一种测定血浆中氯氮平与喹硫平浓度的方法与流程

1.本技术涉及临床血药浓度监测的技术领域，尤其是涉及一种测定血浆中氯氮平与喹硫平浓度的方法。


背景技术：

2.随着生活节奏的不断加快，往往伴随人们的生活压力也随之上升。我国患有精神类疾病的人数也越来越多。精神疾病主要体现在病人思维与情感等方面的障碍，其病程较长，治疗较为缓慢，严重影响了患者的生活质量。由于精神类药物在体内吸收、分布和代谢与个体差异密切相关，为保障治疗效果和用药安全，对服用精神类药物的人群进行药物浓度监测具有十分重要的意义。
3.氯氮平(clozapine)是一种非经典抗精神病药，对精神病阳性和阴性症状均有良好的疗效，较少引起锥体外系反应，但是易引发粒细胞缺乏症、体质量增加和血糖升高等。喹硫平(quetiapine)是一种新型非典型抗精神病药，其结构式与氯氮平相近，属苯二氮类抗精神病药，主要作用于5-羟色胺(ht)2、d1、d2、及d4受体，对精神分裂症疗效较好，无明显嗜睡、流涎、抗胆碱能作用，无锥体外系反应、粒细胞减少等不良反应，在临床上得到广泛应用。
4.目前临床上常用的检测方法有高效液相色谱法(hplc)、放射免疫法(ria)、气相色谱法(gc)、高效液相色谱-串联质谱法(lc-ms/ms)等。其中，高效液相色谱法(hplc)通过合适的色谱体系将待测物分离和检测，具有较高的特异性、准确度等特点，同时仪器价格相对较低，操作简单，易上手，适合在医院及检测机构开展。因此，高效液相色谱法应用更普遍。应用高效液相色谱法检测血药浓度时，需要对血浆进行前处理，以对血浆中的干扰物质进行去除。相关文献中，多涉及固相萃取法，因其特异性高，并且对干扰物质能够较好的除尽，但同时固相萃取也存在成本较高，操作步骤复杂，处理时间较长等方面的不足。而相关报道中的液相萃取法，其操作步骤繁琐，且血清内源性干扰物质不易除尽，使得液相萃取法的应用得到了限制。
5.相关技术中液相色谱技术主要还是采用乙醚进行液液萃取或者使用固相萃取的技术进行样本前处理。乙醚用于萃取液用量大，而乙醚作为国家管制的二类易制毒化学品，其生产、经营、购买、运输和出口都实行严格的监督和管理，故很难实现大规模生产和销售。另一方面，使用固相萃取技术成本比液液萃取技术高很多，操作繁琐，前处理时间长，对操作人员的技术要求比较高，会给血药浓度监测带来昂贵的价格。因此，本技术旨在开发一种使用试剂更普遍、方法通用性高、成本更低、操作简单并且能够准确测定血浆中氯氮平和喹硫平浓度的液相色谱方法。


技术实现要素：

6.为解决上述现有技术中的问题，本技术的目的在于提供一种测定血浆中氯氮平和喹硫平浓度的方法。
7.本技术的目的是提供一种测定血浆中氯氮平与喹硫平浓度的方法，采用如下技术方案：一种测定血浆中氯氮平与喹硫平浓度的方法，其包括如下步骤：(1)将经过抗凝的全血样本离心，取上清液得到血浆；(2)前处理步骤向校准品、质控品及血浆样品中分别加入内标工作液并涡旋混匀，然后加入一定量的氢氧化钠溶液，涡旋混匀后，加入一定体积的二氯甲烷/乙酸乙酯的混合萃取液，充分涡旋混匀，离心后，取上清液，经氮吹干，用甲醇水溶液复溶，得上机液，待测；(3)通过高效液相色谱仪对步骤(2)制备得到的上机液进行上机检测，并且对其检测结果进行分析；其中，液相色谱条件为：色谱柱：c18,2.6μm,2.1mm x 100mm柱温：40℃；进样器温度：9℃；进样量：10μl；检测波长：254nm；流动相：流动相a为0.1％的甲酸水溶液；流动相b为纯甲醇；色谱梯度如下：色谱梯度如下：保留时间：氯氮平5.2min，喹硫平6.3min。
