一种热稳定性提高的乙醇脱氢酶ADH10C1及其基因和应用的制作方法

一种热稳定性提高的乙醇脱氢酶adh10c1及其基因和应用
技术领域
1.本发明属于基因工程及酶工程领域，具体涉及一种热稳定性提高的乙醇脱氢酶adh10c1及其基因和应用。


背景技术：

2.酒精进入人体后，主要是依靠肝脏来分解的。这个分解的过程一共分为两个步骤：把酒精(乙醇)分解成乙醛，这个过程需要乙醇脱氢酶参与；把乙醛转化成乙酸，这个过程同样需要酶的参与，这也就是乙醛脱氢酶。
3.生物催化技术是一种以微生物细胞或酶作为催化剂进行物质转化的技术。它具有条件温和、副反应少、选择性强、能耗低以及对环境友好等优点，已经取得了显著的成就。尤其是在绿色化学和医药领域引起了广泛的关注。其中酶作为一种常见的生物催化剂，在生物催化过程中具有具足轻重的作用。
4.乙醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase，简称adh)大量存在于人和动物肝脏、植物及微生物细胞之中，以锌原子为辅基、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)为辅酶的胞质二聚体酶，催化伯醇和醛之间的可逆反应:ch3ch2oh+nad
+
→
ch3cho+nadh+h
+
。是生物体内重要的氧化还原酶，在很多生理过程中起到重要的作用，在人和哺乳动物体内，乙醇脱氢酶与乙醛脱氢酶(aldh)构成了乙醇脱氢酶系，参与体内乙醇代谢：乙醇脱氢酶催化乙醇氧化，脱下乙醇的氢原子转移到nad上，转化成还原形式的nadh并产生乙醛。乙醛和辅酶nad在乙醛脱氢酶的作用下转化成乙酸，并产生nadh。乙酸最终转化成乙酰辅酶a进入三羧酸循环，最终产生水、二氧化碳和大量的能量。adh与乙醛脱氢酶的活力高低决定了乙醇在体内代谢的速度。adh除参与乙醇代谢以外，还参与视黄醇、脂族醇、羟类固醇、脂质过氧化产物等的代谢，乙醇生物传感器中应用的酶、化工生产中被用做生物催化剂修饰或合成多种原材料、手性化合物。
5.在实验室中进行过研究的酶不下几千种，但应用的只有极少数，其主要原因是这些酶在生物条件或自然条件下具有活性，但在实际生产系统中，其活性极差，不能应用。在工业生产中，几乎所有的反应体系都是在酸、碱或溶剂体系中，温度也较高，因此绝大多数酶在这种条件下都会变性。突变酶是通过有控制的对天然酶基因进行剪切、修饰或突变，从而改变这些酶的催化特性、底物专一性或辅酶专一性，使之更加符合人类的社会生产、生活需要的一种酶。
6.乙醇脱氢酶作为人体内乙醇代谢的必需酶，adh活性已被作为一项重要的检测指标，用于观察解酒药物对adh是否具有诱导作用。通过改造微生物生产adh，并对其酶学性质进行相关的研究已成为当下研究热点，开发高活性的adh已经成为解酒药研究的重要方向之一。目前已经从不同来源的微生物中分离出多种乙醇脱氢酶基因，其中，大多数乙醇脱氢酶的ph稳定性以及热稳定性较差，大多超过40℃时酶活急剧下降。综上所述，克隆并分离稳定性较好的、具有潜在应用价值的乙醛脱氢酶基因，无论是从扩大基因资源还是实际生产应用的角度都具有重要意义。


