量比为(0.5～2)g：1ml。
14.优选地，所述脱细胞处理的次数为1～5次，每次脱细胞处理的条件包括：温度独立为32～65℃，压力独立为7.38～40mpa，时间独立为0.5～12h；每次脱细胞处理完成后的泄压速率独立为5～20mpa/s。
15.优选地，所述脱细胞处理后还包括依次进行洗涤和干燥。
16.本发明提供了上述技术方案所述制备方法制备得到的脱细胞外基质，呈膜状，面积为80～120cm2，dna含量小于50ng/mg。
17.本发明提供了上述技术方案所述脱细胞外基质在制备组织修复材料或组织再生材料中的应用。
18.本发明提供了一种脱细胞外基质的制备方法，包括以下步骤：将软组织置于第一有机溶剂中进行浸泡处理，得到浸泡软组织；将所述浸泡软组织与第二有机溶剂混合，在超临界二氧化碳存在条件下进行脱细胞处理，得到脱细胞外基质。本发明首先将软组织置于第一有机溶剂中进行浸泡处理，可以对软组织进行脱水以及脱脂处理，另外软组织经过浸泡处理后能够更好的使超临界二氧化碳进入软组织，有利于提高超临界处理效果；本发明基于超临界二氧化碳流体技术进行脱细胞处理，处理过程中有机溶剂会被二氧化碳带走，几乎无有机溶剂残留，处理效率高、操作时间短、不使用dna酶，对脱细胞外基质内活性物质损伤较小，且能够获得整张大块膜状脱细胞外基质。
附图说明
19.图1为本发明中基于超临界二氧化碳流体技术高效制备膜状脱细胞基质的流程示意图；
20.图2为原始猪皮组织、实施例1以及对比例1～2制备的猪皮脱细胞外基质的dna含量对比图；
21.图3为实施例1制备的猪皮脱细胞外基质与原始猪皮的对比照片；
22.图4为实施例1制备的猪皮脱细胞外基质与原始猪皮的的扫描电镜照片；
23.图5为不同温度条件下制备的猪皮脱细胞外基质与原始猪皮的dna含量对比图；
24.图6为不同压力条件下制备的猪皮脱细胞外基质与原始猪皮的dna含量对比图；
25.图7为不同处理时间条件下制备的猪皮脱细胞外基质与原始猪皮的dna含量对比图；
26.图8为不同泄压速率条件下制备的猪皮脱细胞外基质与原始猪皮的dna含量对比图。
27.图9为实施例1制备的猪皮脱细胞外基质以及原始猪皮组织的h&e染色和masson染色图。
具体实施方式
28.本发明提供了一种脱细胞外基质的制备方法，包括以下步骤：
29.将软组织置于第一有机溶剂中进行浸泡处理，得到浸泡软组织；
30.将所述浸泡软组织与第二有机溶剂混合，在超临界二氧化碳存在条件下进行脱细胞处理，得到脱细胞外基质。
31.本发明将软组织置于第一有机溶剂中进行浸泡处理，得到浸泡软组织。在本发明中，所述软组织优选为动物膜状组织，更优选为猪皮、牛皮或鱼皮；所述软组织的面积优选为80～120cm2；在本发明的实施例中，具体采用面积为100cm2的新鲜的整片猪皮组织。在本发明中，所述第一有机溶剂优选为醇类溶剂，更优选为甲醇和/或乙醇，进一步优选为无水乙醇。本发明对所述第一有机溶剂的用量没有特殊限定，能够浸没所述软组织即可。在本发
明中，所述浸泡处理的温度优选为25～45℃，更优选为25～30℃；时间优选为0.5～12h，更优选为1～5h。本发明通过浸泡处理可以对软组织进行脱水以及脱脂处理，另外软组织经过浸泡处理后能够更好的使超临界二氧化碳进入软组织，有利于提高超临界处理效果。
32.得到浸泡软组织后，本发明将所述浸泡软组织与第二有机溶剂混合，在超临界二氧化碳存在条件下进行脱细胞处理，得到脱细胞外基质。在本发明中，所述第二有机溶剂优选为醇类溶剂，更优选为甲醇和/或乙醇，进一步优选为无水乙醇。在本发明中，所述浸泡软组织与第二有机溶剂的用量比优选为(0.5～2)g：1ml，更优选为1g：1ml。在本发明中，所述脱细胞处理的次数优选为1～5次，更优选为1～2次。