双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂及其制备方法与应用

1.本发明涉及生物医学材料技术领域，尤其涉及一种双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂及其制备方法与应用。


背景技术：

2.大多数肿瘤细胞运输和代谢营养物质的速度比正常细胞要快得多，且主要通过厌氧糖酵解而不是呼吸代谢供能，以满足其生长、侵袭和迁移的能量需求。因此，癌细胞的增值与生长高度依赖于葡萄糖。
3.鉴于葡萄糖在为肿瘤生长和代谢提供能量方面的关键作用，葡萄糖氧化酶(gox)催化可以有效地消耗肿瘤细胞内的葡萄糖以及氧气进行饥饿治疗，并导致肿瘤微环境中的酸度、乏氧水平和过氧化氢含量升高。基于此，gox诱导的肿瘤内葡萄糖消耗可以有效阻断肿瘤细胞的能量供应，这为治疗癌症提供了一种替代的无创性饥饿策略。
4.但是，肿瘤微环境的复杂性、多样性和异质性使得只通过葡萄糖氧化酶进行饥饿治疗很难获得有效的治疗效果。肿瘤的乏氧微环境也限制了葡萄糖氧化酶的耗氧催化过程。研究表明肿瘤的能量代谢不单单源自无氧糖酵解，氧化磷酸化也是很多肿瘤的能量来源之一。所以只单纯地消耗葡萄糖不能完全抑制肿瘤的增值，要从多方面对肿瘤能力代谢进行抑制才能更有效地治疗肿瘤。并且，葡萄糖氧化酶的饥饿治疗的局限性不仅仅受肿瘤微环境的影响，作为一种天然酶，其自身的生物利用度，以及在体内的生物安全性也需要在研究中进一步的验证。
5.因此，现有技术还有待于改进和发展。


技术实现要素：

6.鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂及其制备方法与应用，旨在解决现有的功能性蛋白质肿瘤蓄积性有限与效果差的问题。
7.本发明的技术方案如下：
8.一种双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂，包括功能性蛋白质、结合在所述功能性蛋白质的疏水腔中的氧化磷酸化抑制剂，以及将所述功能性蛋白质和所述氧化磷酸化抑制剂包裹在内的细菌外膜囊泡。
9.所述的双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂，其中，所述氧化磷酸化抑制剂与所述功能性蛋白质的质量比为1:5～1:40；所述细菌外膜囊泡与所述功能性蛋白质的质量比为(1～2):(1～2)。
10.所述的双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂，其中，所述双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂的粒径为179.87～207.43nm。
11.所述的双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂，其中，所述功能性蛋白质为葡萄糖氧化酶。
12.所述的双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂，其中，所述氧化磷酸化抑制剂选自寡酶素a、二甲双胍、苯乙双胍、iacs-010759、抗霉素a、bay87-2243、非诺贝特、α-tos、阿托伐醌、鱼藤酮、哌啶素a、粘噻唑中的一种或多种。
13.一种双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂的制备方法，包括步骤：
14.提供功能性蛋白质、氧化磷酸化抑制剂；
15.将所述功能性蛋白质和所述氧化磷酸化抑制剂进行混合，得到混合物；
16.向所述混合物中加入细菌外膜囊泡，进行混合、挤压处理，得到双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂。
17.所述的双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂，其中，将所述功能性蛋白质和所述氧化磷酸化抑制剂进行混合的步骤包括：
18.将所述氧化磷酸化抑制剂与乙醇进行混合，得到第一溶液；
19.将所述功能性蛋白质与含β-巯基乙醇的缓冲溶液进行混合，得到第二溶液；
20.将所述第一溶液与所述第二溶液进行混合并搅拌。
21.所述的双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂，其中，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或三羟甲基氨基甲烷缓冲液。