8.通过采用上述技术方案，通过对血浆样品的前处理进行设计，选择二氯甲烷和乙酸乙酯的混合液为萃取液，可以提高对氯氮平和喹硫平的萃取率，同时采用甲醇水复溶，可以提高检测物的溶解率，使其样品浓度均一；然后对其色谱条件进行实验探究，综合两者的优势，提高了同时检测氯氮平和喹硫平的准确度；本技术的检测方法的所需进样量较少，但可以同时检测氯氮平和喹硫平的浓度，并且其检测结果较准确；其中，0.1％的甲酸水溶液中0.1％为体积分数。
9.作为优选：所述内标物为9-羟基利培酮，将其使用甲醇稀释成27μg/ml，作为内标工作液。
10.通过采用上述技术方案，选择9-羟基利培酮作为内标物，可以实现同时对氯氮平
和喹硫平的浓度准确定量。
11.作为优选：所述血浆中氯氮平与喹硫平浓度的检测方法还包括标准曲线配制，其包括如下内容：分别称量一定质量的氯氮平、喹硫平，使用甲醇分别配制成高浓度的2.5mg/ml氯氮平溶液与2mg/ml的喹硫平溶液；稀释配制成混合标准品溶液，氯氮平50μg/ml、喹硫平40μg/ml；使用7.5％bsa溶液稀释混合标准品溶液替代基质校准品和质控品，其中，氯氮平校准品浓度范围为100-800ng/ml，质控品为150ng/ml、400ng/ml、640ng/ml；氯氮平校准品浓度范围为80-640ng/ml，质控品为120ng/ml、320ng/ml、512ng/ml。
12.作为优选：所述前处理步骤具体操作如下：分别取400μl校准品、质控品和待测血浆样本于新的离心管中，分别加入50μl的内标工作液并涡旋混匀后，加入100μl 1m的氢氧化钠溶液，充分涡旋后，再加入1ml二氯甲烷/乙酸乙酯混合萃取液(2:8)振荡涡旋10min后，于离心机中离心；然后取上清液850μl至新的离心管中，经氮吹后，加入200μl的20％甲醇水溶液复溶，涡旋振荡，得到上机液。
13.通过采用上述技术方案，通过对血浆样品进行前处理，可以大大减少样品中的干扰物质，提高检测准确度。
14.作为优选：所述混合萃取液为二氯甲烷/正己烷/乙酸乙酯的混合液，其中，二氯甲烷、正己烷和乙酸乙酯的体积比为1:1:8。
15.通过采用上述技术方案，通过在萃取液中加入一定量的正己烷，可以同时优化氯氮平和喹硫平的准确度，从而提高其检测的准确度；但正己烷不宜添加过多，添加过多时，反而不利于其准确度。
16.作为优选：所述上机液经过0.22μm膜过滤后，再进行上机检测。
17.通过采用上述技术方案，通过膜过滤，可以降低血浆中的杂质干扰，提高精密度，从而提高检测结果的稳定性。
18.作为优选：所述甲醇水溶液中甲醇的浓度为20％。
19.通过采用上述技术方案，甲醇水中甲醇的浓度降低，其不利于复溶效果。
20.综上所述，本技术包括以下至少一种有益技术效果：1、通过对血浆样品的前处理进行设计，选择二氯甲烷和乙酸乙酯的混合液为萃取液，可以提高对氯氮平和喹硫平的萃取率，同时采用甲醇水复溶，可以提高检测物的溶解率，使其样品浓度均一；然后对其色谱条件进行实验探究，综合两者的优势，提高了同时检测氯氮平和喹硫平的准确度；并且选择9-羟基利培酮作为内标物，可以实现同时对氯氮平和喹硫平的浓度准确定量。
21.2、应用本技术的检测方法检测血浆中的氯氮平，针对150ng/ml浓度的氯氮平血浆样本，其准确度均在103.1-104.4％之间，cv均在0.4％及以下；针对400ng/ml浓度的氯氮平血浆样本，其准确度均在101.7-103.7％之间，cv均在0.3％及以下；针对640ng/ml浓度的氯氮平血浆样本，其准确度均在100.2-101.2％之间，cv均在0.3％及以下；说明本技术的检测方法能够准确的检测血液中较低和较高浓度的氯氮平(150-640ng/ml)，并且检测过程稳定，数据可靠。
22.3、应用本技术的检测方法检测血浆中的喹硫平，针对120ng/ml浓度的喹硫平血浆
