用于假禾谷镰刀菌定量PCR检测的内参菌及其应用

用于假禾谷镰刀菌定量pcr检测的内参菌及其应用
技术领域
1.本发明属于假禾谷镰刀菌检测领域，具体涉及一种用于假禾谷镰刀菌定量pcr检测内参菌及其应用。


背景技术：

2.由假禾谷镰刀菌引起的小麦茎基腐病（wheat crown rot，wcr）是小麦生产中重要的土传病害，主要症状表现为小麦根茎基部变褐腐烂，严重的可引起苗枯和白穗。该病在澳大利亚、美国、加拿大等国家均有发生且危害严重，正常年份，小麦茎基腐病造成小麦平均产量损失约9.5%，大流行年份可达35%。近年，该病害在黄淮海冬麦区普遍发生，并呈现逐年加重趋势，目前，河南、河北两省该病害的病田率分别高达65.1%和81.4%，已经严重威胁小麦的安全生产。
3.假禾谷镰刀菌(fusariumpseudograminearum)以菌丝或孢子（例如，厚垣孢子）的形式在土壤中作物残体上越冬。土壤中病原菌是主要的初侵染源，土壤中病原菌含量与茎基腐病的发生有明显的正相关关系，播种前土壤中的病原菌含量可以作为下一年茎基腐病发病的重要指标。因此，土壤病原菌含量检测对病害预测至关重要。
4.假禾谷镰刀菌的检测方法很多，如平板检测法、生物测定法、常规pcr检测和定量pcr(qpcr)检测技术等。其中，qpcr技术因其检测快速，灵敏度高、特异性强、可绝对定量等特点成为病菌检测最重要的检测技术。国内外研究者也报道多种qpcr方法来检测接种物在土壤或残体中假禾谷镰刀菌的含量。然而，这些检测方法均没有考虑到模板dna提取效率对检测准确度的影响。不同地区土壤的土壤类型、ph值、有机质含量等性质差异很大，同时土壤中富含的腐植酸、多酚类、多糖类、重金属离子等，这些因素是dna的提取和后续的qpcr影响因子，均会对土壤中假禾谷镰刀菌的定量检测造成极大影响。但是目前已报道的土壤中假禾谷镰刀菌的qpcr定量检测方法均未对样品的dna提取及qpcr检测步骤等的整个样品检测过程进行有效的校正。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种用于假禾谷镰刀菌定量pcr检测的内参菌。
6.本发明的再一目的在于提供包含上述内参菌的产品。
7.本发明的再一目的在于上述内参菌的应用。
8.本发明提供了一种特异性dna片段，其序列如seq id no.1所示：c gcctggtgag gtgtctgtcg gggtagctaa gcccctctta cacagttcac caccaatcag ctacgtctcg ccggtccact agtgacgagg ctactacacc tacgtgttgc catttttcac actaaaccca cggaccg根据本发明具体实施方式的的重组菌，是通过重组载体转化出发菌缺失突变体得到，其中，
所述重组载体含有内参片段，所述内参片段的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述内参片段选自seq id no.3的5’端第199-337位，seq id no.3的核苷酸序列如下：tcatgtgagg ttaataagag cggataaaaa cagctacacg tcaattggga cgaacaaatc60taggtcctct tagtcataga agtctaggta gtaactagac ctactgcctg ccggaccagc120cctgggacgg acagataact cggttaagtt cgttttctaa aaagcccagc atggaacaca 180acatggtccg acactttaac gcctggtgag gtgtctgtcg gggtagctaa gcccctctta240cacagttcac caccaatcag ctacgtctcg ccggtccact agtgacgagg ctactacacc300tacgtgttgc catttttcac actaaaccca cggaccggcc aatatgagcc ctgcaactat360caccgattca aatgagaccc tcatagctgg aaactggccg taatataaat tgtaggtaag420caacatacac acatgctggt ggcaacacgt cactgaatag ccacatagtg tcctctgggc480aacggtgcat tattcgacaa gacaatgttc atgtgttcgc acaccgcaca cggattgaac540tggtgaaagg aaaatagcgc aactcgtaga gttagcctac atagcacgtg cttgcccctg 600cttaatccaa cgcccttgtg atcctgtgca tgcatgcgta ttgagtgggc ttagcccccc660cctgctaaca tcagatgtaa