一种高可溶性蛋白含量的发酵饲料及其制备方法和应用

1.本发明属于生物发酵技术领域，尤其涉及一种高可溶性蛋白含量的发酵饲料及其制备方法和应用。


背景技术：

2.玉米是我国的主要粮食作物之一，2021年全国玉米产量5451亿斤，比上年增加238亿斤，其中用于饲料及工业消费的比例高达90％。玉米蛋白粉(cornglutenmeal，cgm)，是玉米淀粉生产中的主要副产物，每年国内产量达数万吨，其蛋白含量高，占干物质65％左右，并且氨基酸含量高于豆粕和鱼粉，主要作为动物饲料的蛋白补充剂。玉米胚芽粕是以玉米胚芽为原料，经压榨或浸提取油后的副产品，又称玉米脐子粕，含粗蛋白质18％-20％，粗脂肪1％-2％，粗纤维11％-12％，其氨基酸组成与玉米蛋白饲料(或称玉米麸质饲料)相似，常常被用于饲料。
3.玉米蛋白粉、玉米胚芽粕中的蛋白质有两种状态，即可溶性蛋白质和不可溶性蛋白质，不溶性蛋白质容易和其他的大分子有机物或微量元素结合，而不易被身体吸收，几乎均被排出体外，大大降低了蛋白质的利用效果。所以，提高玉米蛋白粉和玉米胚芽粕中可溶性蛋白的含量对发展畜牧业有重要意义。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高可溶性蛋白含量的发酵饲料及其制备方法和应用，能显著提高发酵饲料中可溶性蛋白和乳酸的含量。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
6.本发明提供了一种用于制备高可溶性蛋白含量发酵饲料的复合菌剂，所述复合菌剂由枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)yy-10的菌剂、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)yy-14的菌剂和植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)yy-8的菌剂制备而成；所述枯草芽孢杆菌yy-10保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.24694；所述酿酒酵母yy-14保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.24698；所述植物乳杆菌yy-8保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.24692。
7.优选的，所述枯草芽孢杆菌yy-10菌剂的制备方法包括：枯草芽孢杆菌按0.5-1.5％接种量接种于lb培养基中，于35-40℃、转速150-200r/min条件下，发酵14-18h；所述酿酒酵母yy-14菌剂的制备方法包括：酿酒酵母yy-14按0.5-1.5％接种量接种于ypd培养基中，于32-38℃、转速150-200r/min条件下，发酵14-18h；所述植物乳杆菌yy-8菌剂的制备方法包括：植物乳杆菌yy-8按0.5-1.5％接种量接种于mrs培养基中，于35-40℃发酵18-20h。
8.更优选的，所述枯草芽孢杆菌yy-10菌剂的菌体数量为(3.0-5.0)
×
108cfu/ml，所述酿酒酵母yy-14菌剂的菌体数量为(1.0-3.0)
×
107cfu/ml，所述植物乳杆菌yy-8菌剂的菌体数量为(2.0-4.0)
×
107cfu/ml；所述枯草芽孢杆菌yy-10菌剂、酿酒酵母yy-14菌剂和
植物乳杆菌yy-8菌剂的体积比为(1-3):(1-3):(1-3)。
