基于非标记法DNA生物传感器实现汞离子和铅离子同步检测的方法及其DNA探针

基于非标记法dna生物传感器实现汞离子和铅离子同步检测的方法及其dna探针
技术领域
1.本发明属于环境分析技术领域，具体涉及基于非标记法dna生物传感器实现汞离子和铅离子同步检测的方法及其dna探针。


背景技术：

2.随着近年科技和工业的迅速发展，重金属被广泛应用于国防军工、化工制造等多个产业，广泛地存在于人类日常的生产生活中。重金属化合物会导致水体严重污染，其中，汞离子和铅离子污染的影响最为严重，它们具有危害大和治理难等显著特点，可在水体中通过富集作用产生更强烈的毒性，最终通过食物链进入人体内导致患上多种疾病，如心血管疾病、神经性疾病等，对公众健康安全构成了严重的威胁。尽管冷原子吸收光谱法、电感耦合等离子体法(icp-oes/ms)等传统方法能满足两种离子同步检测的需求，且灵敏度高、检出限低，但它们的检测成本极高、预处理过程繁琐、对操作人员要求较高，重要的是无法做到实时监测，不适于在实际生活中应用推广。
3.因此，开发一种操作简单、成本低、灵敏性高、检测快速且满足hg
2+
和pb
2+
同步检测的dna探针尤其重要。