gactctaatt accaggttac ataaactttt aagagtcgtt720cagcgaggtc gggtgtgtga agaagtggcc ccattgtcag tgaggggaga atcgttaatc780gtgtgacgag cgtctcctgt gcgcacccat atcagaagga ggatcttgcg tgtagagatg 840agagtggtac ccgttccact acactatccc agatgctcgc ttataaaggg gtgcgctcgt900attttgtata gcggctttag cgtgtagaac tcccgtccaa cgttttcgtg gaaaacgccg960cgaggccagt gctggcaaca caatagattt gatgcggagg1000出发菌缺失突变体以假禾谷镰刀菌为出发菌，并缺失检测片段，所述检测片段的核苷酸序列如seq id no.2所示。
9.seq id no.2的核苷酸序列如下：caagtttg atccagggta atcctctatt gacagtttgt aataatattg agaaaactag ggctgtagat atcagaccaa aattaaataa atacaagtaa tattagttcc taacaataca agataagaat gaggaagact aagagaaaca gc所述检测片段选自seq id no.4的5’端第1813-1962位，seq id no.4的序列如下：cgggcaagga tagcgcacta tccaagccga tggagctctt cctgctttca gatgtcccta60cagactcgac accaatcccc caaggcgcga ccgtcgacat cttgtttcac agcaaccatg120tgttttggga tgggatcgct tgtcgaaagt ttatcgggga cctctttcgc ctcgtgggta180atcacatcgg ccttagtgac agcgccgaga cgcctaagat gcaatggggc caagagatca240agaacctgag ccctccagtc gttgactcgc tcaagttgga catcagcact cttggaactg300agttcgatga caagtgcaca gaatatacag gtgctcttgt ggccaactat gtgagttgat360gttccggctt tatttctccc agcacacact gaccttctca caacagaaaa gccgaggtat420gaaatttcga ccaggactcg gtttacctcg ttgttctatc tacaaactta gtgccgacga480ctccattgcc ataatcaagg ctgtgaagac tcgacttggc cctggctata ccatcagtca540gctgacccaa gctgcgatta tacttgctct gctagaccac ctcaagccta ctgatctttc600agacgatgag ttcttcatat caccaacatc agtagatggc cgcaagtgga tgcgggagga660tatagccagc aactactacg ccatgtgcca gactgctgcc gttgttcgcg tcgagaacct720
gaagtctatt gcagtgagtc acaaggatga aaaagatatt caagtcagag ctctggaaaa780ggcctgcagg gatatcaaaa aatcttacga tcaatggctt ggaaatccgt tcctggaggc840tctaggcctc agagttcata acttcgaggc cagctatttg cacgagtaag ttgaaccagt900tcctctatca tcgcattggc taacacatga ccacctaagg aaaccgaatc cattcgaagg960aacagaagcg aacccggtat agctgctgaa tctcgcgaaa ttgcgtccct gaaatgctaa1020caatcatgca acagttgttc atcagtgacg gtgtcaacga acgcttcatt cctcgcgaaa1080tcaagcgaac tgcaacaggc gaggacgttt tgtccgttga aagcatagac tttattgtga1140accagtcttt gccatatctg tgagtccctc aaccagattg caaagctata actaacaagt1200caatagggca gtccggctgg atagttggag agatgcttcc accctcaaca