在本发明中，每次脱细胞处理的条件优选包括：温度独立优选为32～65℃，具体可以为32℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃或65℃；压力独立优选为7.38～40mpa，具体可以为7.38mpa、10mpa、15mpa、20mpa、25mpa、30mpa、35mpa或40mpa；时间独立优选为0.5～12h，具体可以为0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、10h或12h；每次脱细胞处理完成后的泄压速率独立优选为5～20mpa/s，具体可以为5mpa/s、10mpa/s、15mpa/s或20mpa/s。在本发明中，所述脱细胞处理优选在超临界高压釜中进行，具体是将浸泡软组织投入到超临界高压釜中，并加入第二有机溶剂，通入二氧化碳使压力上升，在上述压力以及温度条件下进行处理，之后打开出口阀门，按上述泄压速率进行泄压快速膨胀，得到脱细胞外基质。
33.超临界流体兼具气体和液体的特性，具有密度大、粘度低、扩散性好等特性。其中，二氧化碳性质稳定，具有无毒、无味、无害、不易燃易爆等良好的物理化学性质，其超临界温度和压力为31.26℃和7.38mpa。本发明基于超临界二氧化碳流体技术能够高效制备膜状脱细胞基质，该脱细胞外基质采用超临界二氧化碳为溶剂，以第二有机溶剂作为共溶剂，通过利用超临界二氧化碳的快速膨胀作用，可处理大面积整张的软组织，最终能够获得结构完整、细胞残留少的膜状大面积脱细胞外基质。本发明基于超临界二氧化碳进行脱细胞处理，该方法为纯物理方法，处理效率高，获得的脱细胞外基质dna残留量较低，dna含量低于50ng/mg；避免了采用化学方法造成的有机溶剂残留，处理过程中不添加dna酶，避免了生物方法中dna酶加入对生物大分子的破坏作用；该方法简单易行，制备条件可控，不需要将软组织切小或切碎，可制得大面积膜状脱细胞外基质，具有较强的实用性和极大的应用前景，为脱细胞外基质的拓展应用奠定了基础。本发明优选在上述条件下进行脱细胞处理，有利于保证具有较好的细胞脱除效果；例如，泄压速率越快，气体膨胀越快，脱细胞的效果会越好。
34.在本发明中，所述脱细胞处理后优选还包括依次进行洗涤和干燥。在本发明中，所述洗涤所用试剂优选为纯水，所述洗涤优选在超声条件下进行；所述洗涤的次数优选为1～5次，更优选为2～3次；所述干燥优选为冷冻干燥。
35.本发明提供了上述技术方案所述制备方法制备得到的脱细胞外基质，呈膜状，面积为80～120cm2，dna含量小于50ng/mg。
36.本发明提供了上述技术方案所述脱细胞外基质在制备组织修复材料或组织再生材料中的应用。在本发明中，所述脱细胞外基质具体可以应用于制备止血材料或人工皮肤。
37.图1为本发明中基于超临界二氧化碳流体技术高效制备膜状脱细胞基质的流程示意图(上方为基于宏观角度的流程示意图，下方为基于微观角度的流程示意图)，下面将结合图1以及本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述
的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
38.实施例1
39.取整片猪皮组织(100cm2)放入无水乙醇中，在25℃条件下浸泡1h，将浸泡后的猪皮组织(100g)投入到超临界高压釜中，并加入25ml无水乙醇，通入二氧化碳使压力上升，在压力为15mpa且温度为45℃条件下进行脱细胞处理4h；之后按泄压速率为10mpa/s进行泄压快速膨胀，泄压完成后，取出猪皮组织，放入到纯水中超声清洗处理2次，之后冷冻干燥，得到膜状猪皮脱细胞外基质。
40.对比例1
41.按照实施例1的方法制备猪皮脱细胞外基质，不同之处仅在于脱细胞处理前猪皮组织不经过乙醇浸泡。
42.对比例2
43.采用化学方法制备猪皮脱细胞外基质，步骤如下：
44.将整片猪皮组织(100cm2)加入到含1％(w/v)triton-100与25mm edta的pbs溶液中，在摇床转速为120rpm条件下处理14h；处理完成后，取出猪皮组织使用去离子水浸泡清洗3次，之后冷冻干燥，得到猪皮脱细胞外基质。
45.测试例1
46.以原始猪皮组织、实施例1以及对比例1～2制备的猪皮脱细胞外基质为样品，测试其dna含量，测试方法如下：