技术实现要素：

4.本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供一种能够同步检测汞离子和铅离子的dna探针。
5.本发明所采取的技术方案是：
6.一种能够同步检测汞离子和铅离子的dna探针odn-1，序列如下：
[0007]5’‑
ttttttccggttggtgtggttggtttttt-3’。
[0008]
所述的dna探针odn-1与待测样品混合后，当样品中有汞离子存在时，dna链的tt碱基与汞离子形成t-hg
2+-t配对；当样品中有铅离子存在时，铅离子与g碱基形成的g-四链体相互作用，致使t-hg
2+-t的构象改变。
[0009]
本发明的第二个目的是提供上述dna探针在水样中同步检测汞离子和铅离子的应用。
[0010]
本发明的第三个目的是提供一种基于非标记法dna生物传感器实现汞离子和铅离子同步检测的方法，利用特定序列的非标记的寡核苷酸链和两种缓冲液及一种嵌入式荧光剂dapi基于荧光法实现对汞离子和铅离子的检测，具有成本较低，检测快速的优点。
[0011]
一种基于非标记法dna生物传感器实现汞离子和铅离子同步检测的方法，采用如下技术方案：
[0012]
步骤(1)、将上述dna探针溶于缓冲液，然后加入待测样品混匀得到混合溶液，室温下静置4-6min；
[0013]
步骤(2)、将嵌入式荧光剂dapi(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)加入步骤(1)所得混合
溶液中并混匀，室温下静置一段时间；
[0014]
步骤(3)、测定步骤(2)静置后溶液的荧光信号强度。
[0015]
作为优选，步骤(1)中所述dna探针的浓度为20-25nm。
[0016]
作为优选，检测汞离子时，步骤(2)中所述缓冲液为tris-hac缓冲液；
[0017]
所述tris-hac缓冲液的浓度为25mm，ph为7.5，由三羟基甲基氨基甲烷tris、醋酸hac和100mmnaac配制得到。
[0018]
作为优选，检测铅离子时，步骤(2)中所述缓冲液为加入有nacl的tris-hcl缓冲液；
[0019]
所述加入有nacl的tris-hcl缓冲液的浓度为25mm，ph为8.5，由三羟基甲基氨基甲烷tris、盐酸hcl和100mmnacl配制得到。
[0020]
作为优选，检测铅离子时，步骤(2)静置后还需加入1000-1200nm汞离子，混匀并静置5-7min。
[0021]
作为优选，步骤(2)中dapi的浓度为100-125nm，静置时间为20-22min。
[0022]
步骤(2)中采用的嵌入式荧光剂dapi自身显示极微弱的荧光信号，当待测样品中不存在汞离子和铅离子时，几乎可忽略；存在汞离子时，dapi嵌入到t-hg
2+-t复合物中，显示出强烈的荧光信号；存在铅离子时，t-hg
2+-t复合物的二级结构发生改变，荧光信号淬灭，从而实现荧光开关的功能。
[0023]
荧光检测可以通过荧光分光光度计来实现，步骤简易，成本较低，结果实时，检测范围广，通过判断荧光信号的开关和强度大小，即可对汞离子和铅离子达到定性定量检测和实时检测的目的。
[0024]
本发明的有益效果是：
[0025]
(1)本发明所述的dna探针具有较高的灵敏度，对汞离子和铅离子的检测限分别为4.094nm和3.22nm，检测结果可通过荧光数值判断，两种离子可定量检测的范围广，操作简便可以实现实时检测的目的。
[0026]
(2)本发明所述的dna探针对汞离子和铅离子均有较强的特异性，常见的其他金属离子对检测不产生干扰作用。
[0027]
(3)本发明所述的dna探针可同步实现对汞离子和铅离子的检测，溶液中同时存在汞离子和铅离子时均可实现对其中某一离子的单独检测。
[0028]
(4)本发明所述的dna探针已完成对自来水样本的测试，具有较高的回收率，可在实际生活中应用推广。
[0029]
(5)本发明的dna探针，操作简单方便，仅需使用简单的仪器即可进行检测，不需要专业的技术人员和繁琐复杂的制备过程。
附图说明
[0030]
图1为本发明中检测汞离子和铅离子的原理图；其中(a)为存在汞离子时，dapi嵌入到t-hg
2+-t复合物中，荧光信号开启；(b)为存在铅离子时，t-hg
2+-t复合物的二级结构发生改变，荧光信号关闭；
[0031]
图2为不同浓度的汞离子和铅离子的荧光曲线图以及汞离子和铅离子浓度与荧光强度线性关系图，其中(a)为不同浓度的汞离子的相对荧光(f-f0)强度曲线图；(b)为相对
荧光(f-f0)强度与汞离子浓度之间的线性关系；(c)为不同浓度的铅离子的相对荧光(f-f0)强度曲线图；(d)为相对荧光(f-f0)强度与铅离子浓度之间的线性关系；
[0032]
图3为不同金属离子干扰下的对汞离子和铅离子特异性检测的结果图；其中其中(a)为溶于tris-hac缓冲液中的汞离子和其他金属离子单独检测时的相对荧光强度；(b)为溶于tris-hac的汞离子和其他金属离子混合检测时的相对荧光强度；(c)为溶于tris-hcl缓冲液的铅离子和汞离子以及铅离子、汞离子和其他金属离子混合检测时的相对荧光强度；(d)为溶于tris-hcl缓冲液的汞离子和其他金属离子混合检测时的相对荧光强度。
具体实施方式
[0033]
下面结合实例对本发明作进一步的说明，但并不仅限于此。
[0034]
本发明公开一种能够同步检测汞离子和铅离子的dna探针odn-1，所述dna探针序列含有6对t碱基，5’端的t碱基旁有两个c碱基，具体序列如下：
[0035]5’‑
ttttttccggttggtgtggttggtttttt-3’[0036]
本发明对汞离子的检测采用如下实施方案：
[0037]
(1)用tris-hac(25mm，含有100mmnaac，ph7.5)的缓冲液溶解20-25nm探针odn-1。
[0038]