tcatctataa1260tgatgcaaac tataacgagg aagaggtaca gacgtacttg aagagtattg tagagttcat1320gctggcattc aaactgtaat ttgctgttta ttgaaatggt acatgggctt ttcgaggagc1380gatgttgtcc aggcaagact ttggggtgga ttttgagttc ggtggttttc caacgccagg1440aagacgctac atatgagcta gaactggatg agtgcatgta gtttgagtat gaatctattt1500gtaaatctga tcaaagttcc cttttcacaa ttcaatttta tacttcccaa acttcgaccc1560atgtcgcgta ataatagatc ctggagaggc cagagccgaa tttctacaat tacaactacc1620ttcagattct agcaggccat ttgcacctgt aatggtagct ctcgcaacat cggttccatt1680tggagttgtt cgatgctgtg ttgcaggagg acgagacagc tactgtgcgt atatcccgga1740agaagcttct tctgtcacgt acgtgttctt gtttagaatg ttagtcatta ggagaatctt1800gattcagtat gtcaagtttg atccagggta atcctctatt gacagtttgt aataatattg1860agaaaactag ggctgtagat atcagaccaa aattaaataa atacaagtaa tattagttcc1920taacaataca agataagaat gaggaagact aagagaaaca gctttctagc tgcagaagag1980agcataaata cttattaggt gaagtcacat agctaacgag aacttgtagt tgacttttta2040tatgctaaac tacaacatga agcctagctc aatagataac cacgatgttc gtatgtgagg 2100ttgatggctt gcatatacca aaaactcaat aaatcgcttc cattaagcta cctcaatatg2160accagctttc acaaggtacc tacatgtcta aggcaattaa tttatttaaa ggatacttaa2220gctcatccta aataaagaca tatcattact aatgtacaag tcttctacca ggagcaagtt2280tcgtagtgca tgcgcaatct ctttttcatc ccataatgca ttgactgaag tgaatagtgc2340ttagattgac gagcgtctaa atagagtaaa atttatttta cgttcagatg ttgctactat2400gaacttccat ccctgcatac caaaaatgga ctgaacaaaa ggaacaggat tcgatgccga 2460tacagtgagt tatccagtaa gatattgaga cagtttgtca gatgcgcctt acaaagcctt2520gagaaccttg actcgaactt cgccaaggtg ttccttcttg cctggaattg ccttggggta2580gccaacaata cgggcgtgag tcatgtcaat gtcggccttg gtggtgtcat aaagctcaac2640ctcgtaagct tgggcaatgc gagaaagagc gaggtacatc tcagcaaagg ccatgctgtt2700gaaatgttag caagtgttct cctccaatcg gagagtgccg ataggcaata aagggaatca2760acttacgtgt atccgatgca ctgtctagaa ccctgagaga agttggtgat gtacttcttg2820agagggatac ccttctgttg tgcctcgatc catcgctcag gcttgaactt ttcgggctcg2880gggaaattct tgggatcggt gtgcatgaaa taggtggact gagaaatggg agtctgtggt2940