47.(1)分别取10mg冻干后的猪皮脱细胞基质和未脱细胞处理的正常猪皮组织，剪成尽量小的碎片，转移至1.5ml离心管中，向其中加入220μlbuffer atl和20μl蛋白酶k，混匀，55℃温水浴消化处理3h，期间颠倒混匀几次；
48.(2)加入10μlrnasea至消化液中，颠倒混匀，室温放置10min；
49.(3)将250μlbufferdl加入至消化液中，高速涡旋10s，70℃水浴处理10min；
50.(4)将250μl无水乙醇加入至消化液中，涡旋15s；
51.(5)将dna结合柱装在2ml收集管中，将步骤(4)获得的混合液(包括沉淀)转移到dna结合柱内，在转速为12,000
×
g条件下离心1min；
52.(6)将滤液倒弃，将dna结合柱再次装回收集管中，将500μlbuffer gw1加入至dna结合柱中，在转速为12,000
×
g条件下离心1min；
53.(7)将滤液倒弃，把dna结合柱再次装回收集管中，将650μlbuffer gw2加入到dna结合柱中，在转速为12,000
×
g条件下离心1min；
54.(8)将滤液倒弃，把dna结合柱再次装回收集管中，在转速为12,000
×
g条件下离心1min；
55.(9)将dna结合柱装到新的1.5ml离心管中，将100μl预热至70℃的bufferae加入到至dna结合柱的膜中央位置，静置3min，在转速为12,000
×
g条件下离心1min；
56.(10)再次将100μl预热至70℃的bufferae加到dna结合柱的膜中央位置，静置3min，在转速为12,000
×
g条件下离心1min；
57.(11)丢弃dna结合柱，离心管中得到待测液体，使用nanodrap 2000检测dna浓度。
58.原始猪皮组织、实施例1以及对比例1～2制备的猪皮脱细胞外基质的dna含量结果如图2所示。由图2可知，实施例1中采用超临界二氧化碳流体技术制备的猪皮脱细胞基质的dna含量(14.21ng/mg)小于对比例1中采用超临界方法但不经过乙醇浸泡制备的猪皮脱细胞基质dna含量(66.25ng/mg)，以及采用化学方法制备的猪皮脱细胞外基质dna含量(77.23ng/mg)，符合脱细胞外基质的使用标准。
59.对实施例1制备的猪皮脱细胞外基质以及原始猪皮组织拍照，结果如图3所示。由图3可知，实施例1中经脱细胞处理的猪皮组织由红色变为白色，说明主要的细胞物质被有效去除。
60.对实施例1制备的猪皮脱细胞外基质进行形貌观察，具体是将猪皮脱细胞外基质切成小块粘贴至导电胶上后喷金30s，使用扫描电镜观察不同样品的形貌，并与原始猪皮组织进行比较，扫描电镜图如图4所示。由图4可知，未经脱细胞处理的原始猪皮组织呈现糊状，实施例1中经脱细胞处理后的猪皮组织结构呈现纤维丝状结构，具有一定的孔隙，主要成分是细胞外基质中的胶原纤维，说明在脱细胞过程中并没有对组织结构造成较大的破坏。
61.实施例2
62.按照实施例1的方法制备猪皮脱细胞外基质，不同之处仅在于脱细胞处理的温度为40℃。
63.实施例3
64.按照实施例1的方法制备猪皮脱细胞外基质，不同之处仅在于脱细胞处理的温度为50℃。
65.对实施例2～3制备的猪皮脱细胞外基质进行dna含量测试，以原始猪皮组织作为对照，同时与实施例1制备的猪皮脱细胞外基质dna含量进行比较，结果如图5所示。由图5可知，不同温度条件对猪皮脱细胞外基质的dna含量有一定影响。
66.实施例4
67.按照实施例1的方法制备猪皮脱细胞外基质，不同之处仅在于脱细胞处理的压力为10mpa。
68.实施例5
69.按照实施例1的方法制备猪皮脱细胞外基质，不同之处仅在于脱细胞处理的压力为20mpa。
70.对实施例4～5制备的猪皮脱细胞外基质进行dna含量测试，以原始猪皮组织作为对照，同时与实施例1制备的猪皮脱细胞外基质dna含量进行比较，结果如图6所示。由图6可知，不同压力条件对猪皮脱细胞外基质的dna含量有一定影响。
71.实施例6
72.按照实施例1的方法制备猪皮脱细胞外基质，不同之处仅在于脱细胞处理的时间为8h。
73.实施例7