22.所述的双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂，其中，向所述混合物中加入细菌外膜囊泡，进行混合、挤压处理的步骤包括：
23.向所述混合物中加入细菌外膜囊泡并进行混合后，通过0.19～0.23μm的滤膜进行挤压18～22次。
24.一种双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂在制备治疗肿瘤制剂中的应用。
25.有益效果：本发明提供一种双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂及其制备方法与应用，所述双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂包括功能性蛋白质、结合在所述功能性蛋白质的疏水腔中的氧化磷酸化抑制剂，以及将所述功能性蛋白质和所述氧化磷酸化抑制剂包裹在内的细菌外膜囊泡。该纳米治疗剂在运输过程中，由于疏水性的氧化磷酸化抑制剂与功能性蛋白质通过疏水作用结合，提高了生物安全性；同时细菌外膜囊泡包裹功能性蛋白质和氧化磷酸化抑制剂，提高了纳米治疗剂的肿瘤蓄积。当所述双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂蓄积至肿瘤部位后，在酸性肿瘤微环境中，双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂解离，功能性蛋白质活性恢复，氧化磷酸化抑制剂释放，实现双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂的选择性控制。该纳米治疗剂显著提高了功能性蛋白质的载药量和生物利用度，可选择性控制其功能性蛋白质活性，通过细菌外膜囊泡包裹加大了药物在肿瘤部位的蓄积量，从而提高疗效和降低毒副作用。
附图说明
26.图1为本发明实施例1中双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂的合成路线图；
27.图2为本发明实施例1中制备得到的oago的透射电镜图(tem)；
28.图3为本发明实施例2中gox与oag产生的双氧水浓度对比图；
29.图4为本发明实施例3中oa、oag和oago对三阴性乳腺癌(4t1)肿瘤细胞的杀伤效果图；
30.图5为本发明实施例4中oago对4t1肿瘤细胞的代谢途径的抑制作用图；
31.图6为本发明实施例5中不同处理组在小鼠肿瘤蓄积荧光成像图；
32.图7为本发明实施例6中不同处理组对肿瘤血氧饱和度的影响图；
33.图8为本发明实施例7中饥饿/代谢/光热协同治疗对4t1肿瘤生长的抑制效果图；
34.图9为本发明实施例8中静脉注射生理盐水和oago后第15天健康小鼠的血液生化参数图。
具体实施方式
35.本发明提供一种双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
36.本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)，具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语，应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样被特定定义，否则不会用理想化或过于正式的含义来解释。
37.肿瘤增殖过程中依赖厌氧糖酵解途径产生能量，肿瘤微环境的复杂性、多样性和异质性，使得只通过葡萄糖氧化酶进行饥饿治疗很难获得有效的治疗效果。肿瘤的乏氧微环境也限制了葡萄糖氧化酶的耗氧催化过程。研究表明肿瘤的能量代谢不单单源自无氧糖酵解，氧化磷酸化也是很多肿瘤的能量来源之一。所以只单纯地消耗葡萄糖不能完全抑制肿瘤的增殖，要从多方面对肿瘤能量代谢进行抑制才能更有效地治疗肿瘤。
38.基于此，本发明提供一种双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂，包括功能性蛋白质、结合在所述功能性蛋白质的疏水腔中的氧化磷酸化抑制剂，以及将所述功能性蛋白质和所述氧化磷酸化抑制剂包裹在内的细菌外膜囊泡。