aattgttagc atgcatagat atagagagat agaaaatgaa cctactccgg cagggatgac3000atgctccttg tacttcaagt tctcctgagt agccacacgt cccgagcgag aaattggacc3060gaaagcgaga cggaatccct catggacgac accgttcagg taagggaggt tttctagggt3120agagaggggg aaattgtcgt ccttgacagg tgggagggtt ttcaactcct ctcggagctt3180cttcaagcac tcaggatggg tcaagaggta gaatacggta atggccagtg tccttgaagt3240agtctcggta ccagcaaaca ggataacggt accctcatcg agcattcgct ccacggttcg3300ttcatgagcg gggatgtgtg agtctgcaag ggcaccgaa3339示例性地，所述出发菌为假禾谷镰刀菌，更具体可为假禾谷镰刀菌2035。
10.所述重组菌是通过缺失出发菌（假禾谷镰刀菌）中的检测片段如seq id no.4自5’端第1813-1962位所示，获得出发菌缺失突变体，再将含有特异性dna片段的质粒载体的转化出发菌缺失突变体得到的。
11.根据本发明具体实施方式的产品，其包括前文所述的重组菌和内参引物；所述内参引物由上游引物f和下游引物r组成；所述上游引物f为seq id no.3自5’端第199至216位所示的单链dna分子；所述下游引物r为与seq id no .3自5’端第320至337位所示的核苷酸反向互补的单链dna分子；上游引物的核苷酸序列如seq id no.5所示：fptri3-iqf：5'-acgcctggtgaggtgtct-3'；下游引物的核苷酸序列如seq id no.6所示：fptri3-iqr：5'-cggtccgtgggtttagtg-3'。
12.根据本发明具体实施方式的产品，其用途为如下(a1)-(a4)中任一种：(a1)检测或辅助检测假禾谷镰刀菌；(a2)假禾谷镰刀菌定量检测；(a3)提高假禾谷镰刀菌定量检测的准确性；(a4)校正假禾谷镰刀菌定量检测结果。
13.根据本发明具体实施方式的一种假禾谷镰刀菌定量检测方法，或对假禾谷镰刀菌定量检测结果进行校正的方法，上述方法均包括如下步骤：(1)取定量待测样本，加入已知量的前文所述重组菌的分生孢子，然后提取样本总dna；以提取的dna样本为模板，分别采用检测引物对和内参引物对进行qpcr检测；(2)将步骤(1)中采用检测引物对进行qpcr检测得到的ct值代入公式1，得到检测值，采用内参引物对检测得到的ct值代入公式2，得到内参值；(3)根据公式：回收效率＝内参值/重组菌的实际添加量，计算得到回收效率，然后根据公式：校正后含量＝检测值/回收效率，计算得到假禾谷镰刀菌的含量；检测引物对：fptri3ef：5
′‑
caagtttgatccagggtaatcc-3
′
；seq id no.7；fptri3er：5
′‑
gctgtttctcttagtcttcctca-3
′
；seq id no.8；内参引物对：fptri3-iqf：5'-acgcctggtgaggtgtct-3'；seq id no.5；fptri3-iqr：5'-cggtccgtgggtttagtg-3'；seq id no.6。
14.公式1是根据采用不同已知浓度的假禾谷镰刀菌靶标片段为模板，按照步骤(2)进行qpcr检测后以ct值和模板含量得到的标准曲线公式以及步骤(1)和(2)整个过程中的数量关系得到用来根据ct值x计算得到检测值y的公式；所述假禾谷镰刀菌靶标片段为前文所述已报道假禾谷镰刀菌检测片段seq id no.2自5’端第1813-1962位所示的dna片段；公式2是根据采用不同已知浓度的内参片段为模板，按照步骤(2)进行qpcr检测后以ct值和模板含量得到的标准曲线公式以及步骤(1)和(2)整个过程中的数量关系得到用来根据ct值x计算得到内参值y的公式；所述内参片段为seq id no .1自5’端第199至337位所示的dna片段。
15.公式1具体可为：y＝a
×
10
(39.359-x)/3.0795
/c；公式1中，y为每g土壤中假禾谷镰刀菌含量（单位为基因组拷贝数/g土），x为ct值，a为单次提取dna的最终体积（μl），c为单次提取的土壤质量（g）。
16.公式2具体可为：y＝a
×
10
(41.821-x)/3.6309
/c；公式2中，y为每g土壤中内参菌株含量（单位为基因组拷贝数/g土），x为ct值，a为单次提取dna的最终体积（μl），c为单次提取的土壤质量（g）。
17.所述qpcr检测的反应体系具体可为：takara tb green premix ex taq (2x) 预混液，tb green 10 μl，两条引物各1μl，rox dye ii 0.4 μl，ddh2o 2.6 μl，dna模板5μl。
18.引物均以引物溶液的形式加至反应体系中，引物在引物溶液中的浓度为10 μm。