9.本发明还提供了一种高可溶性蛋白含量的发酵饲料，包括膨化玉米蛋白粉、玉米胚芽粕、糖蜜、酸性蛋白酶和上述复合菌剂；所述玉米蛋白粉、玉米胚芽粕和糖蜜的质量比为(2.5-6.5):(2.5-6.5):1；所述复合菌剂的接种量为所述玉米蛋白粉、玉米胚芽粕和糖蜜总质量的1％-10％；所述酸性蛋白酶的添加量为所述玉米蛋白粉、玉米胚芽粕和糖蜜总质量的0.05％-0.15％。
10.本发明还提供了上述发酵饲料的制备方法，包括：将膨化玉米蛋白粉、玉米胚芽粕、糖蜜、酸性蛋白酶和复合菌剂混合后，于27-35℃条件下固态发酵108-132h。
11.优选的，所述膨化玉米蛋白粉的制备方法包括：将玉米蛋白粉于150-160℃下挤压膨化5-10s。
12.优选的，在所述挤压膨化后还包括粉碎；所述粉碎的粒径为30-50目。
13.优选的，所述发酵的料水比为1:0.8-1.5g/ml。
14.本发明还提供了上述发酵饲料在替代反刍动物豆粕饲料方面的应用。
15.优选的，所述发酵饲料的添加量为15％-30％。
16.相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
17.本发明提供了一种高可溶性蛋白含量的发酵饲料的制备方法，包括：将玉米蛋白粉挤压膨化，与玉米胚芽粕、糖蜜、酸性蛋白酶和复合菌剂混合固态发酵。本发明采用枯草芽孢杆菌yy-10、植物乳杆菌yy-8、酿酒酵母菌yy-14协同固态发酵的制备方法，通过添加糖蜜提高可溶性蛋白质和乳酸含量，有利于肠道菌群平衡，提高了饲料营养吸收利用率。
18.实验结果表明，采用本发明制备方法得到的饲料，可溶性蛋白质含量最高可达20.29％，乳酸含量最高可达到137.1nmol/l；并且本发明的饲料替换豆粕可促进消化吸收，降低饲养成本。
19.生物保藏信息：
20.本发明所述枯草芽孢杆菌yy-10，拉丁文为bacillus subtilis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.24694，保藏日期为2022年04月18日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
21.本发明所述酿酒酵母yy-14，拉丁文为saccharomyces cerevisiae，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.24698，保藏日期为2022年04月18日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
22.本发明所述植物乳杆菌yy-8，拉丁文为lactobacillusplantarum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.24692，保藏日期为2022年04月18日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
23.图1为发酵时间对发酵物可溶性蛋白含量和乳酸含量的影响；
24.图2为发酵温度对发酵物可溶性蛋白含量和乳酸含量的影响；
25.图3为物料比对发酵物可溶性蛋白含量和乳酸含量的影响；
26.图4为料水比对发酵物可溶性蛋白含量和乳酸含量的影响；
27.图5为接种量对发酵物可溶性蛋白含量和乳酸含量的影响。
具体实施方式
28.本发明提供了一种用于制备高可溶性蛋白含量发酵饲料的复合菌剂，所述复合菌剂由枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)yy-10的菌剂、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)yy-14的菌剂和植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)yy-8的菌剂制备而成；所述枯草芽孢杆菌yy-10保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.24694；所述酿酒酵母yy-14保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.24698；所述植物乳杆菌yy-8保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.24692。
