低分子量海参多糖肺靶向微球及其制备方法和抗凝血应用与流程

1.本发明属于海洋生物资源开发利用领域，具体涉及一种低分子量海参多糖肺靶向微球的制备方法及在血栓治疗中的应用。


背景技术：

2.血栓及其引起的血管栓塞症仍然是现代危害生命健康的主要风险因素之一，其造成的心肌梗死、心脏血流异常、脑卒中、下肢动脉栓塞、下肢动脉血栓形成、下肢深静脉血栓形成、肺栓塞等经常伴随着动脉粥样硬化、炎症、肿瘤等病症给患者带来极大的生命威胁。其中肺动脉栓塞(pulmonary embolism,pe)作为仅次于恶性肿瘤及心肌梗死的人类第三大死亡原因,在美国每年有50万新发病例,其病死率高达10％，国内虽然尚无明确的病学资料，但大量心肺血管疾病报道中通常也并发肺栓塞，而肺栓塞中最常见的栓子就下肢及盆骨来源的静脉血栓，通过循环到肺部引起栓塞。
3.目前针对肺栓塞的治疗主要有溶栓及抗凝血治疗两种方式。其中常用的溶栓药物有链激酶(streptokinase,sk)、尿激酶(urokinase,vk)或阿替普酶(rt-pa)。链激酶具有抗原性，可能引起严重的过敏反应；而尿激酶不仅降解血栓中的纤维蛋白，同时降解血液中的纤维蛋白原和凝血酶等凝血因子使出血的风险大大增加；阿普替酶虽然出血风险较小，但也存在再通率低、颅内出血风险及半衰期短需要持续静注等问题。此外抗凝血治疗在对抗肺栓塞中是非常有效及重要的。传统的抗凝血药物普通肝素(ufh)、低分子量肝素(lmwh)抗凝强度高，速度快，目前广泛应用于血栓患者的临床治疗，但肝素的起效依赖于血浆中抗凝血酶的表达，易引起出血，且肝素可能引起的血小板减少症(hit)及骨质疏松尚未有好的解决办法；维生素k拮抗剂(华法林)起效慢，同时抑制半衰期相对更短的两个依赖维生素k的抗凝蛋白，即蛋白c(半衰期8h)和蛋白s(半衰期60h)，在达到有效抗凝之前体内可出现一过性高凝状态。而利伐沙班等新型抗凝药物不依赖血浆中的抗凝血酶而直接抑制fxa或凝血酶，且起效迅速，但其并发症发生率远高于预期。上述的血栓治疗药物通常并不能集中作用于局部的血栓栓塞部位，在使用过程中的用量等需要非常精准的把控，以避免非血栓部位由于凝血系统、纤溶系统的失衡造成的大量失血。因此开发高抗凝活性、低出血风险的新型抗凝活性成分以及针对如肺血栓栓塞的抗凝活性成分靶向递送系统具有巨大的实际意义，能够减少全身出血的风险，减少所用药物的剂量，同时增强肺血栓栓塞治疗的效果，目前现有技术中尚未有相关内容发表。


技术实现要素：

4.为了解决制备具有抗凝血效果，且能够靶向肺部血栓栓塞部位的海参多糖微球的问题，在第一方面上，根据本技术的一些实施例的低分子量海参多糖肺靶向微球的制备方法，包括
5.s1.将α-淀粉酶及果胶酶加入海参酸性粘多糖溶液，在超声作用下使海参酸性粘多糖溶液酶催化降解，获得酶解液；
6.s2.将所述酶解液离心过滤，再通过截留分子量大小为5000～8000da的陶瓷膜，获得低分子海参酸性粘多糖溶液；
7.s3.将溶液百分比浓度是15～20％的所述低分子海参酸性粘多糖溶液加入南极磷虾油，搅拌均匀，再加入戊二醛进行固化，洗涤后进行真空干燥，获得低分子海参酸性粘多糖微球。
8.根据本技术的一些实施例的低分子量海参多糖肺靶向微球的制备方法，所述步骤s1中的α-淀粉酶与果胶酶比例为1～3：1，酶底比为3～4％，酶解温度为30～60℃，酶解时间为3～5h。
9.根据本技术的一些实施例的低分子量海参多糖肺靶向微球的制备方法，所述步骤s1中的超声功率为150～200w，超声作用时间为60～100min。