(2)加入待测样品，混匀后，于室温下放置4-6分钟。
[0039]
(3)加入100-125nm嵌入式荧光剂dapi，混匀后于室温下放置20-22分钟。
[0040]
(4)采用荧光分光光度计检测荧光强度。
[0041]
上述实施方案的原理图如图1中(a)路线所示。
[0042]
本发明对铅离子的检测采用如下实施方案：
[0043]
(1)用加入有nacl的tris-hcl缓冲液(25mm，含有100mmnacl，ph8.5)溶解20-25nm探针odn-1。
[0044]
(2)加入1000-1200nm汞离子，混匀后，于室温下放置5-7分钟。
[0045]
(3)同时加入待测样品，混匀后，于室温下放置4-6分钟。
[0046]
(4)加入100-125nm嵌入式荧光剂dapi，混匀后，于室温下放置20-22分钟。
[0047]
(5)采用荧光分光光度计检测荧光强度。
[0048]
上述实施方案的原理图如图1中(b)路线所示。
[0049]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，在本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0050]
实施例1
[0051]
利用dna探针odn-1检测样品中的汞离子，dna探针序列odn-1如下：ttttttccggttggtgtggttggtttttt。
[0052]
(1)配制25mmtris-hac缓冲液(含有100mmnaac，ph7.5)，将探针odn-1溶解于缓冲液中，使探针odn-1的浓度为20nm。
[0053]
(2)加入待测样品，混匀后，于室温下放置5分钟。这一步中，若待测样品中含有汞离子，则探针序列odn-1的t碱基部分将与汞离子形成t-hg
2+-t复合物。
[0054]
(3)加入125nm嵌入式荧光剂dapi，混匀后，于室温下放置20分钟。这一步中，若待
测液中含有汞离子，荧光剂嵌入到t-hg
2+-t结构中，荧光信号增强，以实现检测汞离子的目的。
[0055]
(4)若该过程待测样品中含有铅离子，由于铅离子和醋酸根离子形成醋酸铅，此时铅离子对汞离子检测无干扰。
[0056]
实施例2
[0057]
利用dna探针odn-1检测样品中的铅离子，dna探针序列odn-1如下：ttttttccggttggtgtggttggtttttt。
[0058]
(1)先用加入有nacl的tris-hcl缓冲液(25mm，含有100mmnacl，ph8.5)溶解探针odn-1，使探针odn-1的浓度为20nm。
[0059]
(2)加入1000nm汞离子，混匀后，于室温下放置5分钟。这一步中，探针序列odn-1的t碱基部分将与汞离子形成t-hg
2+-t复合物。
[0060]
(3)加入待测样品，混匀后，于室温下放置20分钟。这一步中，若待测样品中含有铅离子，铅离子与g-四链体发生诱导作用，进而改变t-hg
2+-t复合物的二级结构。
[0061]
(4)加入125nm嵌入式荧光剂dapi，混匀后，于室温下放置20分钟。这一步中，荧光剂dapi从结构中释放，荧光信号降低，以实现检测铅离子的目的。
[0062]
(5)若该过程待测样品中含有汞离子，经实验验证汞离子浓度为1000nm时，荧光信号已经达到饱和，因此即使待测样品中含有汞离子，也不会对铅离子检测产生干扰。
[0063]
实施例3：对不同浓度的汞离子和铅离子的检测：
[0064]
(1)配制汞离子标准溶液，浓度分别为0，1，3，5，10，20，50，100，200，300，500，600，800和1000nm。
[0065]
(2)将上述不同浓度的汞离子溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后，使用荧光分光光度计检测其荧光信号。每个反应至少重复3次后，结果如图2(a)和(b)所示，随着汞离子浓度的增加，荧光信号逐渐增强；汞离子浓度在0-1000nm范围内，荧光信号和汞离子浓度呈线性关系。
[0066]
(3)配制铅离子标准溶液，浓度分别为0，0.01，0.05，0.1，0.3，1，5，10，15，25，30，40和50μm。
[0067]
(4)将上述不同浓度的铅离子溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后，使用荧光分光光度计检测其荧光信号。每个反应至少反复3次后，结果如图2(c)和(d)所示，随着铅离子浓度的增加，荧光信号逐渐减弱；铅离子浓度在0-40μm范围内，荧光信号和铅离子浓度呈线性关系。
[0068]
实施例4：对不同金属离子干扰的检测：
[0069]
(1)对汞离子检测时常见金属离子的干扰：
[0070]
配制不同金属离子的标准溶液，分别是k
+
，mg
2+
，cu
2+
，co
2+
，ca
2+
，ni
2+
，fe
2+
，mn
2+
，cd
2+
，pb
2+
和ag
+
，金属离子浓度是6μm。
[0071]
将上述金属离子标准溶液和1000nm汞离子标准溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后，使用荧光分光光度计在450nm的最大发射波长下对溶液的荧光信号进行检测。从图3(a)和(b)的检测结果可以看出，6μm的k
+
，mg
2+
，cu
2+
，co
2+
，ca
2+
，ni
2+
，fe
2+
，mn
2+
，cd
2+
，pb
2+
和ag
+
对检测方法均无干扰。只有当汞离子加入时，荧光信号才会增加，证明本发明对汞离子的检测有很好的特异性。
[0072]
(2)对铅离子检测时常见金属离子的干扰：
[0073]
配制50μm的不同金属离子的标准溶液，分别是mn
2+
，ni
2+
，ca
2+
，cu
2+
，fe
2+