样本，其准确度均在95.3-104.1％之间，cv均在0.7％以下；针对320ng/ml浓度的喹硫平血浆样本，其准确度均在101.2-102.2％之间，cv均在0.4％以下；针对512ng/ml浓度的喹硫平血浆样本，其准确度均在100.4-101.7％之间，cv均在0.5％以下；说明本技术的检测方法能够准确的检测血液中较低和较高浓度的喹硫平(120-512ng/ml)。
附图说明
23.图1为氯氮平标准曲线。
24.图2为喹硫平标准曲线。
25.图3为氯氮平和喹硫平出峰位置。
26.图4为双空白bsa样本。
27.图5为单空白bsa样本。
28.图6为单空白血浆样本。
29.图7为标准品在血浆样本中出峰情况。
具体实施方式
30.以下结合具体内容对本技术作进一步详细说明。
31.原料及设备本技术中所用的高效液相色谱仪为：waters acquity uplc h-class plus uv检测器，色谱柱为thermo accucoretm c18,2.6μm,2.1mm
×
100mm；本技术所用的试剂均为普通市售试剂，纯度≥98％。实施例
32.实施例1一种血浆中氯氮平与喹硫平浓度的检测方法，其包括如下步骤：(1)将经过抗凝的全血样本离心，取上清液得到血浆；(2)前处理步骤分别取400μl校准品、质控品和待测血浆样本于新的离心管中，分别加入50μl的内标工作液并涡旋混匀5min后，加入100μl 1m的氢氧化钠溶液，充分涡旋5min后，再加入1ml二氯甲烷/乙酸乙酯混合萃取液(2:8)振荡涡旋10min后，于离心机中离心，离心转速为13,000rpm，离心时间为10min；然后取上清液850μl至新的离心管中，经氮吹后，加入200μl的20％甲醇水溶液复溶，涡旋振荡10min，得到上机液；(3)标准曲线的配制分别称量一定质量的氯氮平、喹硫平标准品，使用甲醇分别配制成高浓度的2.5mg/ml氯氮平溶液与2mg/ml的喹硫平溶液；稀释配制成混合标准品溶液，氯氮平50μg/ml、喹硫平40μg/ml；使用7.5％bsa溶液稀释混合标准品溶液配制成替代基质校准品和质控品，其中，氯氮平校准品浓度范围为100-800ng/ml，质控品为150ng/ml、400ng/ml、640ng/ml；氯氮平校准品浓度范围为80-640ng/ml，质控品为120ng/ml、320ng/ml、512ng/ml；内标物为9-羟基利培酮，使用甲醇配制成浓度为27μg/ml内标工作液；氯氮平标准曲线测定：配制浓度为100、200、300、450、600、800ng/ml系列替代基质溶液，按照步骤(2)进
行前处理，以氯氮平浓度(ng/ml)为横坐标，以氯氮平峰面积与9-羟基利培酮峰面积比值为纵坐标，绘制标准工作曲线，得到线性回归方程：y＝(4.88e+1)x-2.25e+10，相关系数r2为0.9993；同样，以上述方法测定喹硫平的标准曲线，配制浓度为80、160、240、360、480、640ng/ml系列替代基质溶液，按照步骤(2)进行前处理，以喹硫平浓度(ng/ml)为横坐标，以喹硫平峰面积与9-羟基利培酮峰面积比值为纵坐标，绘制标准工作曲线，得到线性回归方程：y＝(2.53e+1)x+5.02e+1，相关系数r2为0.9994；其中，涉及的溶液配制具体如下：混合标准品储备液配制：校准品及质控品配制：(4)通过高效液相色谱仪对步骤(2)制备的上机溶液进行检测，并且对其检测结果进行分析；其中，液相色谱条件为：色谱柱：c18,2.6μm,2.1mm x 100mm柱温：40℃；进样器温度：9℃；检测波长：254nm；流动相：流动相a为0.1％的甲酸水溶液；流动相b为纯甲醇；
进样量：10μl；色谱梯度如下：时间，min流速，ml/min流动相a，v％流动相b，v％00.30020.080.00.200.30020.080.03.000.30035.065.07.000.30038.062.09.000.30070.030.011.000.30020.080.012.000.30020.080.0保留时间：氯氮平5.2min，喹硫平6.3min。