10.根据本技术的一些实施例的低分子量海参多糖肺靶向微球的制备方法，其特征在于，所述步骤s3中的所述低分子海参酸性粘多糖溶液与所述南极磷虾油的体积比为4～5:1，所述戊二醛与海参酸性粘多糖溶液及南极磷虾油的混合溶液的体积百分比为0.2～0.5％。
11.根据本技术的一些实施例的低分子量海参多糖肺靶向微球的制备方法，所述步骤s3中的搅拌的速度为1500～2500r/min，反应温度为40～50℃，搅拌时间为60～120min，所述固化时间为15～30min，
12.根据本技术的一些实施例的低分子量海参多糖肺靶向微球的制备方法，所述洗涤是使用异丙醇洗涤2～3次；
13.根据本技术的一些实施例的低分子量海参多糖肺靶向微球的制备方法，所述步骤s3中制备的低分子海参多糖微球粒径范围为2～10微米。
14.根据本技术的一些实施例的低分子量海参多糖肺靶向微球的制备方法，其特征在于，制备所述步骤s1的所述海参酸性粘多糖溶液的方法，包括
15.s10.制备海参粗多糖；
16.s101.将干海参经过斩碎、匀浆、酶解、离心沉淀获得第一上清液；
17.s102.向所述第一上清液中加入95％的乙醇进行醇沉，再离心、沉淀洗涤、喷雾干燥后，获得海参粗多糖；
18.s11.将所述海参粗多糖用nacl溶液溶解，再通过deae-纤维素阴离子交换柱分离纯化，获得所述海参酸性粘多糖溶液。
19.根据本技术的一些实施例的低分子量海参多糖肺靶向微球的制备方法，优选地，所述步骤s101中的所述干海参为仿刺参、梅花参、米刺参、球参、玉足海参中的一种或任意种组合；
20.根据本技术的一些实施例的低分子量海参多糖肺靶向微球的制备方法，所述步骤s101的中所述干海参为仿刺参、米刺参中的一种或组合；
21.根据本技术的一些实施例的低分子量海参多糖肺靶向微球的制备方法，所述步骤s101的中酶解所采用的复合蛋白酶的质量配比为碱性蛋白酶：木瓜蛋白酶：胰蛋白酶＝2～5：1～3：1～3；
22.根据本技术的一些实施例的低分子量海参多糖肺靶向微球的制备方法，所述步骤s101的中复合蛋白酶与所述干海参的质量比为1：10～15；
23.根据本技术的一些实施例的低分子量海参多糖肺靶向微球的制备方法，所述步骤s101的中酶解反应温度为50℃～60℃，酶解ph为8.0～9.0，酶解时间为3～6h；
24.根据本技术的一些实施例的低分子量海参多糖肺靶向微球的制备方法，所述步骤s102中的醇沉的静置温度为4～8℃，静置时间为24～48h；
25.根据本技术的一些实施例的低分子量海参多糖肺靶向微球的制备方法，所述步骤s102中的沉淀洗涤所使用的乙醇是体积浓度大于75％的乙醇；
26.根据本技术的一些实施例的低分子量海参多糖肺靶向微球的制备方法，所述步骤s11中的nacl溶液浓度为2～4mol/l；
27.根据本技术的一些实施例的低分子量海参多糖肺靶向微球的制备方法，所述步骤s11中的deae-纤维素阴离子交换柱通过0.5、1.0、1.4、1.8、2.5mol/l的nacl磷酸缓冲溶液进行梯度洗脱，收集1.4及1.8mol/l洗脱组分得所述海参酸性粘多糖溶液。
28.在第二方面上根据本技术的一些实施例的靶向肺部血栓栓塞部位的低分子量海参多糖肺靶向微球，由任一项所述制备方法所得。
29.在第三方面上根据本技术的一些实施例的任一项所述制备方法制备的低分子量海参多糖肺靶向微球在制备抗凝血器械中的应用。
30.本发明的有益效果：
31.第一方面，本发明采用超声辅助酶解技术降解大分子海参多糖，降解过程及降解分子的分子量易于控制，反应条件较为温和，不需要加入大量的反应试剂。相比较于化学降解分子量分布宽、均一性差的缺点有了较大的改善。