，mg
2+
，co
2+
和k
+
。
[0074]
将上述金属离子标准溶液和50μm铅离子标准溶液分别加到实施例2中所述的反应体系中，充分反应后，使用荧光分光光度计在450nm的最大发射波长下对溶液的荧光信号进行检测。从图3(c)和(d)的检测结果可以看出，50μm的mn
2+
，ni
2+
，ca
2+
，cu
2+
，fe
2+
，mg
2+
，co
2+
和k
+
对检测方法均无干扰。只有当铅离子加入时，荧光信号才会淬灭，证明本发明对铅离子的检测有很好的特异性。
[0075]
实施例5：对汞离子和铅离子在实际样本中的检测
[0076]
分别配制浓度为20nm，200nm，600nm的汞离子自来水样品和浓度为0.5μm，5μm，10μm的铅离子自来水样品。
[0077]
设置四组实验组，配置和操作如下：
[0078]
第一组：采用实施例1方法分别对20nm，200nm，600nm的汞离子自来水样品进行反应，使用荧光分光光度计检测其荧光信号；
[0079]
第二组：将20nm的汞离子自来水样品与0.5μm的铅离子自来水样品混合，将200nm的汞离子自来水样品与5μm的铅离子自来水样品混合，将600nm的汞离子自来水样品与10μm的铅离子自来水样品混合，然后采用实施例1方法分别对三种混合样品进行反应，使用荧光分光光度计检测其荧光信号；
[0080]
第三组：采用实施例2方法分别对0.5μm，5μm，10μm的铅离子自来水样品进行反应，使用荧光分光光度计检测其荧光信号；
[0081]
第四组：将20nm的汞离子自来水样品与0.5μm的铅离子自来水样品混合，将200nm的汞离子自来水样品与5μm的铅离子自来水样品混合，将600nm的汞离子自来水样品与10μm的铅离子自来水样品混合，然后采用实施例2方法分别对三种混合样品进行反应，使用荧光分光光度计检测其荧光信号；
[0082]
结果如表1-4所示。
[0083]
表1自来水样品中hg
2+
检测的平均回收率(n＝3)
[0084][0085]
表2自来水样品(含有铅离子)中hg
2+
检测的平均回收率(n＝3)
[0086][0087]
表3自来水样品中pb
2+
检测的平均回收率(n＝3)
[0088][0089]
表4自来水样品(含有汞离子)中pb
2+
检测的平均回收率(n＝3)
[0090][0091]
从表1-4中所示的检测结果可以看出，无论样品中是单独存在汞离子或单独存在铅离子，还是同时存在汞离子和铅离子，均有较好的回收率，证明该方法对汞离子和铅离子的检测有很好的实际应用性。
[0092]
以上实施实例为介绍本发明的优选案例，本发明并非仅限于上述实施实例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，均属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种能够同步检测汞离子和铅离子的dna探针odn-1，其特征在于所述dna探针odn-1的序列如下：5
’‑
ttttttccggttggtgtggttggtttttt-3’。2.权利要求1所述的dna探针odn-1探针在同步检测水样中汞离子和铅离子方面的应用。3.一种基于非标记法dna生物传感器实现汞离子和铅离子同步检测的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤(1)、将权利要求1所述的dna探针odn-1溶于缓冲液，然后加入待测样品混匀得到混合溶液，室温下静置4-6min；步骤(2)、将嵌入式荧光剂dapi加入步骤(1)所得混合溶液中并混匀，室温下静置一段时间；步骤(3)、测定步骤(2)静置后溶液的荧光信号强度。4.根据权利要求3所述的一种基于非标记法dna生物传感器实现汞离子和铅离子同步检测的方法，其特征在于，步骤(1)中所述dna探针odn-1的浓度为20-25nm。5.根据权利要求3所述的一种基于非标记法dna生物传感器实现汞离子和铅离子同步检测的方法，其特征在于，检测汞离子时，步骤(2)中所述缓冲液为tris-hac缓冲液；所述tris-hac缓冲液的浓度为25mm、ph为7.5，由三羟甲基氨基甲烷tris、醋酸hac和100mmnaac配制得到。6.根据权利要求3所述的一种基于非标记法dna生物传感器实现汞离子和铅离子同步检测的方法，其特征在于，检测铅离子时，步骤(2)中所述缓冲液为加入有nacl的tris-hcl缓冲液。7.根据权利要求3所述的一种基于非标记法dna生物传感器实现汞离子和铅离子同步检测的方法，其特征在于，检测铅离子时，步骤(2)静置后还需加入1000-1200nm汞离子，混匀并静置5-7min。8.根据权利要求3所述的一种基于非标记法dna生物传感器实现汞离子和铅离子同步检测的方法，其特征在于，步骤(2)中dapi的浓度为100-125nm。9.根据权利要求3所述的一种基于非标记法dna生物传感器实现汞离子和铅离子同步检测的方法，其特征在于，步骤(2)中静置时间为20-22min。

技术总结
本发明公开一种基于非标记法DNA生物传感器实现汞离子和铅离子同步检测的方法及其DNA探针。本发明方法结果灵敏，操作简易，成本较低，在检测范围内，汞、铅两种离子浓度和荧光信号均呈良好的线性关系。本发明对于汞、铅两种离子均有良好的特异性，钾、铜、镍、镁、钙等多种金属离子对检测均无干扰作用；对汞离子和铅离子的检测限分别为4.094nM和3.22nM，且整个检测过程在室温下即可完成，通过荧光分光光度计可以直接获取结果，已完成对自来水实际样本的测试，检测过程便捷快速，可用于实际水体中检测汞离子和铅离子。测汞离子和铅离子。测汞离子和铅离子。


技术研发人员：刘禹辛 李翔翔 高子涵 蔡雨乐 徐悠扬 裘洁琼
受保护的技术使用者：浙江理工大学
技术研发日：2023.03.27
技术公布日：2023/8/5