技术实现要素：

7.为了解决上述问题，本发明提供的乙醇脱氢酶最适ph为8.5，在ph7.5-10.5都有较高的酶活性；ph稳定性好；具有良好的抗蛋白酶的能力。在70℃高温下保持5min仍维持80％酶活，其耐高温特性，可使其在需求高温环境的工业生产上应用。本发明扩大了乙醇脱氢酶基因的资源，也为乙醇代谢过程中乙醇转化为乙醛提供了优良的乙醇脱氢酶，在食品、制作解酒饮品方面具有潜在的应用价值。
8.本发明提供了一种耐热性提高的乙醇脱氢酶adh10c1，其氨基酸序列为seq id no.4。
9.具体地，所述的乙醇脱氢酶adh10c1是由乙醇脱氢酶adh10的序列seq id no.2突变获得，其突变位点是g201c，g207c，p52c和e56c。
10.所述的g201c，g207c，p52c和e56c分别表示seq id no.2第201位甘氨酸突变为半胱氨酸、第207位甘氨酸突变为半胱氨酸、第52位脯氨酸突变为半胱氨酸、第56位谷氨酸突变为半胱氨酸。
11.具体地，所述的序列seq id no.4的n端连接信号肽序列seq id no.3。
12.另一方面，本发明还提供了编码前述的乙醇脱氢酶adh10c1的基因序列。
13.具体地，所述的基因序列为seq id no.5或与seq id no.5具有90％以上同一性的序列。
14.所述的具有90％以上同一性的序列指由于一个氨基酸由一个以上的三联体密码编码即密码子的简并性，导致不同的基因序列编码同一种氨基酸的现象。认为与基因seq id no.3具有90％以上同一性的序列是可以编码同一种氨基酸的。
15.另一方面，本发明提供了一种包括前述的乙醇脱氢酶adh10c1基因序列的重组载体。
16.具体地，所述的载体可以是质粒、噬菌体和病毒中的一种。
17.优选地，所述的载体为质粒；进一步优选为ppic9质粒。
18.具体地，乙醇脱氢酶adh10c1基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间。
19.优选地，将乙醇脱氢酶adh10c1基因插入质粒ppic9上的ecori和noti限制性酶切位点之间。
20.又一方面，本发明提供了包括前述重组载体的细胞。
21.具体地，所述的细胞可以是用于表达蛋白的基因工程细胞，包括但不限于：植物细胞、动物细胞、细菌、酵母。
22.优选地，所述的细胞为工程菌。
23.进一步优选地，所述的工程菌可以是大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。
24.又一方面，本发明提供了一种乙醇脱氢酶的制备方法，包括以下步骤：
25.(1)用前述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
26.(2)培养重组菌株，诱导重组蛋白酶表达；
27.(3)回收并纯化乙醇脱氢酶adh10c1。
28.具体地，所述的宿主细胞可以是毕赤酵母菌、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞。
29.优选地，所述的宿主细胞为毕赤酵母。
30.进一步优选地，所述的宿主细胞为毕赤酵母gs115。
31.再一方面，本发明提供了乙醇脱氢酶adh10c1在制备解酒饮品中的应用。本发明所取得的的技术效果：
32.(1)本发明提供的乙醇脱氢酶adh10c1最适ph为8.5，在ph7.5-10.5都有较高的酶活性；ph稳定性好。
33.(2)乙醇脱氢酶adh10c1还具有热稳定性高的特性70℃下处理5min，剩余酶活仍在80％以上，而对照组重组乙醇脱氢酶adh10c在60℃处理5min即失去大部分酶活，可使其在需求高温环境的工业生产上得到应用。
34.(3)乙醇脱氢酶adh10c1抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的能力均有提高，具有良好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的能力。
附图说明
35.图1为乙醇脱氢酶以及突变体的最适ph。
36.图2为乙醇脱氢酶以及突变体的ph稳定性。
37.图3为乙醇脱氢酶以及突变体的最适温度。
38.图4为乙醇脱氢酶以及突变体的热稳定性。
39.图5为adh1、adh2和adh10c1的热稳定性。
40.图6为adh1、adh2和adh10c1的ph稳定性。
具体实施方式
41.下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
42.试验材料和试剂
43.1、菌株及载体：本发明的乙醇脱氢酶突变体adh10c1由北京睿博兴科生物技术有限公司合成获得，毕赤酵母表达载体ppic9及菌株gs115购自于invitrogen公司。
44.2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自takara公司，连接酶购自invitrogen公司。乙醇以及其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
45.3、培养基：
46.(1)酵母培养基ypd(100ml)：1g蛋白胨、0.5g酵母提取物、1g葡萄糖，2g琼脂，ph7.0。
47.(2)大肠杆菌培养基lb(100ml):1g蛋白胨、0.5g酵母提取物、1gnacl,ph7.0,)。
48.(3)bmgy培养基(100ml)：1g酵母提取物，2g蛋白胨，1.34gynb，0.00004gbiotin，1％甘油(v/v)。
49.(4)bmmy培养基：除以0.5％(v/v)甲醇代替甘油，其余成份均与bmgy相同，ph4.0。
50.说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
51.实施例1乙醇脱氢酶adh10c1的制备
52.1.1鲁氏接合酵母zygosaccharomyces rouxi cbs732乙醇脱氢酶突变体编码基因adh10c1的合成
53.本发明以来自于鲁氏接合酵母zygosaccharomycesrouxi cbs732乙醇脱氢酶adh10基因作为参考，获得的乙醇脱氢酶adh10的氨基酸序列为seq id no.1，该酶基因编码405个氨基酸，n端102个氨基酸为其预测的信号肽序列seq id no.3。
54.成熟的乙醇脱氢酶adh10的理论分子量为39.6kda，其氨基酸序列为seq id no.2，对其氨基酸序列(seq id no.2)进行如下突变(g201c，g207c，p52c，e56c)，并在突变后的基因序列的5’端与3’端分别加入ecori和noti限制酶切位点，将序列发送至北京睿博兴科生物技术有限公司进行人工合成基因。人工合成的乙醇脱氢酶突变体adh10c1氨基酸序列如seq id no.4所示，其核苷酸序列如seq id no.5所示。