19.所述qpcr检测的反应程序具体可为：95℃预变性5min，1个循环；之后再进行45个循环，每个循环包括95℃30s、55℃30s、72℃45s；72℃采集信号。
20.步骤(1)中，重组菌的分生孢子加入量为5
×
103‑ꢀ4×
104个分生孢子/克干土。
21.所述待测样本具体可为土壤，所述待测样本还可为植物组织。
22.本发明的有益效果：本发明提供用于对土壤中假禾谷镰刀菌qpcr定量检测结果进行校正的内参菌株，该内参菌株以假禾谷镰刀菌2035为出发菌株，在其基因组上缺失检测片段seq id no.2，插入特异性的内参片段seq id no.1的人工构建内参重组菌株。
23.本发明采用的方法对土壤中假禾谷镰刀菌及定量加入的内参菌株进行检测，以内参菌株的回收效率(recovery efficiency)对靶标假禾谷镰刀菌的回收效率进行校正。针对该内参菌株，选择与目标菌同种菌株进行人工构建重组菌株，保证提取效率的一致性，并设计了内参菌株特异的引物对用检测内参菌株。以不同浓度内参dna片段为模板进行检测，证明该内参菌株的qpcr检测体系灵敏度可达到50个拷贝的内参dna片段。
24.本发明通过对不同地区、不同质地的12份土壤样品中假禾谷镰刀菌及内参菌株回收效率的测定，发现使用内参菌株校正可以将假禾谷镰刀菌回收效率提高2.92-16.57倍，更接近于理论回收效率，有效提高了假禾谷镰刀菌qpcr定量检测的准确性。同时该内参菌株也可用于判断假禾谷镰刀菌qpcr检测中的假阴性结果，即在定量加入了内参菌株的试验中未检测到内参菌株，则表明该次检测因为试剂、操作等原因导致检测失败，需重新检测。
附图说明
25.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
26.图1 为出发菌缺失突变体检测图。
27.图2 为假禾谷镰刀菌qpcr检测标准曲线图。
28.图3 为内参菌株qpcr检测标准曲线。
具体实施方式
29.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
30.本发明部分实施例可选用的试剂：假禾谷镰刀菌2035菌株：取自河北省农林科学院植物保护研究所；dna胶回收试剂盒（bio-teke）；小量质粒提取试剂盒（omega）；真菌基因组dna提取试剂盒（bioflux）；快速dna产物纯化试剂盒（康为世纪）；植物总rna提取试剂盒（华越洋）；rna反转录试剂盒（thremo）；地高辛标记dna和检测试剂盒（roche）；酵母质粒提取试剂盒（omega）；pcr试剂：taq酶（thermo）、fastpfu酶（全式金）、限制性内切酶（fermentas）；常规试剂：潮霉素b（roche）、氨苄青霉素（mp）、遗传霉素g418（mp）、碱性酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）、氯仿、异丙醇、无水乙醇、70%乙醇、裂解酶（lysing enzyme）（sigma）、崩溃酶（driselase）（sigma）。
31.实施例 1构建用于对假禾谷镰刀菌qpcr定量检测结果进行校正的内参菌株1.1 缺失假禾谷镰刀菌检测片段（1）构建检测基因同源重组片段选用假禾谷镰刀菌2035为出发菌株，经过筛选，选择假禾谷镰刀菌qpcr定量检测的特异性片段（seq id no.3）为靶标片段，构建检测片段缺失突变体，上述特异性的检测片段的引物序列如下：fptri3ef：5
′‑
caagtttgatccagggtaatcc-3
′
；fptri3er：5
′‑
gctgtttctcttagtcttcctca-3
′
。
32.用真菌基因组dna提取试剂盒提取假禾谷镰刀菌2035基因组dna，以基因组dna为模板，用依据上述特异性的检测片段（seq id no.3）设计的1f/2r引物和3f/4r引物对分别扩增靶标片段约1 kb的上游和下游同源序列片段。
33.fptri3-1f：5'-agccagcaactactacgc-3'；fptri3-2r：5'-ttgacctccactagctccagccaagccctccaaatggaaccgatg-3'；fptri3-3f：5'-gaatagagtagatgccgaccgcgggttgctcaatagataaccacgat-3'；fptri3-4r：5'-aaacctcccttacctgaa-3'。
34.反应体系为transstart
®ꢀ
fastpfu pcr supermix (2x) 预混液，25 μl，两条引物各1.5μl，dna模板2μl，ddh2o 20μl体系。
35.扩增程序为95℃预变性5min，1个循环；之后进行35个循环，每个循环包括95℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 1min；72℃延伸10min，1个循环。