39.本实施方式中，将所述氧化磷酸化抑制剂结合在所述功能性蛋白质的疏水腔中形成第一纳米颗粒，然后再利用细菌外膜囊泡将第一纳米颗粒进行包裹得到双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂(oago)，使得所述双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂在运输过程中，由于疏水性的氧化磷酸化抑制剂与功能性蛋白质是通过疏水作用结合，使得抑制剂结合在所述功能蛋白质疏水腔中，功能性蛋白质活性内抑制，提高了生物安全性。同时利用细菌外膜囊泡将所述功能性蛋白质和所述氧化磷酸化抑制剂进行包裹，提高了oago的肿瘤蓄积。
40.具体地，当所述双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂蓄积至肿瘤部位后，功能性蛋白质活性恢复，氧化磷酸化抑制剂释放，实现双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂的选择性控制。此外，氧化磷酸化抑制剂可以有效抑制线粒体呼吸，从而减少肿瘤耗氧；另一方面，细菌外膜囊泡诱导的血管破裂增加肿瘤血氧饱和度，进一步增强功能性蛋白质的氧化催化性能。
41.本发明提高的双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂显著提高了功能性蛋白质的载药量和生物利用度，可选择性控制其功能蛋白质活性，细菌外膜囊泡包裹从而加大了药物在肿瘤部位的蓄积量，提高疗效，降低毒副作用。所述双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂真正实现了高载药量、高肿瘤蓄积以及保护肿瘤微环境的蛋白质活性，在肿瘤治疗领域将具有良好的应用前景。
42.在一些实施方式中，所述氧化磷酸化抑制剂与所述功能性蛋白质的质量比为1:5～1:40；该比例范围，可以使得所述双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂具有合适的粒径及最大的包封率，使得氧化磷酸化抑制剂的包封率达到66.59％，所述功能性蛋白质的包封率高达19.03％。同时该比例范围可以更好地实现双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂的选择性控制，使其在运输过程中功能性蛋白质活性被抑制，蓄积至肿瘤部位后，功能性蛋白质被释放，功能性蛋白质的活性被恢复。
43.在一些实施方式中，所述细菌外膜囊泡与所述功能性蛋白质的质量比为(1～2):(1～2)。
44.在一种优选地实施方式中，所述细菌外膜囊泡与所述功能性蛋白质的质量比为1:1；在该比例下，可以使得所述细菌外膜囊泡很好地包裹第一纳米颗粒，更好地实现双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂在体内运输时的生物安全性，增加纳米制剂的稳定性，有效蓄积到肿瘤深处。
45.在一些实施方式中，所述双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂为第二纳米颗粒，所述双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂的粒径为179.87～207.43nm。即所述第二纳米颗粒的粒径在179.87～207.43nm之间时，能够使所述双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂更好地实现肿瘤的蓄积以及肿瘤的代谢治疗。
46.进一步地，所述双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂为球形纳米颗粒。
47.在一些实施方式中，所述功能性蛋白质为葡萄糖氧化酶(gox)。
48.具体地，蛋白质不仅具有载体的作用，其还可实现对肿瘤的治疗。gox具有葡萄糖特异性催化性质，可通过氧化葡萄糖产生葡萄糖酸和双氧水，从而消耗肿瘤的营养物质，达到饿死肿瘤的目的，因而可用于癌症的饥饿治疗。当所述双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂由细菌外膜囊泡包裹gox疏水结合氧化磷酸化抑制剂而成时，所述双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂可用于癌症饥饿、代谢和光热的协同治疗。其中，gox活性被抑制，细菌外膜囊泡包裹的双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂蓄积至肿瘤部位后，酸性肿瘤微环境中使细菌外膜囊泡包裹的gox纳米粒解散，恢复gox的活性；而gox则通过氧化肿瘤部位葡萄糖消耗肿瘤环境中的营养物质，达到饿死肿瘤的效果，可以实现癌症的饥饿治疗。