32.第二方面，本发明所述超声辅助酶解技术采用复合酶在超声作用下使溶液体系产生高频振荡作用,使酶和底物的接触频率大大增加,提高了海参多糖的降解效果，且最终获得的低分子海参多糖中硫酸根含量没有明显降低，最大程度地保留了抗凝血活性，且降低了引起出血的风险。
33.第三方面，本发明使用南极磷虾油与低分子海参多糖以乳化交联法制备的油水微球颗粒，分散性良好，粒径均一性高，微球圆整光滑。
34.第四方面，本发明微球颗粒相较于其他组织器官，对肺部靶向性强，低分子海参多糖微球在静脉注射后被肺毛细血管床机械滤过而浓集于肺部血栓栓塞部位，发挥减少血小板聚集、对凝血酶、fxa及fxiii的活性抑制作用，从而达到缓解肺栓塞的目的。靶向作用的存在减少了其他非血栓部位的药物输送，因此不仅提高了肺血栓栓塞的缓解速度和效果，也大大减少了全身其他部位出血的概率。
35.由上述，本发明提供的低分子海参多糖微球制备方法所制备的海参多糖微球具有显著的抗凝血和抗血栓活性，对肺血栓栓塞有明显的缓解作用，出血副作用低。且制作方法简单易于操作，适用于工业化制备场景，在未来血栓性疾病的预防与治疗中具有广阔的应用前景。
附图说明
36.图1表示各实验组的aptt值。
具体实施方式
37.下面将结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，所描述的实施例仅为本发明的可能的技术实现，并非全部实现可能。本领域技术人员完全可以结合本发明的实施例，在没有进行创造性劳动的情况下得到其他实施例，而这些实施例也在本发明的保护范围之内。
38.近年来，多种海参来源的酸性粘多糖由于其抗凝血活性越来越受到血栓研究者的关注。相比较于陆地脊椎动物粘多糖，海参多糖具有更高的重复序列规律性以及更高的硫酸根含量，这些都被验证与多糖的抗凝血活性有极大的关系。多项研究表明，海参多糖通过作用于内源凝血途径，抑制凝血酶、fxa的激活及fxiii的活性来减少不溶性纤维蛋白的生产，并且通过抑制血栓素txa2的生成和调控vwf含量减少血小板的聚集。发明人发现，不同海参种来源的海参多糖由于分子量大小、岩藻糖支链的分布、硫酸根取代的数量与部位的细微差异化导致了不同的凝血酶及fxa抑制活性。
39.发明人进一步发现分子量小于80kda的较低分子量的海参多糖在侧链硫酸酯基没有较大变化的情况下，相较于大分子海参多糖在抗凝血活性上虽然有少许降低，但出血风险大大减少，在未来血栓性疾病的治疗及预防中有极大的应用潜力。
40.本发明的低分子量海参多糖肺靶向微球的制备方法，其经过下列工艺步骤：
41.步骤1.将干海参经过斩碎、匀浆、酶解、离心沉淀获得第一上清液。其中，优选地，步骤1所述干海参为仿刺参、梅花参、米刺参、球参、玉足海参，更优选地，干海参为仿刺参、米刺参。其中，酶解所使用的复合蛋白酶是质量比为碱性蛋白酶：木瓜蛋白酶：胰蛋白酶＝2～5：1～3：1～3的复合蛋白酶，复合蛋白酶与投入海参原料(干海参)的质量比为1：10～15。优选地，酶解反应温度为50℃～60℃，酶解ph为8.0～9.0，酶解时间为3～6h。
42.步骤2.在第一上清液中加入95％的乙醇进行醇沉、离心、沉淀洗涤、喷雾干燥后获得海参粗多糖。其中，醇沉的静置温度为4～8℃，静置时间为24～48h。采用体积浓度大于75％的乙醇进行沉淀洗涤。
43.步骤3.先将海参粗多糖用nacl溶液溶解，再通过deae-纤维素阴离子交换柱分离纯化获得海参酸性粘多糖。其中，所用的溶解海参粗多糖的nacl溶液浓度为2～4mol/l，采用0.5、1.0、1.4、1.8、2.5mol/l的nacl磷酸缓冲溶液(0.05mol/l na2hpo4和nah2po4，ph7.8)进行梯度洗脱，收集1.4及1.8mol/l的洗脱组分为海参酸性粘多糖溶液。