36.以phig2rhph2-gfp-gus质粒为模板，利用hyg-f和hyg-r引物扩增潮霉素抗性（hph）基因片段，扩增体系条件同上。
37.hyg-f：5'-ggcttggctggagctagtggaggtcaa-3'；hyg-r：5'-aacccgcggtcggcatctactctattc-3'。
38.pcr 产物用琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的条带（bio-kete胶回收试剂盒，方法参见说明书）。利用double-joint方法将l、r 和hph片段的胶回收产物混合连接成一个敲除片段备用。
39.（2）原生质体的制备和转化将野生型假禾谷镰刀菌2035菌株接种到羧甲基纤维素培养基中摇培，接种到装有100ml cmc液体培养基的250ml三角瓶中，25℃,150rpm培养72小时诱导产孢，将孢子转移到含有100ml yepd液体培养基的250ml三角瓶中，25 ℃, 175 rpm 12小时，收集菌丝，用每克菌丝加20ml原生质体buffer（崩溃酶+裂解酶）的比例裂解菌丝，30℃, 90rpm 摇培2小时，收集原生质体，用10ml stc buffer 离心洗涤2次，重新悬浮到2-5
×
107个原生质体/ml。
40.加入步骤（1）构建的敲除片段5 ug，室温下静置20min，加入1ml 40% ptc 到管中，翻转混合均匀，室温静置20min，加入5ml tb3 (含 50 g/ml 氨苄青霉素)，室温摇过夜，加10ml tb3 agar(含潮霉素250ug/ml)快速到平板，室温培养10小时后，再倒上含有400ug/ml潮霉素的tb3 agar，室温继续培养，待长出单菌落的转化子，按步骤（1）方法提取转化子dna，用引物fptri3ef/r检测靶标基因是否被敲除，构建检测片段缺失突变体。
41.图1结果显示，缺失突变体中利用检测引物没有扩增出目的条带，抗生素基因扩增出条带，说明缺失突变体的检测片段已被抗生素标记片段成功替换。
42.二、重组菌株构建人工合成特异性的内参dna片段，如seq id no.3所示，根据片段序列设计内参引物，并通过筛选比较，确定如下内参引物对：fptri3-iqf：5'-acgcctggtgaggtgtct-3'；fptri3-iqr：5'-cggtccgtgggtttagtg-3'；采用引物对fptri3-iqf/r（加质粒重组接头）扩增内参片段序列，如seq id no.1所示，将获得的内参片段序列和pfl2载体共转至xk1-25酵母菌株，提取质粒，将酵母重组质粒转化大肠杆菌构建重组质粒；重组质粒按步骤（2）转入检测片段缺失突变体，构建得到内参菌株。
43.实施例 2检测及内参标准曲线构建利用引物fptri3ef/r从假禾谷镰刀菌2035菌株中扩增检测片段，利用引物fptri3-iqf/r从合成片段（seq id no.1）中扩增内参片段，pcr扩增程序和试剂同实施例1。
44.分别将扩增产物纯化后克隆到载体pmd19-t上，获得重组质粒pmd19-fptri3e、pmd19-fptri3iq。
45.利用重组质粒pmd19-fptri3e、pmd19-fptri3iq热激法转化至大肠杆菌escherichia coli dh5a感受态细胞中，然后测序，将测序正确的重组载体提取质粒后进行酶切，酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳后切胶，凝胶回收试剂盒回收相应片段，利用分光光度计（nanodrop）测定线性化的重组质粒的dna浓度，并根据公式计算重组质粒dna的拷贝数。
46.用双蒸水将上述两个质粒载体稀释成1
×
106、1
×
105、1
×
104、1
×
103、1
×
102、1
×
101、1
×
100拷贝/μl稀释液。以上述拷贝数梯度稀释的pmd19-fptri3e、pmd19-fptri3iq质粒为模板，分别用fptri3ef/r和fptri3-iqf/r引物，染料方法进行实时荧光定量pcr反应。分别建立质粒拷贝数与ct值的检测及内参标准曲线。
47.结果如图2和图3所示，检测引物标准曲线为y=-3.0795x+39.426，r
²
=0.9959，其中x表示拷贝数取对数，y表示ct值；检测引物在重组质粒3
×
101～1
×
107拷贝数范围内线性关系良好，可以准确检测假禾谷菌株的数量。
48.内参引物标准曲线为y=-3.6309x+41.821，r
²
=0.9991，检测引物在重组质粒6
×
101～6
×
106拷贝数范围内线性关系良好，可以准确检测内参菌株的数量。因此，本发明的引物及内参菌株可用于假禾谷镰刀菌的检测。
49.实施例 3假禾谷镰刀菌及内参菌株回收效率测定及校正一、土壤样品的采集和前处理在河北省保定市、石家庄市、邢台市、邯郸市、沧州市、衡水市等6市12县区小麦田采集采集0-10cm深度不同性质土壤12份，采集后土壤样品置于室温下避光自然风干备用。