49.在一些实施方式中，所述氧化磷酸化抑制剂选自但不限于寡酶素a(oa)、二甲双胍、苯乙双胍、iacs-010759、抗霉素a、bay87-2243、非诺贝特、α-tos、阿托伐醌、鱼藤酮、哌啶素a、粘噻唑中的一种或多种。
50.在一种优选地实施方式中，所述氧化磷酸化抑制剂选自寡酶素a；寡酶素a对线粒体的影响是一个复杂且多阶段的过程，寡酶素a是一种经典的氧化磷酸化抑制剂，与三磷酸腺苷合成酶(atpase)c-loop中glu59残基羧基侧链相互作用，可有效诱导癌细胞凋亡。此外，在肿瘤饥饿的情况下，寡酶素a的抗癌效果可以有效增强；考虑到肿瘤生长代谢的高能量需求和gox催化过程的氧气消耗，构建双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂有望从多角度克服肿瘤缺氧，抑制能量供应，从而增强抗肿瘤疗效。
51.本发明中，提供一种双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂，由氧化磷酸化抑制剂、功能性蛋白质和细菌外膜囊泡包裹而成。功能性蛋白质的二硫键被还原剂打开后，会暴露出更多的疏水结构域，随后疏水的氧化磷酸化抑制剂可以嵌入并且自组装形成双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂。当双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂蓄积至肿瘤部位后，在酸性肿
瘤微环境中，双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂解离，功能性蛋白质活性恢复，氧化磷酸化抑制剂释放，实现双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂的选择性控制。此外，氧化磷酸化抑制剂有效抑制线粒体呼吸，从而减少肿瘤耗氧。另一方面，细菌外膜囊泡诱导的血管破裂增加肿瘤血氧饱和度，进一步增强功能性蛋白质的氧化催化性能。
52.除此之外，本发明还提供一种双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂的制备方法，包括步骤：
53.步骤s10：提供功能性蛋白质、氧化磷酸化抑制剂；
54.步骤s20：将所述功能性蛋白质和所述氧化磷酸化抑制剂进行混合，得到混合物；
55.步骤s30：向所述混合物中加入细菌外膜囊泡，进行混合、挤压处理，得到双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂。
56.本实施方式中，所述制备方法工艺简单、操作方便，不需要复杂昂贵的设备，易于实现工业化生产。并且，采用该制备方法制得的双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂显著提高了功能性蛋白质的载药量和生物利用度，可选择性控制其功能性蛋白质活性，从而提高了药物在肿瘤部位的蓄积量，增强了疗效，降低毒副作用。并且，所述双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂真正实现了高载药量、高肿瘤蓄积以及肿瘤微环境激活的蛋白质活性，在肿瘤治疗领域将具有良好的应用前景。
57.在一些实施方式中，所述步骤s20中，将所述功能性蛋白质和所述氧化磷酸化抑制剂进行混合的步骤包括：
58.步骤s21：将所述氧化磷酸化抑制剂与乙醇进行混合，得到第一溶液；
59.步骤s22：将所述功能性蛋白质与含β-巯基乙醇的缓冲溶液进行混合，得到第二溶液；
60.步骤s23：将所述第一溶液与所述第二溶液进行混合并搅拌。
61.在另一种实施方式中，将所述功能性蛋白质和所述氧化磷酸化抑制剂进行混合的步骤还可以为：将β-巯基乙醇、功能性蛋白质加入缓冲溶液中进行混合，然后边搅拌边加入所述用乙醇溶解的氧化磷酸化抑制剂，得到第一纳米颗粒；其中的β-巯基乙醇用于断开功能性蛋白质的二硫键，打开功能性蛋白质的结构，便于蛋白质与氧化磷酸化抑制剂疏水结合，使得氧化磷酸化抑制剂结合在功能性蛋白质的疏水腔中。
62.在一些实施方式中，在所述步骤s20之后，所述步骤s30之前，还包括：对所述混合物进行超滤离心处理，去除混合物中游离的氧化磷酸化抑制剂和β-巯基乙醇，达到纯化产物的目的。
63.在一些实施方式中，所述缓冲溶液选自磷酸盐(pbs)缓冲液或三羟甲基氨基甲烷(tris)缓冲液。