44.步骤4.在所述海参酸性粘多糖溶液中加入α-淀粉酶及果胶酶在超声作用下进行酶催化降解，酶解液在离心过滤之后通过陶瓷膜超滤脱盐浓缩获得低分子海参酸性粘多糖溶液。其中，所使用的陶瓷膜截留分子量大小为5000～8000da。所使用的α-淀粉酶与果胶酶比例为1～3：1，酶底比为3～4％，酶解温度为30～60℃，酶解时间为3～5h。所采用的超声功率为150～200w，作用时间为60～100min。
45.步骤5.所述低分子海参酸性粘多糖溶液调整浓度后，将其缓慢加入搅拌中的南极磷虾油，再加入戊二醛进行固化，使用异丙醇洗涤2～3次后进行真空干燥获得低分子海参酸性粘多糖微球。其中，低分子海参酸性粘多糖溶液浓度调整为15～20％，所述浓度是混合溶液的体积百分比。
46.其中，低分子海参酸性粘多糖溶液与南极磷虾油的体积比为4～5:1。搅拌速度为1500～2500r/min，反应温度为40～50℃，乳化搅拌时间为60～120min。添加的戊二醛与混
合溶液的体积百分比为0.2～0.5％，固化时间为15～30min。所制备的低分子海参多糖微球粒径范围为2～10微米。
47.本发明上述低分子量海参多糖肺靶向微球的制备方法，从海参中通过斩碎、酶解、醇沉、阴离子交换柱纯化等步骤获得海参多糖后，通过超声辅助酶解、超滤浓缩获得低分子量海参多糖，最后通过乳化交联法制得具有肺部靶向性的低分子量海参多糖微球。所制备的海参多糖微球通过静脉注射后具有极高的肺部靶向性，能够有效的缓解肺部血栓栓塞，同时大大降低了全身其他部位出血的不良作用，提高了血栓治疗的安全性，在未来血栓性疾病的预防与治疗中有着非常广阔的应用前景。
48.实施例1：一种低分子量海参多糖肺靶向微球的制备方法，具体包括如下步骤：
49.步骤101：将1kg仿刺参斩碎加10倍体积的双蒸水后匀浆，加入碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶及胰蛋白酶各10g，调节ph至8.5，在50℃下进行酶解4小时。
50.步骤102：在上述酶解液中加入95％乙醇，在4℃条件下静置24小时，4000r/min离心10min舍弃上清液取沉淀，沉淀用90％及80％的乙醇各清洗一次，于烘干箱内50℃烘干4小时获得海参粗多糖约80g。
51.步骤103：步骤2所得海参粗多糖用3mol/l的nacl溶液充分溶解后，采用0.5、1.0、1.4、1.8、2.5mol/l的nacl磷酸盐缓冲溶液进行梯度洗脱，收集1.4及1.8mol/l的洗脱组分为海参酸性粘多糖溶液。其中，磷酸盐缓冲溶液的ph是7.8，由0.05mol/l的na2hpo4和nah2po4制备。
52.步骤104：步骤103获得的海参酸性粘多糖溶液中加入α-淀粉酶及果胶酶各5g，调节温度为40℃，150w功率超声作用下60min，酶催化降解时间4小时。所得酶解液经过截留分子量5000da的陶瓷膜超滤脱盐、浓缩处理，获得低分子量海参酸性粘多糖溶液。
53.步骤105：将步骤104中所述低分子量海参酸性粘多糖溶液调节浓度为20％，缓慢加入5倍体积的南极磷虾油中，乳化搅拌速度为2500r/min，温度为50℃，乳化时间120min。乳化完成后加入0.02％的戊二醛进行固化，随后使用异丙醇洗涤3次后通过真空干燥获得低分子海参酸性粘多糖微球(lmw-scpm)。
