家蚕乙酰转移酶BmMOF基因的应用

家蚕乙酰转移酶bmmof基因的应用
技术领域
1.本发明属于基因工程及蛋白功能技术领域，设计家蚕乙酰转移酶bmmof基因的应用，具体公开了家蚕乙酰转移酶bmmof基因在调控杆状病毒bmnpv侵染中的应用。


背景技术：

2.家蚕是一种鳞翅目模式昆虫，专食桑叶为其食性特征，是由原始蚕完全驯化来得一种经济昆虫。家蚕核型多角体病毒(bombyx mori nucleopolyhedrovirus，bmnpv)是家蚕血液型脓病病原，由其引起的病毒病给蚕业造成极大的经济损失。目前对于bmnpv的防控还停留在对饲养环境物理消毒层面，不能有效解决蚕病问题。随着病毒与宿主细胞博弈互作的深入研究，越来越多的抗病毒蛋白被挖掘，其抗病毒机制也是现在的研究热点。
3.mof(males absent on the first)，又名myst1或kat8，是组蛋白乙酰转移酶myst家族的一员。作为表观遗传系统中的关键调控因子，mof以染色质修饰复合体形式参与细胞的多种生命进程，在基因转录、dna损伤修复、染色体稳态维持、细胞周期、细胞凋亡和肿瘤发生等过程中发挥重要作用。哺乳动物细胞中mof富集在基因的启动子和编码区，具有转录激活功能。细胞应激反应中，mof作为转录调控网络的关键维持因子直接与细胞周期调控基因启动子结合，激活其表达，以保护相应细胞。在靶蛋白识别方面，mof具有较强的底物选择性，通过特异性催化组蛋白h4第16位赖氨酸(h4k16)的乙酰化修饰，减弱h4与h2a-h2b酸性口袋间的作用力，进而改变染色质结构，激活基因转录。此外，mof亦可靶向非组蛋白底物，如抑癌蛋白p53。mof通过催化p53 k120位点的乙酰化，激活p53依赖性凋亡基因的表达，最终诱发细胞凋亡。


技术实现要素：

4.本发明的第一个目的在于针对目前家蚕细胞防御病毒入侵方面有效手段的不足，通过对家蚕乙酰转移酶mof在病毒侵染中的研究，发现其在调控杆状病毒增殖方面具有重要的作用，因此开发上述基因的应用，为家蚕的抗病毒育种、提高抗病毒感染能力等方面提供新思路。
5.家蚕bmmof基因在培育抗家蚕核型多角体病毒家蚕品种中的应用，通过过表达bmmof基因使家蚕获得抗家蚕核型多角体病毒的能力；所述bmmof基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。
6.作为优选，所述bmmof基因编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。
7.作为优选，过表达bmmof抑制bmnpv病毒增殖。
8.作为优选，过表达bmmof能够抑制bmnpv病毒gp41基因mrna的转录表达、降低bmnpv融膜蛋白gp64的表达，同时提高bmmof蛋白底物h4k16乙酰化水平。
9.本发明的第二个目的是提供一种培育抗家蚕核型多角体病毒的家蚕品种的方法，通过在家蚕体内过表达bmmof基因使家蚕获得抗家蚕核型多角体病毒的能力；所述家蚕bmmof基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。
10.本发明的第三个目的是提供家蚕bmmof基因在制备抑制家蚕核型多角体病毒增殖的药物中的应用，所述家蚕bmmof基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。
11.本发明的第四个目的是提供一种家蚕核型多角体病毒抑制剂，包括抑制家蚕bmmof基因表达的药物，所述家蚕bmmof基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。
12.本发明的有益效果如下：
13.本发明通过基因工程技术、细胞生物学手段证实家蚕乙酰转移酶mof能够参与杆状病毒侵染过程并且调控病毒增殖机制。通过过表达和rna干扰的方式，在家蚕卵巢细胞中验证家蚕mof蛋白在bmnpv侵染中的调控作用。