64.在一种优选地实施方式中，所述pbs缓冲液或tris缓冲液的溶剂为超纯水，超水水几乎没有杂质，更有利于形成纯净的仿生纳米乳。
65.在一些实施方式中，所述步骤s30中，向所述混合物中加入细菌外膜囊泡，进行混合、挤压处理的步骤包括：向所述混合物中加入细菌外膜囊泡并进行混合后，通过0.19～0.23μm的滤膜进行挤压18～22次。
66.在一种优选地实施方式中，所述挤压处理的滤膜孔径为0.22μm，挤压次数为20次。
67.除此之外，本发明还提供一种双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂在制备治疗肿瘤
制剂中的应用。和/或，利用所述双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂的制备方法制备得到的双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂在制备治疗肿瘤制剂中的应用。
68.具体地，上述治疗可为饥饿治疗、代谢治疗和光热治疗的同时治疗。本实施方式所述双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂可实现高载药量、高肿瘤蓄积以及肿瘤微环境响应性的蛋白质活性，氧化磷酸化抑制剂可以有效抑制线粒体呼吸，从而减少肿瘤耗氧。另一方面，细菌外膜囊泡诱导的血管破裂增加肿瘤血氧饱和度，进一步增强功能性蛋白质的氧化催化性能，从而达到饥饿治疗、代谢治疗和光热治疗效果，在肿瘤治疗领域将具有良好的应用前景。
69.下面进一步举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
70.实施例1
71.本实施例制备一种双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂，其合成路线图图1所示，具体如下：
72.步骤s1：将10mg gox溶解于5ml tris缓冲溶液中，搅拌10min后加入β-巯基乙醇，得到gox溶液。
73.步骤s2：将300μl oa(5mg/ml，乙醇溶解)缓慢加入到gox溶液中，得到双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂初产物，记作oag。
74.步骤s3：通过超滤离心去除游离的gox和β-巯基乙醇，纯化最终产物(分子量截止值＝为30kda)。最后，将oag与细菌外膜囊泡(omv)混合，通过0.22μm的滤膜进行挤压混合物20次，得到双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂，记作oago。
75.本实施例制得的双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂在未运输至肿瘤部位时，处于催化活性“关”的状态；当其处于酸性肿瘤微环境中时，其处于催化活性“开”的状态，此时细菌外膜囊泡包裹的gox纳米粒解散，恢复gox的活性，通过氧化葡萄糖产生葡萄糖酸和双氧水，从而消耗肿瘤的营养物质，达到饿死肿瘤的目的；而oa则是三磷酸腺苷酶的抑制剂，可有效抑制氧化磷酸化，减少线粒体供能，从而导致肿瘤饥饿程度加重。
76.利用透射电镜对本实施例制得的双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂进行观察，其结果如图2所示。
77.实施例2
78.gox、oag和酸处理的oag对4t1肿瘤细胞的gox催化活性评估：
79.将gox、oag和酸处理的oag([gox]＝200ng/ml)与不同浓度的葡萄糖(0、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、5、10mm)孵育2h。然后，收集混合物并通过双氧水测定试剂盒检测。其结果如图3所示，在葡萄糖溶液中oag的催化能力被显著抑制，而酸预处理后oag的催化能力增强。以上结果说明，oag具有酸激活酶催化特性，保证了其对癌症治疗的有效催化和生物安全性。
[0080]
实施例3
[0081]
不同药物处理对4t1肿瘤细胞的毒性评估：
[0082]
采用标准的mtt法，评估不同组药物对4t1细胞存活率的影响。在37℃、5％co2培养条件下，将4t1细胞以每孔5
×
103密度接种到96孔板中。24h后吸出96孔板中的旧培养基，分