54.实施例2：一种低分子量海参多糖肺靶向微球的制备方法，具体包括如下步骤：
55.步骤101：将1kg仿刺参斩碎加12倍体积的双蒸水后匀浆，加入碱性蛋白酶20g，木瓜蛋白酶5g及胰蛋白酶5g，调节ph至9，在60℃下进行酶解6小时。
56.步骤102：在上述酶解液中加入95％乙醇，在6℃条件下静置36小时，3000r/min离心15min舍弃上清液取沉淀，沉淀用90％及80％的乙醇各清洗一次，于烘干箱内50℃烘干4小时获得海参粗多糖约85g。
57.步骤103：步骤2所得海参粗多糖用4mol/l的nacl溶液充分溶解后，采用0.5、1.0、1.4、1.8、2.5mol/l的nacl磷酸盐缓冲溶液进行梯度洗脱，收集1.4及1.8mol/l的洗脱组分为海参酸性粘多糖溶液。其中，磷酸盐缓冲溶液的ph是7.8，由0.05mol/l的na2hpo4和nah2po4制备。
58.步骤104：步骤103获得的海参酸性粘多糖溶液中加入α-淀粉酶及果胶酶各5g，调节温度为30℃，100w功率超声作用下60min，酶催化降解时间5小时。所得酶解液经过截留分子量6000da的陶瓷膜超滤脱盐、浓缩处理，获得低分子量海参酸性粘多糖溶液。
59.步骤105：将步骤104中所述低分子量海参酸性粘多糖溶液调节浓度为15％，缓慢
加入5倍体积的南极磷虾油中，乳化搅拌速度为2000r/min，温度为40℃，乳化时间120min。乳化完成后加入0.02％的戊二醛进行固化，随后使用异丙醇洗涤3次后通过真空干燥获得低分子海参酸性粘多糖微球(lmw-scpm)。
60.实施例3：一种低分子量海参多糖肺靶向微球的制备方法，具体包括如下步骤：
61.步骤101：将1kg仿刺参斩碎加15倍体积的双蒸水后匀浆，加入碱性蛋白酶10g，木瓜蛋白酶5g及胰蛋白酶15g，调节ph至8.0，在55℃下进行酶解3小时。
62.步骤102：在上述酶解液中加入95％乙醇，在4℃条件下静置24小时，4000r/min离心10min舍弃上清液取沉淀，沉淀用90％及80％的乙醇各清洗一次，于烘干箱内50℃烘干4小时获得海参粗多糖约77g。
63.步骤103：步骤2所得海参粗多糖用2mol/l的nacl溶液充分溶解后，采用0.5、1.0、1.4、1.8、2.5mol/l的nacl磷酸盐缓冲溶液进行梯度洗脱，收集1.4及1.8mol/l的洗脱组分为海参酸性粘多糖溶液。其中，磷酸盐缓冲溶液的ph是7.8，由0.05mol/l的na2hpo4和nah2po4制备。
64.步骤104：步骤103获得的海参酸性粘多糖溶液中加入α-淀粉酶2.5，果胶酶7.5g，调节温度为60℃，150w功率超声作用下60min，酶催化降解时间3小时。所得酶解液经过截留分子量8000da的陶瓷膜超滤脱盐、浓缩处理，获得低分子量海参酸性粘多糖溶液。
65.步骤105：将步骤104中所述低分子量海参酸性粘多糖溶液调节浓度为20％，缓慢加入4倍体积的南极磷虾油中，乳化搅拌速度为2000r/min，温度为45℃，乳化时间90min。乳化完成后加入0.02％的戊二醛进行固化，随后使用异丙醇洗涤3次后通过真空干燥获得低分子海参酸性粘多糖微球(lmw-scpm)。
66.实验例：
67.实验1：降解后海参多糖分子量检测
68.对超声酶解后获得的海参多糖溶液进行分子量检测。样品用流动相(0.1mol/l k2so4溶液)配成1mg/ml的溶液，经过0.22μm膜过滤后，采用高效凝胶过滤色谱法检测。利用葡聚糖标品(重均分子量6000、10000、50000、150000、270000da)的洗脱时间与重均分子量的关系绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品的重均分子量。结果如下表：