55.1.2乙醇脱氢酶突变体编码基因adh10c1的克隆
56.提取携带甘露聚糖酶突变体的基因载体
57.合成好的基因载体以穿刺菌的形式保存，于超净台中用无菌牙签挑取穿刺菌，并置于含amp(工作浓度：100μg/ml)抗生素的lb摇管中，37℃，220rpm过夜培养，次日按康为世纪质粒提取试剂盒pureplasmid mini kit(cw0500)说明书步骤进行实验提取含有突变体基因的载体。
58.根据乙醇脱氢酶adh10基因序列，设计并合成了引物seq id no.6；seq id no.7。
59.以提取后的载体为模板进行pcr扩增。pcr反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，45℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环后72℃保温10min。得到一约1122bp片段，将该片段回收后与pmd19载体相连送北京睿博兴科生物技术有限公司测序，
60.根据测序得到的核苷酸序列，通过dnaman软件将得到的核苷酸序列与adh10基因序列进行比对，确认g201c，g207c，p52c，e56c四处位置的突变无误。
61.1.3重组乙醇脱氢酶的制备
62.将表达载体ppic9进行双酶切(ecori+noti)，同时将编码乙醇脱氢酶突变体的基因adh10c1双酶切(ecori+noti)，切出编码成熟乙醇脱氢酶的基因片段与表达载体ppic9连接。将乙醇脱氢酶基因插入到质粒ppic上的ecori和noti限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于aox1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒ppic9-adh10c1，并转化毕赤酵母gs115，获得重组毕赤酵母菌株gs115/adh10c1。
63.取含有重组质粒的gs115菌株与对照菌株(即未突变的菌株gs115/adh10)，接种于300mlbmgy培养液中，30℃，250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于150mlbmmy培养基重悬，30℃，250rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清。测定乙醇脱氢酶的活力。sds-page结果表明，重组乙醇脱氢酶在毕赤酵母中得到了表达。
64.实施例2重组乙醇脱氢酶adh10c1的活性分析
65.具体方法如下：在ph8.5，35℃条件下，取0.03mol/l ph8.5的tris-hcl缓冲液、1mm的nad溶液、100mm的乙醇溶液，按70μl：10μl：10μl的比例混合后，将混合液置于石英比色皿中，加入10μl酶液快速混匀后，立即于340nm波长处测吸光度值。定义每分钟吸光度值增加0.001为1个酶活单位(u)。重组乙醇脱氢酶的表达量为10.44u/ml，对照组甘露聚糖酶表达量为10.20u/ml。sds-page结果表明，重组乙醇脱氢酶在毕赤酵母中得到了表达。
66.实施例3重组乙醇脱氢酶adh10c1的性质测定
67.1、重组乙醇脱氢酶adh10c1的最适ph和ph稳定性的测定方法如下：
68.在测量重组乙醇脱氢酶的最适ph时，必须固定两种底物乙醇、nad浓度和乙醇脱氢酶用量的不变，只改变反应体系中缓冲液的ph值，使用缓冲液如下：
69.kh2po
4-naoh缓冲液(ph6.5-7.5)，tris-hcl缓冲液(ph8.0-8.5)，glycine-naoh缓冲液(ph9.0-10.5)，na2hpo
4-naoh缓冲液(ph11.0-11.5)。我们通过比较乙醇脱氢酶在不同ph缓冲液中进行酶活的测定来确定酶的最适ph。结果(图1)表明，乙醇脱氢酶的最适ph为8.5，在ph7.5-10.5均有60％以上的相对酶活性。将酶液在不同ph值的缓冲液中处理60min，测定酶活以研究酶的ph耐性。结果(图2)表明重组乙醇脱氢酶在ph7.0-10.5之间均很稳定，在此ph范围内处理60min后剩余酶活性在70％以上，而对照组重组乙醇脱氢酶adh10ch范围内处理60min后剩余酶活性在50％左右，这说明此酶在碱性和中性范围内具有较好的ph稳定性。
70.2、乙醇脱氢酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：
71.乙醇脱氢酶的最适温度的测定为在tris-hcl缓冲液(ph 8.5)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为乙醇脱氢酶在不同温度下处理相同时间，再在35℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图3)其最适温度为35℃。酶的热稳定性性试验表明(图4)，重组乙醇脱氢酶adh10c1在70℃下处理5min，剩余酶活仍在80％以上(图4)，而对照组重组乙醇脱氢酶adh10在60℃处理5min即失去大部分酶活，表明重组乙醇脱氢酶adh10c的热稳定性较对照组相比有明显提高。
72.3、乙醇脱氢酶抗胰蛋白酶能力测定如下：
73.用ph8.5tris-hcl缓冲液配制0.1mg/ml胰蛋白酶。取ph8.5tris-hcl缓冲液稀释后的0.5ml纯化的酶液加入0.5ml胰蛋白酶混合，蛋白酶/乙醇脱氢酶(w/w)≈0.1，35℃保温60和120min取样，在ph8.5及35℃条件下测定酶活性。实验结果表明乙醇脱氢酶adh10c1用胰蛋白酶处理120min后，胰蛋白酶处理后的adh10c1的酶活比处理前提高了23％。
74.对比例
75.参考实施例3的方法设计对比实验，对比adh10c1与两种不同来源乙醇脱氢酶热稳定性和ph稳定性。将来源于马肝的乙醇脱氢酶adh1和玉米的乙醇脱氢酶adh2与adh10c1比较酶的热稳定性、ph稳定性时，结果(图5)表明重组乙醇脱氢酶adh10c1在40-70℃之间酶活均保持在80％以上。而adh1与adh2在40℃开始下降，在60℃时，失去大部分酶活。在不同ph缓冲液中处理60min，再进行酶活的测定，结果(图6)表明adh10c1在ph7.0-10.5之间均比其它两种酶稳定性高，剩余酶活性在70％以上，而adh1在8.6-9.5时有较好的稳定性，ph10时酶活力急剧下降。adh2在ph9-10时，酶活下降比较迅速，剩余50％的酶活活性。由此表明，突变体adh10c1有较好的热稳定性以及ph稳定性。