别加入含有0、250、500、1000、2500ng/ml的实施例1中的oa的杜尔贝科改良伊格尔培养基(dmem)。继续孵育细胞24h后，吸出96孔板中的旧培养基，在每个孔中加入100μl含5mg/ml3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(mtt)的培养基溶液，继续培养4h。最后，每孔加入150μl二甲基亚砜(dmso)替换掉培养基，并检测每孔的吸光度(od值，检测波长为490nm)，记作oa组。
[0083]
在37℃、5％co2培养条件下，将4t1细胞以每孔5
×
103密度接种到96孔板中。24h后吸出96孔板中的旧培养基，分别加入含有不同浓度的oag([oa]＝0、250、500、1000、2500ng/ml)的dmem培养基。继续孵育细胞24h后，吸出96孔板中的旧培养基，在每个孔中加入100μl含5mg/ml mtt的培养基溶液，继续培养4h。最后，每孔加入150μl dmso替换掉培养基，并检测每孔的od值(检测波长为490nm)，记作oag组。
[0084]
在37℃、5％co2培养条件下，将4t1细胞以每孔5
×
103密度接种到96孔板中。24h后吸出96孔板中的旧培养基，分别加入含有不同浓度的oago([oa]＝0、250、500、1000、2500ng/ml)的dmem培养基。继续孵育细胞24h后，吸出96孔板中的旧培养基，在每个孔中加入100μl含5mg/ml mtt的培养基溶液，继续培养4h。最后，每孔加入150μl dmso替换掉培养基，并检测每孔的od值(检测波长为490nm)，记作oago组。
[0085]
用如下公式计算细胞存活率：
[0086]
细胞存活率(％)＝(样品的od490值/空白od490值)
×
100％，结果如图4所示，在oa为1000ng/ml时，由于gox的存在，oago具有更高的细胞杀伤率，说明oa介导的肿瘤细胞代谢治疗增强gox介导的饥饿治疗。
[0087]
实施例4
[0088]
不同药物处理对4t1肿瘤细胞糖酵解压力和线粒体压力比较：
[0089]
将4t1细胞以每孔5
×
103密度接种到seahorse细胞培养板中12h后，然后用含有不同处理的dmem培养基(其中1、2、3、4、5分别表示对照组、gox组、oa组、oag组、oago组)，继续孵育细胞24h。使用seahorsexfe24细胞外通量分析仪测量不同处理后细胞的细胞外酸化速率(ecar)和氧气消耗速率(ocr)。测量程序严格按照设备供应商的协议执行。
[0090]
其结果如图5所示，其中(a)为不同处理组对4t1细胞的糖酵解途径抑制效果图；(b)为(a)图的定量图；(c)为不同处理组对4t1细胞氧化磷酸化途径抑制效果图；(d)为(c)图的定量图。
[0091]
如图5中的(a)、(c)所示，给药后，gox和oa(即oago或oag组)联合使用确实有效地加剧了糖酵解抑制程度。此外，oago和oag组90分钟的实时ecar(分别为37.66和37.42mph/min)远低于对照组、gox和oa组(分别为92.46、64.85和112.46mph/min)。
[0092]
如图5中的(b)、(d)所示，用寡霉素、三氟甲氧羰基氰基苯腙(fccp)、抗霉素a和鱼藤酮测定atp产量、基础呼吸和最大呼吸。与对照组和gox组相比，其他组均显著抑制了基础呼吸和atp的产生，验证了oa可诱导线粒体功能障碍。如图5中的(b)所示，oag组和oago组的细胞ocr因oa而下降。相反，对照组和gox组的细胞ocr几乎保持不变。
[0093]
这些结果证实了oago可以严重阻断糖酵解，抑制线粒体呼吸，最大限度地阻断癌细胞的能量供应。
[0094]
实施例5
[0095]
oago在小鼠4t1皮下瘤蓄积的效果评估：
[0096]
选用雌性balb/c小鼠(4-5周，15-20g)，在小鼠右后腿皮下注射1
×
1064t1肿瘤细胞，建立小鼠皮下瘤模型。当皮下肿瘤体积超过100mm3时，分别对注射实施例1中的gox、oag和oago的小鼠进行活体荧光成像实验。通过小动物荧光成效系统观测其肿瘤蓄积的变化情况，结果如图6所示。
[0097]
由图6可知，尾静脉给药1h后，gox、oag和oago在肿瘤中的蓄积达到最大，在此之后开始逐渐代谢。而oago的活体蓄积量在尾静脉给药1h后达到最大，且代谢相对缓慢，说明oago可蓄积到肿瘤部位，且蓄积效率高于gox和oag。因此，说明oago具有良好较高的肿瘤蓄积。
[0098]
实施例6
[0099]
oago改善小鼠4t1皮下瘤乏氧能力的效果评估：
[0100]
选用雌性balb/c小鼠(4-5周，15-20g)，在小鼠右后腿皮下注射1
×