29.本发明所述复合菌剂中枯草芽孢杆菌yy-10在发酵时能分泌大量胞外酶，如蛋白酶、淀粉酶、纤维酶脂肪酶等，能降解饲料中蛋白质、多糖、脂肪等大分子营养物，促进吸收转化，从而降低养殖的饲料系数；所述酿酒酵母菌yy-14以玉米蛋白粉为发酵底物时可显著提高发酵原料的粗蛋白、氨基酸和总磷含量，提高发酵饲料营养价值；所述植物乳杆菌yy-8可产生抗真菌代谢产物来抑制真菌生长，并具有吸附和降解真菌毒素的能力。本发明复合菌剂中的三种菌株之间具有协同作用，进行混合发酵时可以产生复杂的酶系，酶促作用下生成的简单糖类可以立即被微生物利用，消除降解物的阻遏作用，进而增加饲料中的有益菌数量，提高其营养价值。
30.本发明所述枯草芽孢杆菌yy-10菌剂的制备方法包括：枯草芽孢杆菌按0.5-1.5％接种量接种于lb培养基中，于35-40℃、转速150-200r/min条件下，发酵14-18h；所述酿酒酵母yy-14菌剂的制备方法包括：酿酒酵母yy-14按0.5-1.5％接种量接种于ypd培养基中，于32-38℃、转速150-200r/min条件下，发酵14-18h；所述植物乳杆菌yy-8菌剂的制备方法包括：植物乳杆菌yy-8按0.5-1.5％接种量接种于mrs培养基中，于35-40℃发酵18-20h。
31.更优选的，所述枯草芽孢杆菌yy-10菌剂的菌体数量为(3.0-5.0)
×
108cfu/ml，所述酿酒酵母yy-14菌剂的菌体数量为(1.0-3.0)
×
107cfu/ml，所述植物乳杆菌yy-8菌剂的菌体数量为(2.0-4.0)
×
107cfu/ml；所述枯草芽孢杆菌yy-10菌剂、酿酒酵母yy-14菌剂和植物乳杆菌yy-8菌剂的体积比为(1-3):(1-3):(1-3)。
32.本发明还提供了一种高可溶性蛋白含量的发酵饲料，包括膨化玉米蛋白粉、玉米胚芽粕、糖蜜、酸性蛋白酶和上述复合菌剂；所述玉米蛋白粉、玉米胚芽粕和糖蜜的质量比为(2.5-6.5):(2.5-6.5):1；所述复合菌剂的接种量为所述玉米蛋白粉、玉米胚芽粕和糖蜜总质量的1％-10％；所述酸性蛋白酶的添加量为所述玉米蛋白粉、玉米胚芽粕和糖蜜总质量的0.05％-0.15％。
33.本发明所述玉米胚芽粕是一种副产物，由玉米胚芽经压榨或浸提取油后而得到，其主要营养成分为蛋白质和玉米纤维，营养丰富、价格低廉、氨基酸组成合理，粗纤维含量较高，一般为10％～20％，在饲料的营养中有重要作用；所述糖蜜是制糖工业的副产品，成本较低，其中主要含有大量可发酵糖(主要是蔗糖)，含糖量一般在40％～46％左右，糖蜜是发酵促进剂，糖蜜可以为复合菌剂中菌种的生长繁殖提供发酵底物。
34.为了确定膨化的玉米蛋白粉、玉米胚芽粕和糖蜜的最优比例，在其他条件不变(酸性蛋白酶0.1％，菌接种量3％，料水比为1:0.8，发酵时间120h，发酵温度为32℃)的情况下，设置膨化的玉米蛋白粉、玉米胚芽粕和糖蜜质量比分别为2.5:6.5:1、3.5:5.5:1、4.5:4.5:1、5.5:3.5:1、6.5:2.5:1，测定可溶性蛋白和乳酸的含量。具体结果见图3。
35.由图3可知，当玉米蛋白粉、玉米胚芽粕和糖蜜质量比为5.5:3.5:1时，玉米胚芽粕使物料的疏松度和通风达到最好，碳源和氮源比例最佳，有利于细菌生长繁殖，促进可溶性蛋白质和乳酸积累。所以确定膨化的玉米蛋白粉、玉米胚芽粕和糖蜜的质量比最优为5.5:3.5:1。