技术特征：
1.一种耐热性提高的乙醇脱氢酶adh10c1，其特征在于，其氨基酸序列为seq id no.4。2.根据权利要求1所述的乙醇脱氢酶adh10c1，其特征在于，所述的序列seq id no.4的n端连接信号肽序列seq id no.3。3.编码权利要求1所述的乙醇脱氢酶adh10c1的基因序列。4.根据权利要求3所述的基因序列，其特征在于，该基因序列为seq id no.5或与seq id no.5具有90％以上同一性的序列。5.一种包括权利要求3-4任一项所述的基因序列的重组载体。6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述的载体是质粒、噬菌体和病毒中的一种。7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于，所述的载体是ppic9质粒。8.包括权利要求5-7任一项所述重组载体的细胞。9.根据权利要求8所述的细胞，其特征在于，为工程菌。10.根据权利要求9所述的细胞，其特征在于，为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。11.一种乙醇脱氢酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)用权利要求5-7任一项所述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；(2)培养重组菌株，诱导重组蛋白酶表达；(3)回收并纯化乙醇脱氢酶adh10c1。12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述的宿主细胞为毕赤酵母菌、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞。13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述的宿主细胞为毕赤酵母。14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述的宿主细胞为毕赤酵母gs115。15.权利要求1所述的乙醇脱氢酶adh10c1在制备解酒饮品中的应用。

技术总结
本发明涉及一种耐热性提高的乙醇脱氢酶ADH10C1及其编码基因和应用。乙醇脱氢酶ADH10C1是由鲁氏接合酵母CBS732乙醇脱氢酶ADH10序列SEQ ID NO.2突变获得，其突变位点是G201C，G207C，P52C和E56C。该突变体在70℃高温下保持5min仍维持80％酶活，而ADH10在60℃下5min仅能维持60％的酶活；该突变体最适pH为8.5，在pH7.5-10.5都有较高的酶活性，pH稳定性好；该突变体具有良好的热稳定性和蛋白酶抗性。本发明扩大了乙醇脱氢酶基因的资源，也为乙醇代谢过程中乙醇转化为乙醛提供了优良的乙醇脱氢酶，在制作解酒饮品方面具有潜在的应用价值。用价值。用价值。


技术研发人员：吴培均 霍明月 罗建杰 李富伟
受保护的技术使用者：内蒙古科为博生物科技有限公司
技术研发日：2023.03.24
技术公布日：2023/8/5