69.表1降解后的海参多糖分子量
[0070][0071]
由表1可以看到进行超声酶解后获得的海参多糖重均分子量相较于之前的粗制海参多糖有很大程度的降低，降解效果良好。
[0072]
实验:2：海参多糖微球的硫酸根含量
[0073]
将实施例中获得的海参酸性粘多糖溶液，低分子量海参酸性粘多糖溶液通过真空干燥获得海参酸性粘多糖粉末(scp)及低分子量海参酸性粘多糖粉末(lmw-scp)。与低分子海参酸性粘多糖微球(lmw-scpm)各取2mg加入安瓿瓶内，加入1ml 2mol/l三氟乙酸溶液，
110℃下反应8h后吹干，超纯水复溶后再吹干，反复3次后采用离子色谱法进行检测，以k2so4为标准溶液进样检测，并绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品硫酸根含量。结果如下表：
[0074]
表2海参多糖中硫酸根含量的变化
[0075][0076]
由表2可以看到经过超声辅助酶降解处理后获得的低分子海参酸性粘多糖以及微球化处理后的低分子海参酸性粘多糖微球的硫酸根含量与海参酸性粘多糖相比没有明显的下降。
[0077]
实验3：海参多糖微球的抗血小板聚集活性
[0078]
大鼠腹部动脉取血，1000r/min离心10min后去上层悬浊液为富血小板血浆。剩余血液3000r/min离心10min后，取上清液调节富血小板血浆血小板数约为5*108/ml。实验设置空白组，scp组(10μg/ml)，lmw-scp组(10μg/ml)，lmw-scpm组(10μg/ml)，阳性组(标准肝素4μg/ml)，1ml富血小板血浆中加入分别加入100μl scp，lmw-scp，lmw-scpm及标准肝素，37℃孵育5min中加入胶原(终浓度10μg/ml)和肾上腺素(终浓度3μg/ml)诱导血小板聚集，检测5min内的血小板最大聚集率。结果如下表：
[0079]
表3不同实验组的血小板聚集率
[0080][0081]
由表3结果表明海参多糖、低分子海参多糖、低分子海参多糖微球的抗血小板聚集活性虽然低于标准肝素，但依然表现出了足够的缓解血小板聚集的效果，特别是经过微球化处理的低分子海参多糖的抗血小板聚集活性有了一定的提升。
[0082]
实验4：海参多糖微球的体外抗凝血效果
[0083]
大鼠静脉取血，置含有1/10体积0.109mol/l枸橼酸钠抗凝液的塑料管或硅化玻璃管中，轻轻颠倒混匀.3000r/min离心15分钟，收集上层液3000r/min离心15min取上清液进行凝血活性实验。取90μl血浆分别加入10μl scp，lmw-scp，lmw-scpm及阳性对照的标准肝素，使最终浓度达到4μg/ml，37℃孵育2min。加入25μl aptt检测试剂后37℃孵育5min，加入37℃预温的0.025m cacl2溶液混匀，用全自动凝血分析仪记录凝血时间。各实验组的aptt值如图1所示。由图1可以表明海参多糖、低分子海参多糖、低分子海参多糖微球都表现出了显著的aptt延长效果，具备理想的抗凝血活性。
[0084]
实验5：海参多糖微球的肺部靶向效率
[0085]