36.在本发明中，所述酸性蛋白酶的添加量优选为0.05％-0.15％，更优选为0.1％。在本发明发酵体系中添加酸性蛋白酶有利于提高产物的产量并缩短发酵时间，且酶解反应能够促进有益菌增殖，改善微生物发酵效果，并且酸性蛋白酶能够提高大分子物质的利用率，为菌株提供合成菌体蛋白的能量，进而提升饲料营养价值和饲料利用率，另外，酸性蛋白酶可加速分解底物，调节乳酸生成和ph值变化，改善饲料香味，提高饲料适口性。此外，本发明复合菌剂可加快酸性蛋白酶的解反应进程，共同促进底物酵解促进动物采食。菌酶协同发酵饲料结合微生物发酵饲料和酶解饲料的工艺特点，在改善饲料营养价值、提高饲料利用率、增加饲用效果、改变动物肠道微环境以及增强动物机体抗病力等多方面发挥了菌制剂和酶制剂协同效应。
37.本发明还提供了上述发酵饲料的制备方法，包括：将膨化玉米蛋白粉、玉米胚芽粕、糖蜜、酸性蛋白酶和复合菌剂混合后，于27-35℃条件下固态发酵108-132h。
38.为了确定最优的发酵时间，在其他条件不变(膨化的玉米蛋白粉、玉米胚芽粕和糖蜜的重量比为4.5:4.5:1，酸性蛋白酶0.1％，菌接种量3％，料水比为1:0.8g/ml，发酵温度为30℃)的情况下，在发酵时间分别为48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h、132h、144h、156h和168h时，测定可溶性蛋白和乳酸的含量(可溶性蛋白质测定方法为福林酚法，乳酸含量采用南京建成乳酸测定试剂盒比色法)。具体结果见图1。
39.微生物发酵前期营养物质充沛，产生一些蛋白酶，分解蛋白质，使可溶性蛋白质含量提高；到发酵中期由于微生物繁殖过多，饲料中营养不能满足细菌生长，会消耗部分可溶性蛋白质，导致可溶性蛋白质含量降低；发酵后期，部分细菌衰老死亡自溶，会使可溶性蛋白质含量有稍微提高。由图1可知，乳酸含量在108h以后趋于平稳，所以，综合考虑发酵时间确定为120h。
40.为了确定最优的发酵温度，在其他条件不变(膨化的玉米蛋白粉、玉米胚芽粕和糖蜜4.5:4.5:1，酸性蛋白酶0.1％，菌接种量3％，料水比为1:0.8g/ml，发酵时间120h)的情况下，设置发酵发酵温度分别为28℃、30℃、32℃、34℃、36℃时，测定可溶性蛋白和乳酸的含量。具体结果见图2。
41.由图2可知，当发酵时间为32℃时，可溶性蛋白质含量最高，其次30℃和34℃时的可溶性蛋白质含量居中。温度对酶活性有显著影响，温度越低酶活性越弱，温度越高酶活性越强。但是当温度过高时，蛋白质的二级结构或三级结构会遭到破坏，导致酶失去活性，不能再作为催化剂以催化反应。乳酸含量在32℃-36℃趋于平稳，34℃乳酸含量最高，但考虑可溶性蛋白质含量，所以，综合考虑发酵最优温度确定为32℃。
42.为了确定最优的接种量，在其它条件不变(膨化的玉米蛋白粉、玉米胚芽粕和糖蜜5.5:3.5:1，酸性蛋白酶0.1％，料水比分别为1:1.2，发酵时间120h，发酵温度为32℃)的情况下，设置菌接种量分别为1％、3％、5％、7％、10％进行发酵，测定可溶性蛋白和乳酸的含量。具体结果见图5。
43.由图5可知，可溶性蛋白质含量随接种量增加而增加，乳酸含量在5％-10％趋于稳
定，考虑工业生产菌种培养负担和成产成本，所以最终确定接种量为5％。
44.本发明所述所述膨化玉米蛋白粉的制备方法优选包括：将玉米蛋白粉于150-160℃下挤压膨化5-10s；所述温度更优选为155℃，时间更优选为8s；在所述挤压膨化后还优选包括粉碎；所述粉碎的粒径优选为30-50目，更优选为40目。玉米蛋白粉经过挤压膨化过程，蛋白质的分子结构发生改变，分子间氢键、二硫键部分断裂，导致蛋白质变性，蛋白质的消化率明显提高。