14.本发明克隆了一个调控病毒侵染的家蚕bmmof基因，通过构建真核瞬时表达载体piex-1-bmmof使bmmof蛋白在bmn细胞中高表达；通过设计sirna敲低bmn细胞中mof蛋白的表达；在细胞中转染重组质粒和sirna并以piex-1空载作为对照，以bmnpv的结构基因gp41为分子标记，检测细胞中病毒基因组的复制水平，发现过表达bmmof能显著抑制病毒基因组复制水平，而敲低bmmof则促进病毒基因组复制；通过western blotting检测病毒融膜蛋白gp64表达情况，发现过表达bmmof显著降低bmnpv融膜蛋白gp64的表达，并提高底物h4k16乙酰化水平，敲低bmmof则促进病毒蛋白表达；以带绿色荧光蛋白egfp标记的bmnpv侵染bmn细胞，利用荧光显微镜观察绿色荧光信号识别病毒扩增情况，发现过表达bmmof显著抑制bmnpv增殖，敲低bmmof则促进病毒增殖。上述结果表明，bmmof在家蚕细胞抗bmnpv侵染过程中发挥重要作用，能显著增强细胞抗病毒能力，对揭示宿主与病毒博弈机制、利用基因工程手段改良家蚕抗病毒品系和创制家蚕新种质资源等具有重要理论意义和应用价值。
附图说明
15.图1为瞬时真核表达载体piex-1-bmmof的构建；其中，a为bmmof基因pcr扩增产物；b为酶切验证结果；c本发明所构建的重组载体图谱。
16.图2为bmmof组织特异性及时空表达分布特征分析；其中，a为bmmof在家蚕五龄时期血淋巴、中肠、马氏管、性腺、丝腺、气管、脂肪体、头部、表皮组织中的表达情况；b为bmmof在卵期、一龄至五龄幼虫期、蛹期及成虫时期的表达特征。
17.图3为bmnpv影响bmmof表达模式分析；其中，a为bmnpv侵染对bmmof转录水平的影响；b为bmnpv侵染对bmmof蛋白表达及其底物h4k16乙酰化水平的的影响。
18.图4为过表达bmmof对bmnpv增殖的影响；其中，a为过表达bmmof对杆状病毒基因gp41转录水平的影响；b为过表达bmmof对杆状病毒融膜蛋白gp64表达的影响；c、d为过表达bmmof对病毒扩增的影响。
19.图5为敲低bmmof对bmnpv增殖的影响；其中，a为sirna干扰效率验证；b为敲低bmmof对杆状病毒基因gp41转录水平的影响；c为敲低bmmof表达对杆状病毒融膜蛋白gp64表达的影响；d、e为敲低bmmof对病毒扩增的影响。
具体实施方式
20.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
21.序列表seq id no:1是家蚕bmmof基因的核苷酸序列，序列长度为1326bp，其序列
seq id no:1具体如下所示：
22.atggcaaaaggtgataaagaattagagaagccaatagtgaataatgagttgcctaatcctgagtgtagaagtactgataatgaagactccgagtcggtcccagaacagcctttggacataggagaacattatttagtgcggcgatcggatgagtcatggcacccggctgagattatacagtcgcgatacagtacagcggaatcttgttacgaatattatgtccattatgtcggatatgatagaagactcgacgaatgggtgtcccgccaccgggttatgtcagataggttcgacgtatgcgagcagtcgaacaataacataaactgcgaccacctgctcacggacaaatccggccggaaaataacaaggaatcaaaaacgtaaacatgacgaaataaaccatgtgcagaaaacttacgccgaaatggatccaacgaccgccgcgcttgaaaaggaacatgaagctattactaaagttaaatacatagacaggatacaaattggaaaatatgaaatcgatacttggtattttagtccgtatcctgatgaatatggtaaacaatcaaaattgtggttatgtgaatactgtttgaagtatatgagaatggaaaaaacataccggtaccatctcagtgaatgcacagcacgccaaccccagggtaacgaaatatacagaaaaggtacaatagctatttttgaagcagatggcaaagaacataaaatatattgtcagaatttgtgtttattagccaaattatttttagatcacaaaaccctttattttgatatagaacagtttttattttatatattgtgtgaagttgacaagcaaggagctcaccttgtaggatatttttcaaaagaaaaggattcacctgaaggcaataatgtggcatgtatattgactctacctccatatcagagacaggggtatggtaaactcctgatagcttttagttatgaactctcaaggctcgaacaagttgttggaagtccagagaagcctttatcagatttaggcaagttaagttacagatcgtactggtcatatgttttattagaagtgttaagtgctagtagaggtacattaagtatcaaggatttaagtcagatgacaggaatatcacaaacggacatcatttcaactttacagtcaatgaacatggtgaagtactggaaaggacagcatgttatttgtgttacacctaaaatagttgctgaacaattagcaagcccgcactttaaaaaaccacggttgtcaatagatccttcagcactgagatggacgccccctagtaaacaggggaactctgccaaagccaaaaagtag
23.序列表seq id no:2是家蚕mof蛋白氨基酸序列，序列包含422个氨基酸残基。
24.序列seq id no:2具体如下所示：
25.makgdkelekpivnnelpnpecrstdnedsesvpeqpldigehylvrrsdeswhpaeiiqsrystaescyeyyvhyvgydrrldewvsrhrvmsdrfdvceqsnnnincdhlltdksgrkitrnqkrkhdeinhvqktyaemdpttaalekeheaitkvkyidriqigkyeidtwyfspypdeygkqsklwlceyclkymrmektyryhlsectarqpqgneiyrkgtiaifeadgkehkiycqnlcllaklfldhktlyfdieqflfyilcevdkqgahlvgyfskekdspegnnvaciltlppyqrqgygklliafsyelsrleqvvgspekplsdlgklsyrsywsyvllevlsasrgtlsikdlsqmtgisqtdiistlqsmnmvkywkgqhvicvtpkivaeqlasphfkkprlsidpsalrwtppskqgnsakakk
26.以下实施例中所使用的引物列表见表1。
27.表1引物信息
[0028][0029][0030]
实施例1：家蚕bmmof基因片段的克隆及真核表达载体的构建
[0031]
根据根据ncbi数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/100101212)下载的家蚕细胞mof基因序列，选择合适的酶切位点后依据piex-1载体序列设计同源臂引物(5
’→3’
)，
[0032]
上游引物bmmof-hind
ⅲ‑
f：见seq id no:3。
[0033]
下游引物bmmof-hind
ⅲ‑
r：见seq id no:4。
[0034]
通过传统方法trizol-氯仿抽提家蚕bmn细胞总rna，经plus逆转录试剂盒(近岸蛋白科技有限公司)逆转录合成cdna，再利用高保真pcr酶kof fx扩增mof基因片段，pcr扩增条件为：95℃5min预变性，95℃，30s变性，58℃，30s退火，68℃，1min延伸，30个循环，68℃终延伸10min，12℃永久保温。扩增产物(图1a)经1％琼脂糖凝胶电泳检测目的片段大小及引物特异性，再利用hindⅲ核酸酶对piex-1载体进行单酶切并清洁回收。利用pcr一步定向克隆试剂盒将两种酶切产物按一定的摩尔比连接起来，转化至tg1感受态细胞后涂板，筛选阳性克隆并酶切验证(图1b)后送至上海生物工程有限公司进行测序，利用snap gene软件查看测序峰图并比对测序结果，测序结果表明成功克隆了家蚕bmmof基因序列(seq id no:1)，由1326bp的脱氧核糖核酸构成，成功构建了重组瞬时表达载体piex-1-bmmof(图1c)。
[0035]
实施例2:家蚕bmmof组织特异性及时空表达分布特征分析
[0036]
在最适温度及湿度条件下饲养家蚕，家蚕品系为滞育型秋丰
×
白玉。抽提各组织及变态发育时期rna样品，逆转录合成cdna。依据bmmof基因序列设计特异性qpcr引物(5
’→3’
)：
[0037]
qbmmof-f：见seq id no:5。
[0038]