33.实施例2一种测定血浆中氯氮平与喹硫平浓度的方法，与实施例1的不同之处在于，其混合萃取液为二氯甲烷、正己烷和乙酸乙酯的混合液，其中，二氯甲烷、正己烷和乙酸乙酯的体积比为1:1:8，其余步骤与实施例1均相同。
34.实施例3一种测定血浆中氯氮平与喹硫平浓度的方法，与实施例2的不同之处在于，将步骤(2)复溶涡旋混匀后的溶液，经过0.22μm膜过滤后，再进行上机检测，其余步骤与实施例2均相同。
35.对比例对比例1一种测定血浆中氯氮平与喹硫平浓度的方法，与实施例1的不同之处在于，其萃取液为二氯甲烷、正己烷和乙酸乙酯的混合液，其中，二氯甲烷、正己烷和乙酸乙酯的体积比为1:2:8，其余步骤与实施例1均相同。
36.对比例2一种测定血浆中氯氮平与喹硫平浓度的检测方法，与实施例1的不同之处在于，其复溶液中甲醇的浓度为10％，其余步骤与实施例1均相同。
37.对比例3一种测定血浆中氯氮平与喹硫平浓度的检测方法，与实施例1的不同之处在于，其萃取液为100％乙酸乙酯，其余步骤与实施例1均相同。
38.性能检测试验检测方法/试验方法通过测试人血浆加标质控品(配制见表1)，然后比较按照实施例1-3和对比例1-3的检测结果，每个浓度的血浆样本针对每个实施例的检测方法检测3次，并计算cv。检测结果如表2、表3、表4和表5所示。
39.表1人血浆加标质控品配制
表2氯氮平的检测结果通过实施例1-3，对比例1-3，以及表2的检测数据可知，应用本技术的检测方法检测血浆中的氯氮平，针对150ng/ml浓度的氯氮平血浆样本，其准确度均在103.1-104.4％之间，cv均在0.4％及以下；针对400ng/ml浓度的氯氮平血浆样本，其准确度均在101.7-103.7％之间，cv均在0.3％及以下；针对640ng/ml浓度的氯氮平血浆样本，其准确度均在100.2-101.2％之间，cv均在0.3％及以下；说明本技术的检测方法能够准确的检测血液中较低和较高浓度的氯氮平(150-640ng/ml)，并且检测过程稳定，数据可靠。
40.表3喹硫平的检测结果
通过实施例1-3，对比例1-3，以及表3的检测数据可知，应用本技术的检测方法检测血浆中的喹硫平，针对120ng/ml浓度的喹硫平血浆样本，其准确度均在95.3-104.1％之间，cv均在0.7％以下；针对320ng/ml浓度的喹硫平血浆样本，其准确度均在101.2-102.2％之间，cv均在0.4％以下；针对512ng/ml浓度的喹硫平血浆样本，其准确度均在100.4-101.7％之间，cv均在0.5％以下；说明本技术的检测方法能够准确的检测血液中较低和较高浓度的喹硫平(120-512ng/ml)，并且检测过程稳定，数据可靠。
41.通过实施例1-3，以及表2和表3的检测数据可知，本技术通过在混合萃取液中加入一定量的正己烷，可以减少杂质的干扰，同时提高氯氮平和喹硫平检测的准确度；结合对比例1，其正己烷不宜添加过多，添加过多时，反而降低了检测的准确度。结合对比例3，其萃取液改为乙酸乙酯时，其萃取率降低，导致其检测准确率降低。结合对比例2，其甲醇水中甲醇的质量分数降低，其不利于复溶效果，导致最终的检测结果准确度降低。
42.上述具体实施方式的实施例均为本技术的较佳实施例，并非依此限制本技术的保护范围，故：凡依本技术的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本技术的保护范围之内。

技术特征：