45.为了确定最优的料水比(玉米蛋白粉、玉米胚芽粕和糖蜜的质量与水的质量体积比)，在其它条件不变(膨化的玉米蛋白粉、玉米胚芽粕和糖蜜5.5:3.5:1，酸性蛋白酶0.1％，菌接种量3％，发酵时间120h，发酵温度为32℃)的情况下，设置料水比分别为1:0.6g/ml、1:0.8g/ml、1:1g/ml、1:1.2g/ml、1:1.5g/ml，测定可溶性蛋白和乳酸的含量。具体结果见图4。
46.由图4可知，料水比对发酵玉米蛋白粉中可溶性蛋白含量影响比较大，当料水比在1:0.6和1:1.2中间时，可溶性蛋白含量和乳酸含量随料水比增加而增加，当料水比过多时，影响菌体生长，从而降低可溶性蛋白含量和乳酸含量。综合考虑，料水比确定为1:1.2。
47.本发明还提供了上述发酵饲料在替换反刍动物豆粕饲料方面的应用。
48.本发明所述发酵饲料的添加量优选为15％-30％。
49.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
50.实施例1
51.菌种的筛选
52.1、枯草芽孢杆菌yy-10的筛选(筛选降解玉米蛋白粉能力强的菌株)
53.将实验室分离保藏的芽孢杆菌菌株分别进行梯度稀释，取10-3
,10-4
和10-5
涂布于脱脂乳平板，37℃静置培养48h进行菌体初筛。将水解透明圈较大的菌株点种于玉米蛋白粉筛选培养基进行复筛，将玉米蛋白粉筛选培养基上水解透明圈较大的菌株进行鉴定。
54.脱脂乳筛选培养基配方：10％脱脂乳粉，2％琼脂；
55.玉米蛋白粉筛选培养基配方：玉米蛋白粉3％，琼脂2％。
56.2、酿酒酵母yy-14的筛选(筛选菌体蛋白大的菌株)
57.将实验室分离保藏的酵母菌株分别进行梯度稀释，取10-3
,10-4
和10-5
涂布于ypd培养基，37℃静置培养48h。将能够在ypd固体培养基上良好生长的菌体接入ypd液体培养基，于37℃，180r/min培养24h，12000r/min离心，去上清液，反复三次用无菌水重悬菌体后，将得到的菌体烘干后称重，将干重较大的菌株进行鉴定。
58.3、植物乳杆菌yy-8的筛选(筛选产酸能力强的菌株)
59.将实验室分离保藏的乳酸菌菌株分别进行梯度稀释，取10-3
,10-4
和10-5
涂布于mrs-caco3固体培养基，37℃静置培养48h。取水解透明圈较大的菌株进行鉴定。
60.mrs-caco3固体培养基配方：mrs培养基，1％caco3，2％琼脂。
61.实施例2
62.本发明实施例中枯草芽孢杆菌yy-10菌剂、植物乳杆菌yy-8菌剂、酿酒酵母菌yy-14菌剂的制备方法如下：
63.(1)枯草芽孢杆菌yy-10的培养
64.lb液体培养基：胰蛋白胨10g、酵母浸出物5g、氯化钠10g、ph自然，蒸馏水1000ml，121℃蒸汽灭菌15min。
65.枯草芽孢杆菌yy-10按1％接种量接种于lb培养基中，发酵温度37℃，摇床转速180r/min，发酵时间16h。菌体数量为4
×
108cfu/ml，得到菌剂。
66.(2)酿酒酵母yy-14的培养
67.ypd液体培养基：酵母膏10g、蛋白胨20g溶解于900ml蒸馏水中，121℃蒸汽灭菌15min；葡萄糖20g溶解于100ml蒸馏水中，121℃蒸汽灭菌15min；将灭菌后的两种溶液混合均匀。
68.酿酒酵母yy-14按1％接种量接种于ypd培养基中，发酵温度35℃，摇床转速180r/min，发酵时间16h。菌体数量为2
×
107cfu/ml，得到菌剂。
69.(3)植物乳杆菌yy-8的培养
70.mrs液体培养基：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母粉5g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸二铵2g、醋酸钠5g、葡萄糖20g、吐温80 1ml、七水合硫酸镁0.58g、四水合硫酸锰0.25g，ph调至6.2-6.6，定容至1000ml，121℃蒸汽灭菌15min。