qbmmof-r：见seq id no:6。
[0039]
设计bmβ-actin特异性qpcr引物作为对照基因，引物序列(5
’→3’
)为：
[0040]
qbmβ-actin-f：见seq id no:9。
[0041]
qbmβ-actin-r：见seq id no:10。
[0042]
利用qrt-pcr技术检测bmmof mrna表达水平，qpcr扩增体系为20μl:sybr qpcr supermix plus 10μl，上下游引物各0.2-1μm(终浓度)，模板1～2μl，无菌水补至20μl。pcr扩增程序：95℃1min，95℃10s，60℃30s，40个循环。
[0043]
分别取蚕卵、一至五龄第三天幼虫、蛹、成虫样品，并对五龄第三天幼虫解剖取血淋巴、中肠、马氏管、性腺、丝腺、气管、脂肪体、头、皮组织；在灭菌的研钵中加入适量液氮快速研磨至粉状，抽提各样品rna并逆转录合成cdna，以bmmof特异性qpcr引物qbmmof-f/r进行qpcr检测；以bmβ-actin作为内参基因，以其特异性qpcr引物qbmβ-actin-f/r检测结果作为对照。实验进行3次生物学重复，每个样品均设置3次技术重复。利用2
‑△△
ct
法分析基因表达相对变化，利用ibm spss统计软件进行显著性分析。
[0044]
qpcr分析结果证明bmmofmrna在气管和表皮中含量最多，其次是头部，在血淋巴和中肠及脂肪体中也有少量分布，但在马氏管、性腺、丝腺中表达量较低(图2a)，(p《0.01)。此外，不同发育时期bmmofmrna表达特征结果(图2b)证明，2龄第3天(l2d3)时期的幼虫体内bmmof转录水平最高，除5龄时期以外，其余幼虫时期都普遍转录，在蛹及成虫时期也有少量表达，但在卵期基本不表达，各表达水平间差异显著(p《0.01)。
[0045]
实施例3：bmnpv对家蚕bmmof蛋白表达模式影响分析
[0046]
生长状态良好的细胞经传代后铺至12孔板中，27℃细胞培养箱培养过夜。以感染复数(moi)＝10的bmnpv分别感染细胞不同时间，显微镜下观察细胞发病情况，利用家蚕bmmof基因特异性qpcr引物qbmmof-f/r和内参基因bmβ-actin特异性引物qbmβ-actin-f/r进行qrt-pcr检测，检测结果如图3a所示，结果表明bmnpv侵染bmn细胞，bmmof转录水平无显著变化。利用mof特异性抗体及其底物h4k16乙酰化抗体进行westernblotting检测，结果如图3b所示，证明随着病毒侵染时间延长，bmmof表达量呈明显下调趋势，其底物h4k16乙酰化水平也逐渐降低；说明bmnpv侵染能直接影响bmmof蛋白表达及其底物h4k16乙酰化水平。
[0047]
实施例4：过表达家蚕bmmof对杆状病毒增殖的影响
[0048]
根据同源重组原理，构建瞬时真核表达载体piex-1-bmmof，转染piex-1-bmmof至bmn细胞并以piex-1空载作为对照，病毒感染细胞48、72h后提取总rna和蛋白样品，以bmnpv的结构基因gp41为分子标记，检测细胞中病毒基因组的复制水平。依据病毒基因gp41序列设计特异性qpcr引物(5
’→3’
)：
[0049]
qgp41-f：见seq id no:7。
[0050]
qgp41-r：见seq id no:8。
[0051]
qrt-pcr结果如图4a所示，结果表明过表达bmmof抑制病毒基因组复制水平；western blotting检测病毒融膜蛋白gp64表达水平(图4b)，表明bmmof过表达能降低bmnpv融膜蛋白的表达，同时提高底物h4k16乙酰化水平；过表达bmmof并以带有egfp标记的bmnpv感染细胞，利用荧光显微镜观察不同感染时期病毒增殖水平，结果如图4c、d所示，与对照组相比，过表达bmmof对bmnpv增殖有抑制作用(p《0.01)；综合表明过表达bmmof显著抑制病毒增殖，在病毒侵染过程中发挥抗病毒作用。
[0052]
实施例5：敲低bmmof对杆状病毒增殖的影响
[0053]
为探究敲低bmmof对杆状病毒增殖的影响，根据bmmof序列设计由rna碱基组成的sirna靶序列，分别合成正反链后，等摩尔量混合经pcr仪退火后形成双链。设计并合成3对
sirna，序列分别为：
[0054]
sirna-1sense：见seq id no:11。
[0055]