将36只大鼠随机分成2组，每组18只，其中1组为lmw-scp注射液组，1组为lmw-scpm组。给药前12h禁食，按4mg/kg的剂量分别尾静脉注射lmw-scp注射液及lmw-scpm，于给药后0.5，2，4，8，12，24h(每个时间点6只大鼠，每组各3只)断头处死大鼠，放尽血液后，得心、肝、脾、肺、肾样品，然后加入2倍量生理盐水，使用组织匀浆器把上述样品制成匀浆。精密吸取组织匀浆液200μl于1.5ml离心管中，加入600μl甲醇，涡旋震荡2min，于10 000r/min离心5min，精密吸取上清液500μl，氮气吹干，200μl甲醇复溶，涡旋混合1min，取20μl进样，hplc测定海参多糖含量。根据gupta的方法用靶向效率(targeting efficiency，te)，来评价lmw-scpm的靶向性。te＝(auc)靶/(auc)非靶。结果如下表所示：
[0086]
表4lmw-scp和lmw-scpm在不同组织的auc和靶向效率
[0087][0088]
根据te值大于1表示药物制剂对靶器官比非靶器官有选择性，te值越大，选择性越强判断，从表4可以看到，低分子量海参酸性粘多糖微球具有很强的肺部趋向性。
[0089]
实验6：海参多糖微球的大鼠肺栓塞治疗效果
[0090]
将60只小鼠随机均分为6组，即空白对照组、模型组、scp组、lmw-scp组、lmw-scpm组和标准肝素组，每组10只。除空白对照组外的各组小鼠尾静脉注射胶原(1.5mg/kg)和肾上腺素(0.5mg/kg)，构建小鼠肺栓塞模型，空白对照组小鼠尾静脉注射等体积生理盐水。2min后scp组、lmw-scp组、lmw-scpm组和标准肝素组各组小鼠分别尾静脉注射药品，剂量为0.3mg/kg，观察急性肺栓塞小鼠在15min内的存活情况，记录肺栓塞小鼠的存活时间以及存活数量，并计算存活率。结果如下表：
[0091]
表5急性肺栓塞小鼠存活率
[0092][0093][0094]
表5结果表明经过微球化处理的低分子量海参酸性粘多糖对小鼠肺部血栓栓塞缓解效果相较于标准肝素以及未经过微球化处理的海参酸性粘多糖都更为显著，模型组中小鼠肺部毛细血管中明显存在的血栓在lmw-scpm组中得到了极大的改善，同时在实验进行过
程中发现海参多糖微球的出血率也低于scp组，更是远远低于标准肝素组。
[0095]
通过上述实验结果可以看到本发明提供的低分子量海参酸性粘多糖微球的制备方法所制备的海参多糖微球不仅可以有效缓解肺部血栓栓塞，对整体静脉血栓也有良好的抑制效果，并且摄入后全身出血的概率低，是一种潜在的优质血栓防治成分。
[0096]
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有衍生，均应认为是本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种低分子量海参多糖肺靶向微球的制备方法，其特征在于，包括s1.将α-淀粉酶及果胶酶加入海参酸性粘多糖溶液，在超声作用下使海参酸性粘多糖溶液酶催化降解，获得酶解液；s2.将所述酶解液离心过滤，再通过截留分子量大小为5000～8000da的陶瓷膜，获得低分子海参酸性粘多糖溶液；s3.将溶液百分比浓度是15～20％的所述低分子海参酸性粘多糖溶液加入南极磷虾油，搅拌均匀，再加入戊二醛进行固化，洗涤后进行真空干燥，获得低分子海参酸性粘多糖微球。2.根据权利要求1所述的低分子量海参多糖肺靶向微球的制备方法，其特征在于，所述步骤s1中的α-淀粉酶与果胶酶比例为1～3：1，酶底比为3～4％，酶解温度为30～60℃，酶解时间为3～5h。3.根据权利要求2所述的低分子量海参多糖肺靶向微球的制备方法，其特征在于，所述步骤s1中的超声功率为150～200w，超声作用时间为60～100min。4.