71.植物乳杆菌yy-8按1％接种量接种于mrs培养基中，发酵温度37℃，静置培养18h。菌体数量为3
×
107cfu/ml，得到菌剂。
72.实施例3
73.(1)将玉米蛋白粉于155℃条件下挤压膨化0.13min，粉碎过40目筛，得到膨化玉米蛋白粉；
74.(2)将枯草芽孢杆菌yy-10菌剂、植物乳杆菌yy-8菌剂、酿酒酵母菌yy-14菌剂按照体积比为3:1:2混合，得到复合菌剂；
75.(3)将5.5kg玉米蛋白粉、3.5kg玉米胚芽粕、1kg糖蜜、10g酸性蛋白酶和0.5kg复合菌剂混合后，调整料水比为1:1.2g/ml，于32℃条件下固态发酵120h，得到发酵饲料。
76.实施例4
77.(1)将玉米蛋白粉于150℃条件下挤压膨化10s，粉碎过50目筛，得到膨化玉米蛋白粉；
78.(2)将枯草芽孢杆菌yy-10菌剂、植物乳杆菌yy-8菌剂、酿酒酵母菌yy-14菌剂按照体积比为1:3:1混合，得到复合菌剂；
79.(3)将2.5kg玉米蛋白粉、6.5kg玉米胚芽粕、1kg糖蜜、5g酸性蛋白酶和1kg复合菌剂混合后，调整料水比为1:0.8g/ml，于27℃条件下固态发酵132h，得到发酵饲料。
80.实施例5
81.(1)将玉米蛋白粉于160℃条件下挤压膨化5s，粉碎过30目筛，得到膨化玉米蛋白粉；
82.(2)将枯草芽孢杆菌yy-10菌剂、植物乳杆菌yy-8菌剂、酿酒酵母菌yy-14菌剂按照体积比为2:2:3混合，得到复合菌剂；
83.(3)将6.5kg玉米蛋白粉、2.5kg玉米胚芽粕、1kg糖蜜、15g酸性蛋白酶和0.1kg复合菌剂混合后，调整料水比为1:1.2g/ml，于35℃条件下固态发酵108h，得到发酵饲料。
84.对比例1
85.具体实施方式和实施例3相同，不同的是将“5.5kg玉米蛋白粉、3.5kg玉米胚芽粕、
1kg糖蜜”物料改为“6.1kg玉米蛋白粉、3.9kg玉米胚芽粕”。
86.对比例2
87.具体实施方式和实施例3相同，不同的是采用的微生物菌剂为枯草芽孢杆菌yy-10菌剂。枯草芽孢杆菌yy-10菌剂的制备方法为：在无菌操作台中，取枯草芽孢杆菌yy-10菌种接种到lb液体培养基中，放入30℃摇床培养22h。
88.实验例1
89.分别检测实施例3和对比例1-2中得到的发酵饲料中可溶性蛋白质和乳酸的含量，具体结果见表1。
90.可溶性蛋白质和乳酸的含量的检测方法为：取1g发酵饲料与生理盐水进行1:50混匀，浸提12h，8000r/min离心4min，取上清液，分别在640nm、500nm条件下测定吸光度；计算可溶性蛋白质和乳酸含量。其中，可溶性蛋白质(％)＝(测定od值-0.039)/0.002/质量*样品测试前稀释倍数*100；乳酸mmol/l＝(测定od值-空白od值)/(标准od值-空白od值)*标准品浓度(3mmol/l)*样品测试前稀释倍数。
91.表1实施例3和对比例1-2发酵饲料中可溶性蛋白质和乳酸的含量
92.组别可溶性蛋白质(％)乳酸(mmol/l)实施例320.29137.1对比例118.32130.6对比例217.26128.9
93.由表1可知，本技术的制备方法得到的发酵饲料相对于对比例1和对比例2，能显著提高发酵饲料中可溶性蛋白质和乳酸的含量。可见，添加蜜糖以及采用复合菌剂对提高发酵饲料中可溶性蛋白质和乳酸的含量有积极的效果。
94.实验例2
95.发酵饲料替代豆粕进行体外瘤胃模拟发酵实验
96.羊日粮饲料为：羊草10％、玉米秸秆20％、玉米45.96％、豆粕13％、玉米ddgs 3％、小麦麸4％、磷酸氢钠0.6％、石粉1.6％、食盐0.8％、小苏打0.04％、预混料1％。