1.一种测定血浆中氯氮平与喹硫平浓度的方法，其特征在于：其包括如下步骤：(1)将经过抗凝的全血样本离心，取上清液得到血浆；(2)前处理步骤向校准品、质控品及血浆样品中分别加入内标工作液并涡旋混匀，然后加入一定量的氢氧化钠溶液，涡旋混匀后，加入一定体积的二氯甲烷/乙酸乙酯的混合萃取液，充分涡旋混匀，离心后，取上清液，经氮吹干，用甲醇水溶液复溶，得上机液，待测；(3)通过高效液相色谱仪对步骤(2)制备得到的上机液进行上机检测，并且对其检测结果进行分析；其中，液相色谱条件为：色谱柱：c18,2.6μm,2.1mm x 100mm柱温：40℃；进样器温度：9℃；进样量：10μl；检测波长：254nm；流动相：流动相a为0.1％的甲酸水溶液；流动相b为纯甲醇；色谱梯度如下：时间，min流速，ml/min流动相a，v％流动相b，v％00.30020.080.0 0.200.30020.080.0 3.000.30035.065.0 7.000.30038.062.0 9.000.30070.030.0 11.000.30020.080.0 12.000.30020.080.0保留时间：氯氮平5.2min，喹硫平6.3min。2.根据权利要求1所述的一种测定血浆中氯氮平与喹硫平浓度的方法，其特征在于：所述内标物为9-羟基利培酮，将其使用甲醇稀释成27μg/ml，作为内标工作液。3.根据权利要求1所述的一种测定血浆中氯氮平与喹硫平浓度的方法，其特征在于：所述血浆中氯氮平与喹硫平浓度的检测方法还包括标准曲线配制，其包括如下内容：分别称量一定质量的氯氮平、喹硫平，使用甲醇分别配制成高浓度的2.5mg/ml氯氮平溶液与2mg/ml的喹硫平溶液；稀释配制成混合标准品溶液，氯氮平50μg/ml、喹硫平40μg/ml；使用7.5％bsa溶液稀释混合标准品溶液替代基质校准品和质控品，其中，氯氮平校准品浓度范围为100-800ng/ml，质控品为150ng/ml、400ng/ml、640ng/ml；氯氮平校准品浓度范围为80-640ng/ml，质控品为120ng/ml、320ng/ml、512ng/ml。4.根据权利要求1所述的一种测定血浆中氯氮平与喹硫平浓度的方法，其特征在于：所述前处理步骤具体操作如下：分别取400μl校准品、质控品和待测血浆样本于新的离心管中，分别加入50μl的内标工作液并涡旋混匀后，加入100μl 1m的氢氧化钠溶液，充分涡旋后，再加入1ml二氯甲烷/乙酸
乙酯混合萃取液(2:8)振荡涡旋10min后，于离心机中离心；然后取上清液850μl至新的离心管中，经氮吹后，加入200μl的20％甲醇水溶液复溶，涡旋振荡，得到上机液。5.根据权利要求1所述的一种测定血浆中氯氮平与喹硫平浓度的方法，其特征在于：所述混合萃取液为二氯甲烷/正己烷/乙酸乙酯的混合液，其中，二氯甲烷、正己烷和乙酸乙酯的体积比为1:1:8。6.根据权利要求4所述的一种测定血浆中氯氮平与喹硫平浓度的方法，其特征在于：所述上机液经过0.22μm膜过滤后，再进行上机检测。7.根据权利要求1所述的一种测定血浆中氯氮平与喹硫平浓度的方法，其特征在于：所述甲醇水溶液中甲醇的浓度为20％。

技术总结
本申请涉及临床血药浓度监测技术领域，涉及一种测定血浆中氯氮平与喹硫平浓度的方法，包括如下步骤：（1）将加有抗凝剂的全血样本离心后得血浆；（2）向校准品、质控品和待测血浆样品中分别加入内标工作液并涡旋混匀，加入氢氧化钠溶液，充分涡旋混匀后，加入二氯甲烷/正己烷/乙酸乙酯混合萃取液，其体积比为1:1:8，充分涡旋离心后，取上清液，氮气吹干，复溶后振荡，过有机滤膜；（3）高效液相色谱仪进行检测，色谱柱：C18；柱温：40℃；进样器温度：9℃；检测波长：254nm；流动相：流动相A为甲酸水溶液；流动相B为纯甲醇；其具有操作简便，成本低，分离度好，准确度高等特点。准确度高等特点。准确度高等特点。


技术研发人员：刘艳 王朝阳
受保护的技术使用者：石家庄华创医学检验实验室有限公司
技术研发日：2022.12.20
技术公布日：2023/8/5