根据权利要求1～3中任一项所述的低分子量海参多糖肺靶向微球的制备方法，其特征在于，所述步骤s3中的所述低分子海参酸性粘多糖溶液与所述南极磷虾油的体积比为4～5:1，所述戊二醛与海参酸性粘多糖溶液及南极磷虾油的混合溶液的体积百分比为0.2～0.5％。5.根据权利要求4所述的低分子量海参多糖肺靶向微球的制备方法，其特征在于，所述步骤s3中的搅拌的速度为1500～2500r/min，反应温度为40～50℃，搅拌时间为60～120min，所述固化时间为15～30min。6.根据权利要求4所述的低分子量海参多糖肺靶向微球的制备方法，其特征在于，所述洗涤是使用异丙醇洗涤2～3次；优选地，所述步骤s3中制备的低分子海参多糖微球粒径范围为2～10微米。7.根据权利要求4～6中任一项所述的低分子量海参多糖肺靶向微球的制备方法，其特征在于，制备所述步骤s1的所述海参酸性粘多糖溶液的方法，包括s10.制备海参粗多糖；s101.将干海参经过斩碎、匀浆、酶解、离心沉淀获得第一上清液；s102.向所述第一上清液中加入95％的乙醇进行醇沉，再离心、沉淀洗涤、喷雾干燥后，获得海参粗多糖；s11.将所述海参粗多糖用nacl溶液溶解，再通过deae-纤维素阴离子交换柱分离纯化，获得所述海参酸性粘多糖溶液。8.根据权利要求7所述的低分子量海参多糖肺靶向微球的制备方法，其特征在于，优选地，所述步骤s101中的所述干海参为仿刺参、梅花参、米刺参、球参、玉足海参中的一种或任意种组合；更优选地，所述步骤s101的中所述干海参为仿刺参、米刺参中的一种或组合；优选地，所述步骤s101的中酶解所采用的复合蛋白酶的质量配比为碱性蛋白酶：木瓜蛋白酶：胰蛋白酶＝2～5：1～3：1～3；优选地，所述步骤s101的中复合蛋白酶与所述干海参的质量比为1：10～15；优选地，所述步骤s101的中酶解反应温度为50℃～60℃，酶解ph为8.0～9.0，酶解时间
为3～6h；优选地，所述步骤s102中的醇沉的静置温度为4～8℃，静置时间为24～48h；优选地，所述步骤s102中的沉淀洗涤所使用的乙醇是体积浓度大于75％的乙醇；优选地，所述步骤s11中的nacl溶液浓度为2～4mol/l；优选地，所述步骤s11中的deae-纤维素阴离子交换柱通过0.5、1.0、1.4、1.8、2.5mol/l的nacl磷酸缓冲溶液进行梯度洗脱，收集1.4及1.8mol/l洗脱组分得所述海参酸性粘多糖溶液。9.一种靶向肺部血栓栓塞部位的低分子量海参多糖肺靶向微球，其特征在于，由权利要求1-8任一项所述制备方法所得。10.一种权利要求1-8任一项所述制备方法制备的低分子量海参多糖肺靶向微球在制备抗凝血器械中的应用。

技术总结
低分子量海参多糖肺靶向微球及其制备方法和抗凝血应用，属于海洋生物资源开发利用领域，为了解决制备具有抗凝血效果，且能够靶向肺部血栓栓塞部位的海参多糖微球的问题，要点是将α-淀粉酶及果胶酶加入海参酸性粘多糖溶液，在超声作用下使海参酸性粘多糖溶液酶催化降解，获得酶解液；将所述酶解液离心过滤，再通过截留分子量大小为5000～8000Da的陶瓷膜，获得低分子海参酸性粘多糖溶液；将溶液百分比浓度是15～20％的所述低分子海参酸性粘多糖溶液加入南极磷虾油，搅拌均匀，再加入戊二醛进行固化，洗涤后进行真空干燥，获得低分子海参酸性粘多糖微球，效果是具有显著的抗凝血和抗血栓活性，对肺血栓栓塞有明显的缓解作用，出血副作用低。血副作用低。血副作用低。


技术研发人员：高威 张延胜 王祖哲 包卫洋
受保护的技术使用者：大连深蓝肽科技研发有限公司
技术研发日：2023.03.02
技术公布日：2023/8/5