sirna-1antisense：见seq id no:12。
[0056]
sirna-2sense：见seq id no:13。
[0057]
sirna-2antisense：见seq id no:14。
[0058]
sirna-3sense：见seq id no:15。
[0059]
sirna-3antisense：见seq id no:16。
[0060]
通过干扰目的蛋白表达的方式抑制bmn细胞中bmmof表达，转染50nm sirna至bmn细胞，72h后提取蛋白样品，利用western blotting检测家蚕bmmof蛋白表达情况，筛选干扰效率最佳的1对引物用于后续实验，实验结果如图5a所示，证明sirna-3敲低bmmof蛋白表达效果最为明显，同时bmmof蛋白底物h4k16的乙酰化水平也有明显降低，进一步说明sirna-3敲低bmmof表达效率最佳。
[0061]
为探究bmmof与病毒增殖间的关系，转染sirna-3至bmn细胞72h，病毒感染48、72h后收样，提取总rna样品，逆转录合成cdna并利用qrt-pcr检测病毒基因转录水平变化，如图5b所示，结果表明敲低bmmof使bmnpv基因组复制水平升高；同时抽提蛋白样品，western blotting检测病毒gp64蛋白表达量(图5c)，表明敲低bmmof使病毒蛋白表达量明显升高；转染sirna后加入融合egfp的bmnpv病毒，干扰48、72h后荧光倒置显微镜下记录病毒扩增情况，如图5d、e所示，干扰组相比于对照组能检测到更强的荧光信号(p《0.01)；综合上述实验结果，表明敲低bmmof能够促进病毒复制增殖。

技术特征：
1.家蚕bmmof基因在培育抗家蚕核型多角体病毒家蚕品种中的应用，其特征在于，通过过表达bmmof基因使家蚕获得抗家蚕核型多角体病毒的能力；所述bmmof基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述bmmof基因编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，过表达bmmof抑制bmnpv病毒增殖。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，过表达bmmof能够抑制bmnpv病毒gp41基因mrna的转录表达。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，过表达bmmof能够降低bmnpv融膜蛋白gp64的表达。6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，过表达bmmof能够提高bmmof底物h4k16乙酰化水平。7.一种培育抗家蚕核型多角体病毒的家蚕品种的方法，其特征在于，通过在家蚕体内过表达bmmof基因使家蚕获得抗家蚕核型多角体病毒的能力；所述家蚕bmmof基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。8.家蚕bmmof基因在制备抑制家蚕核型多角体病毒增殖的药物中的应用，其特征在于，所述家蚕bmmof基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。9.一种家蚕核型多角体病毒抑制剂，其特征在于，包括抑制家蚕bmmof基因表达的药物；所述家蚕bmmof基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。

技术总结
本发明公开了家蚕乙酰转移酶BmMOF基因的应用。本发明克隆了一个影响家蚕抗性的基因BmMOF的全长CDS序列。通过BmMOF基因的瞬时表达载体在家蚕BmN细胞中过表达和siRNA干扰表达的方式，探究病毒侵染条件下BmMOF对病毒mRNA转录水平、膜融合蛋白表达水平及扩增水平的影响，检测结果证实，BmN细胞中过表达BmMOF显著抑制病毒增殖，敲低BmMOF表达促进BmNPV基因转录及蛋白表达。本发明为家蚕抗病毒育种、提高抗病毒感染能力等方面提供新思路。提高抗病毒感染能力等方面提供新思路。提高抗病毒感染能力等方面提供新思路。


技术研发人员：苗蒙 徐焜灵 白世梅 黄雨薏
受保护的技术使用者：浙江理工大学
技术研发日：2023.03.23
技术公布日：2023/7/25