97.具体发酵实验如下：
98.(1)取瘤胃液取羊的瘤胃液放进发酵瓶内；
99.(2)实施例3发酵饲料替代豆粕量分别为：0％、25％、50％、75％、100％；
100.(3)进行体外瘤胃模拟发酵时间分别为：3h、6h、9h、12h、24h。
101.(4)测量指标分别为：产气量、ph值、氨态氮含量、菌体蛋白含量、乙酸含量、丙酸含量、丁酸含量。具体结果见表2-9。
102.其中，瘤胃液中ph用雷磁phs-3c酸度计测定；nh-n浓度采用冯宗慈等的改进方法测定；菌体蛋白mcp浓度采用zinn等的瞟吟法测定；乙酸、丙酸、丁酸浓度采用气相色谱按khorasani等的方法测定；参照张丽英的方法计算干物质和有机物含量。
103.表2不同发酵饲料替代豆粕量对产气量浓度的影响
[0104][0105]
饲料产气量与养分可消化程度呈正相关，饲料体外发酵中产气的底物主要为碳水化合物。产气量反映饲料可发酵程度及瘤胃微生物的活性，饲料的营养价值越高，微生物的发酵活性越强，产气量也越高。50％发酵饲料替代组高于对照组，说明添加适量的发酵饲料可以提高产气量。
[0106]
表3不同发酵饲料替代豆粕量对ph值的影响
[0107][0108][0109]
正常的ph值范围一般在5.5～7.5，没有差异。
[0110]
表4不同发酵饲料替代豆粕量对氨态氮nh
3-n(mg/dl)浓度的影响
[0111][0112]
反刍动物瘤胃内nh
3-n主要是由饲粮中的蛋白质、氨基酸等含氮物质的脱氨基作用而产生，是反映瘤胃内氮代谢的重要指标之一。50％和75％的发酵饲料替代组的nh
3-n浓度大于其他组别。
[0113]
表5不同发酵饲料替代豆粕量对菌体蛋白(mg/dl)浓度浓度的影响
[0114][0115]
菌体蛋白可为反刍动物提供重要的蛋白质来源，其浓度是衡量瘤胃发酵最重要的指标之一。50％发酵饲料替代组的mcp高于其他组。
[0116]
表6不同发酵饲料替代豆粕量对乙酸(mmol/l)浓度浓度的影响
[0117][0118]
50％和25％发酵饲料组的乙酸浓度高于其他组分。
[0119]
表7不同发酵饲料替代豆粕量对丙酸(mmol/l)浓度的影响
[0120][0121]
丙酸浓度与甲烷产生量成负相关，50％发酵饲料替代组高于其他组分。
[0122]
表8不同发酵饲料替代豆粕量对丁酸(mmol/l)浓度的影响
[0123][0124]
50％的发酵饲料组的丁酸浓度高于其他组。
[0125]
表9不同发酵饲料替代豆粕量对干物质降解率(％)的影响
[0126][0127]
50％发酵饲料替代组的干物质降解率高于其他组。
[0128]
由表2-9的数据可知，发酵饲料替代羊日粮中豆粕量50％时，能够达到促进消化的作用。
[0129]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种用于制备高可溶性蛋白含量发酵饲料的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂由枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)yy-10的菌剂、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)yy-14的菌剂和植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)yy-8的菌剂制备而成；所述枯草芽孢杆菌yy-10保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.24694；所述酿酒酵母yy-14保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.24698；所述植物乳杆菌yy-8保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.24692。