1064t1肿瘤细胞，建立小鼠皮下瘤模型。当皮下肿瘤体积超过100mm3时，分别对注射实施例1中的gox、oa、oag和oago的小鼠进行光声成像实验。
[0101]
其不同处理组对肿瘤血氧饱和度的影响图如图7所示。其中，通过光声成像系统观测其肿瘤血氧的变化情况，结果如图7中的(a)所示。
[0102]
在尾静脉给药不同时间点(0、1、2、4、6、12、24h)后，进行光声成像(pai)。如图7中(b)所示，gox消耗氧气导致瘤内血氧饱和度平均值减少(从45.56％下降到29.29％)，但由于oa抑制氧气消耗能力，oag组血氧饱和度平均值明显增加(从38.47％上升到46.87％)。而由于外层包裹了细菌外模囊泡，oago组血氧饱和度呈现最显著的增加(从40.99％上升到60.18％)，证实oago具有优异的缓解肿瘤乏氧的功能。
[0103]
实施例7
[0104]
饥饿/代谢/光热协同治疗对4t1肿瘤生长的抑制效评估：
[0105]
选用雌性balb/c小白鼠(4-5周，15-20g)，在小白鼠右后腿皮下注射1
×
10
6 4t1肿瘤细胞，建立小鼠皮下瘤模型。当肿瘤体积达60mm3时，进行治疗实验。在肿瘤模型中，荷瘤小鼠均随机分为七组：(1)对照组；(2)对照照光组；(3)注射gox组；(4)注射oa组；(5)注射oag组；(6)注射oago组；(7)注射oago照光组。每隔一天用游标卡尺测量肿瘤体积，同时监测小鼠的体重，并按照公式v＝ab2/2计算得到肿瘤体积，其中a是肿瘤的长径(mm)，b是肿瘤的短径(mm)。每次测量结果均通过处理前的起始肿瘤体积归一化，实验结果见图8。
[0106]
图8中的(a)为肿瘤模型中不同治疗组balb/c小鼠的肿瘤体积随天数的变化情况图，图8中的(b)为治疗14天之后不同治疗组解剖后的肿瘤进行称重后的重量(其横坐标的1、2、3、4、5、6、7分别表示对照组、对照照光组、gox组、oa组、oag组、oago组、oago照光组)。由图8中的(a)可知，注射oago照光组能够显著抑制皮下4t1乳腺癌肿瘤的生长，相较于其他治疗组具有最佳的肿瘤抑制效果。由图8中的(b)可知，注射oago并进行照光处理14天后，离体解剖的肿瘤重量最轻，进一步表明oago照光处理几乎完全抑制肿瘤的生长。
[0107]
实施例8
[0108]
oago对小鼠的生物安全性评价：
[0109]
将实施例7中的雌性balb/c小鼠中的注射了生理盐水组和oago组治疗后14天，取代表性小鼠眶窦血样，通过血液分析仪分析。静脉注射生理盐水和oago后第15天健康小鼠的血液生化参数图如图9所示；其中，图9中的(a)为不同组balb/c小鼠血液中谷丙转氨酶对
比图，(b)为不同组balb/c小鼠血液中天冬氨酸转氨酶对比图，(c)为不同组balb/c小鼠血液中肌酐对比图，(d)为不同组balb/c小鼠血液中尿素氮对比图；由图9中的(a)、(b)、(c)、(d)可知，丙氨酸转氨酶(alt)、天冬氨酸转氨酶(ast)、肌酐(crea)、尿素氮(urea)数值水平基本相同，说明oago未损害肝肾生理功能，证明其具有良好的生物安全性。
[0110]
综上所述，本发明提供的一种双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂及其制备方法与应用，所述双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂包括功能性蛋白质、结合在所述功能性蛋白质的疏水腔中的氧化磷酸化抑制剂，以及将所述功能性蛋白质和所述氧化磷酸化抑制剂包裹在内的细菌外膜囊泡。该纳米治疗剂在运输过程中，由于疏水性的氧化磷酸化抑制剂与功能性蛋白质通过疏水作用结合，提高了生物安全性；同时细菌外膜囊泡包裹功能性蛋白质和氧化磷酸化抑制剂，提高了纳米治疗剂的肿瘤蓄积。当所述双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂运输至肿瘤部位后，在酸性肿瘤微环境中，双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂解离，功能性蛋白质活性恢复，氧化磷酸化抑制剂释放，实现双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂的选择性控制。该纳米治疗剂显著提高了功能性蛋白质的载药量和生物利用度，可选择性控制其功能性蛋白质活性，通过细菌外膜囊泡包裹从而加大了药物在肿瘤部位的蓄积量，提高疗效和降低毒副作用。
[0111]
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