74.按照实施例1的方法制备猪皮脱细胞外基质，不同之处仅在于脱细胞处理的时间为12h。
75.对实施例6～7制备的猪皮脱细胞外基质进行dna含量测试，以原始猪皮组织作为
对照，同时与实施例1制备的猪皮脱细胞外基质dna含量进行比较，结果如图7所示。由图7可知，不同处理时间对猪皮脱细胞外基质的dna含量有一定影响。
76.实施例8
77.按照实施例1的方法制备猪皮脱细胞外基质，不同之处仅在于脱细胞处理结束后泄压速率为5mpa/s。
78.实施例9
79.按照实施例1的方法制备猪皮脱细胞外基质，不同之处仅在于脱细胞处理结束后泄压速率为15mpa/s。
80.对实施例8～9制备的猪皮脱细胞外基质进行dna含量测试，以原始猪皮组织作为对照，同时与实施例1制备的猪皮脱细胞外基质dna含量进行比较，结果如图8所示。由图8可知，不同泄压速率对猪皮脱细胞外基质的dna含量有一定影响。
81.测试例2
82.对实施例1制备的猪皮脱细胞外基质以及原始猪皮组织进行h&e染色和masson染色，结果如图9所示。由图9可知，h&e染色结果显示，正常的猪皮组织，细胞核清晰可见，并具有良好的组织结构；实施例1制备的猪皮脱细胞外基质，细胞核几乎不可见，说明细胞已经被去除干净。masson染色结果显示实施例1制备的猪皮脱细胞外基质含有大量的胶原纤维。
83.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种脱细胞外基质的制备方法，包括以下步骤：将软组织置于第一有机溶剂中进行浸泡处理，得到浸泡软组织；将所述浸泡软组织与第二有机溶剂混合，在超临界二氧化碳存在条件下进行脱细胞处理，得到脱细胞外基质。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述软组织为动物膜状组织。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述软组织为猪皮、牛皮或鱼皮。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第一有机溶剂和第二有机溶剂为醇类溶剂。5.根据权利要求1或4所述的制备方法，其特征在于，所述浸泡处理的温度为25～45℃，时间为0.5～12h。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述浸泡软组织与第二有机溶剂的用量比为(0.5～2)g：1ml。7.根据权利要求1或6所述的制备方法，其特征在于，所述脱细胞处理的次数为1～5次，每次脱细胞处理的条件包括：温度独立为32～65℃，压力独立为7.38～40mpa，时间独立为0.5～12h；每次脱细胞处理完成后的泄压速率独立为5～20mpa/s。8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述脱细胞处理后还包括依次进行洗涤和干燥。9.权利要求1～8任一项所述制备方法制备得到的脱细胞外基质，呈膜状，面积为80～120cm2，dna含量小于50ng/mg。10.权利要求9所述脱细胞外基质在制备组织修复材料或组织再生材料中的应用。

技术总结
本发明提供了一种脱细胞外基质及其制备方法和应用，属于生物医学工程技术领域。本发明将软组织置于第一有机溶剂中进行浸泡处理，得到浸泡软组织；将所述浸泡软组织与第二有机溶剂混合，在超临界二氧化碳存在条件下进行脱细胞处理，得到脱细胞外基质。本发明首先将软组织置于第一有机溶剂中进行浸泡处理，可以对软组织进行脱水以及脱脂处理，另外软组织经过浸泡处理后能够更好的使超临界二氧化碳进入软组织，有利于提高超临界处理效果；本发明基于超临界二氧化碳流体技术进行脱细胞处理，处理过程中有机溶剂会被二氧化碳带走，几乎无有机溶剂残留，处理效率高对脱细胞外基质内活性物质损伤较小，且能够获得整张大块膜状脱细胞外基质。外基质。外基质。


技术研发人员：陈爱政 王士斌 卢晓畅 陈标奇 徐沛瑶
受保护的技术使用者：华侨大学
技术研发日：2023.06.07
技术公布日：2023/8/3