2.根据权利要求1所述复合菌剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌yy-10菌剂的制备方法包括：枯草芽孢杆菌按0.5-1.5％接种量接种于lb培养基中，于35-40℃、转速150-200r/min条件下，发酵14-18h；所述酿酒酵母yy-14菌剂的制备方法包括：酿酒酵母yy-14按0.5-1.5％接种量接种于ypd培养基中，于32-38℃、转速150-200r/min条件下，发酵14-18h；所述植物乳杆菌yy-8菌剂的制备方法包括：植物乳杆菌yy-8按0.5-1.5％接种量接种于mrs培养基中，于35-40℃发酵18-20h。3.根据权利要求1或2所述的复合菌剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌yy-10菌剂的菌体数量为(3.0-5.0)
×
108cfu/ml，所述酿酒酵母yy-14菌剂的菌体数量为(1.0-3.0)
×
107cfu/ml，所述植物乳杆菌yy-8菌剂的菌体数量为(2.0-4.0)
×
107cfu/ml；所述枯草芽孢杆菌yy-10菌剂、酿酒酵母yy-14菌剂和植物乳杆菌yy-8菌剂的体积比为(1-3):(1-3):(1-3)。4.一种高可溶性蛋白含量的发酵饲料，其特征在于，包括膨化玉米蛋白粉、玉米胚芽粕、糖蜜、酸性蛋白酶和权利要求1-3任意一项所述复合菌剂；所述玉米蛋白粉、玉米胚芽粕和糖蜜的质量比为(2.5-6.5):(2.5-6.5):1；所述复合菌剂的接种量为所述玉米蛋白粉、玉米胚芽粕和糖蜜总质量的1％-10％；所述酸性蛋白酶的添加量为所述玉米蛋白粉、玉米胚芽粕和糖蜜总质量的0.05％-0.15％。5.一种权利要求4所述发酵饲料的制备方法，其特征在于，包括：将膨化玉米蛋白粉、玉米胚芽粕、糖蜜、酸性蛋白酶和复合菌剂混合后，于27-35℃条件下固态发酵108-132h。6.根据权利要求5的制备方法，其特征在于，所述膨化玉米蛋白粉的制备方法包括：将玉米蛋白粉于150-160℃下挤压膨化5-10s。7.根据权利要求6的制备方法，其特征在于，在所述挤压膨化后还包括粉碎；所述粉碎的粒径为30-50目。8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述发酵的料水比为1:0.8-1.5g/ml。9.权利要求4所述发酵饲料或权利要求5-8任意一项所述制备方法得到的发酵饲料在替代反刍动物豆粕饲料方面的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述发酵饲料的添加量为15％-30％。

技术总结
本发明提供了一种高可溶性蛋白含量的发酵饲料及其制备方法和应用，属于生物发酵技术领域。本发明所述制备方法包括：将玉米蛋白粉挤压膨化，与玉米胚芽粕、糖蜜、酸性蛋白酶和复合菌剂混合，固态发酵后得到发酵饲料。本发明采用枯草芽孢杆菌YY-10、植物乳杆菌YY-8、酿酒酵母菌YY-14协同固态发酵的制备方法，通过添加糖蜜提高可溶性蛋白质和乳酸含量，有利于肠道菌群平衡，提高了饲料营养吸收利用率。实验结果表明，采用本发明制备方法得到的饲料，可溶性蛋白质含量最高可达20.29％，乳酸含量最高可达到137.1nmol/L；并且本发明的饲料替换豆粕可促进消化吸收，降低饲养成本。降低饲养成本。降低饲养成本。


技术研发人员：郑喜群 徐畅 刘晓兰
受保护的技术使用者：齐齐哈尔大学
技术研发日：2023.03.22
技术公布日：2023/7/26