技术特征：
1.一种双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂，其特征在于，包括功能性蛋白质、结合在所述功能性蛋白质的疏水腔中的氧化磷酸化抑制剂，以及将所述功能性蛋白质和所述氧化磷酸化抑制剂包裹在内的细菌外膜囊泡。2.根据权利要求1所述的双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂，其特征在于，所述氧化磷酸化抑制剂与所述功能性蛋白质的质量比为1:5～1:40；所述细菌外膜囊泡与所述功能性蛋白质的质量比为(1～2):(1～2)。3.根据权利要求1所述的双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂，其特征在于，所述双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂的粒径为179.87～207.43nm。4.根据权利要求1所述的双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂，其特征在于，所述功能性蛋白质为葡萄糖氧化酶。5.根据权利要求1所述的双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂，其特征在于，所述氧化磷酸化抑制剂选自寡酶素a、二甲双胍、苯乙双胍、iacs-010759、抗霉素a、bay87-2243、非诺贝特、α-tos、阿托伐醌、鱼藤酮、哌啶素a、粘噻唑中的一种或多种。6.一种如权利要求1-5任一项所述的双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂的制备方法，其特征在于，包括步骤：提供功能性蛋白质、氧化磷酸化抑制剂；将所述功能性蛋白质和所述氧化磷酸化抑制剂进行混合，得到混合物；向所述混合物中加入细菌外膜囊泡，进行混合、挤压处理，得到双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂。7.根据权利要求6所述的双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂，其特征在于，将所述功能性蛋白质和所述氧化磷酸化抑制剂进行混合的步骤包括：将所述氧化磷酸化抑制剂与乙醇进行混合，得到第一溶液；将所述功能性蛋白质与含β-巯基乙醇的缓冲溶液进行混合，得到第二溶液；将所述第一溶液与所述第二溶液进行混合并搅拌。8.根据权利要求7所述的双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂，其特征在于，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或三羟甲基氨基甲烷缓冲液。9.根据权利要求6所述的双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂，其特征在于，向所述混合物中加入细菌外膜囊泡，进行混合、挤压处理的步骤包括：向所述混合物中加入细菌外膜囊泡并进行混合后，通过0.19～0.23μm的滤膜进行挤压18～22次。10.一种如权利要求1-5任一项所述的双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂在制备治疗肿瘤制剂中的应用。

技术总结
本发明涉及生物医学纳米材料技术领域，尤其涉及一种双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂及其制备方法与应用，所述双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂包括功能性蛋白质、结合在功能性蛋白质的疏水腔中的氧化磷酸化抑制剂，以及将功能性蛋白质和氧化磷酸化抑制剂包裹在内的细菌外膜囊泡。该纳米治疗剂在运输过程中，由于疏水性的氧化磷酸化抑制剂与功能性蛋白质通过疏水作用结合，提高了生物安全性；同时细菌外膜囊泡包裹功能性蛋白质和氧化磷酸化抑制剂，提高了纳米治疗剂的肿瘤蓄积性。当纳米治疗剂在酸性肿瘤微环境中，纳米治疗剂解离，功能性蛋白质活性恢复，氧化磷酸化抑制剂释放，实现双途径能量抑制型酶基纳米治疗剂的选择性控制。择性控制。择性控制。


技术研发人员：黄鹏 江珊珊 李婉钰 林静
受保护的技术使用者：深圳大学
技术研发日：2023.03.14
技术公布日：2023/7/25