50.二、假禾谷镰刀菌及内参菌株分生孢子的准备将假禾谷镰刀菌2035和内参菌株在pda平板培养基上活化，长出菌落后在菌落边缘用5 mm打孔器打取菌饼，放入羧甲基纤维素(cmc，cmc-na 15.0 g，nh4no31.0 g，酵母膏1.0 g，mgso4·
7h2o 0.5 g，kh2po41.0 g，蒸馏水1000 ml)培养基中25℃，150 rpm摇培5d，使用滤布（backman）和双层擦镜纸过滤得到孢子悬浮液，用血球计数板计数孢子浓度。
51.三、土壤中假禾谷镰刀菌分生孢子回收效率测定与校正人工定量添加假禾谷镰刀菌2035菌株与内参菌株分生孢子至步骤一收集的各土壤样品中，使每份土壤孢子量为105个孢子/克土，采用土壤dna提取试剂盒(qiagen)提取土壤dna，分别通过实施例1和实施率2中的荧光定量pcr方法获得假禾谷镰刀菌和内参菌株的ct值，通过实施例1和2中构建的标准曲线和公式1、公式2计算得到每克土中假禾谷镰刀菌及内参菌株基因组的含量。
52.公式1：y＝a
×
10
(39.359-x)/3.0795
/c；y为每g土壤中假禾谷镰刀菌含量（单位为基因组拷贝数/g土），x为ct值，a为单次提取dna的最终体积（μl），c为单次提取的土壤质量（g）。
53.公式2：y＝a
×
10
(41.821-x)/3.6309
/c；y为每g土壤中内参菌株含量（单位为基因组拷贝数/g土），x为ct值，
a为单次提取dna的最终体积（μl），c为单次提取的土壤质量（g）。
54.根据公式rp
fp
＝m
fp
/a
fp
和rp
ir
＝m
ir
/a
ir
分别计算得到假禾谷镰刀菌回收效率rp
fp
，内参菌株回收效率rp
ir
，其中，m
fp
和m
irafp
和a
ir
为两菌株的实际添加量。
55.根据公式计算得到校正后假禾谷镰刀菌回收效率crp
fp
＝rp
fp
/rp
ir
。结果如表1所示。
56.表 1土壤样品假禾谷镰刀菌回收率（%）内参菌株回收率（%）校正回收率（%）保定市博野县13.47
±
7.3123.07
±
4.1758.38保定市博野县4.87
±
1.5710.27
±
1.8645.44石家庄市藁城区12.53
±
5.7618.28
±
13.4868.54石家庄市藁城区11.39
±
4.2019.57
±
4.6858.17邢台市平乡县9.41
±
3.8315.54
±
12.8260.52邢台市平乡县15.39
±
6.3310.46
±
3.98147.19邯郸市魏县18.36
±
8.6215.57
±
2.70117.94邯郸市魏县25.99
±
3.6034.21
±
23.0875.96沧州市吴桥县4.36
±
0.858.57
±
2.9350.94沧州市吴桥县7.85
±
3.188.57
±
5.8591.61衡水市景县9.47
±
5.3913.78
±
5.1968.75衡水市景县5.45
±
1.066.03
±
0.3090.30结果显示，使用内参菌株进行校正可以将假禾谷镰刀菌回收率提高2.92-16.57倍，更接近于理论回收效率(100％)，有效提高了假禾谷镰刀菌qpcr定量检测的准确性。
57.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

技术特征：
1.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌是通过重组载体转化出发菌缺失突变体得到，其中，所述重组载体含有内参片段，所述内参片段的核苷酸序列如seq id no.1所示；出发菌缺失突变体以假禾谷镰刀菌为出发菌，并缺失检测片段，所述检测片段的核苷酸序列如seq id no.2所示。2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述出发菌为假禾谷镰刀菌2035。3.一种产品，其特征在于，包括权利要求1所述的重组菌和内参引物，所述内参引物由上游引物f和下游引物r组成；所述上游引物f的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述下游引物r的核苷酸序列如seq id no.6所示。4.权利要求1所述的重组菌或权利要求3所述的产品在以下任一项中的应用：(a1)检测或辅助检测假禾谷镰刀菌；(a2)假禾谷镰刀菌定量检测；(a3)提高假禾谷镰刀菌定量检测的准确性；(a4)校正假禾谷镰刀菌定量检测结果。5.权利要求1所述的重组菌或权利要求3所述的产品在制备试剂盒中的应用，所示试剂盒的用途为以下任一种：(a1)检测或辅助检测假禾谷镰刀菌；(a2)假禾谷镰刀菌定量检测；(a3)提高假禾谷镰刀菌定量检测的准确性；(a4)校正假禾谷镰刀菌定量检测结果。6.一种假禾谷镰刀菌定量检测的方法或对假禾谷镰刀菌定量检测结果进行校正的方法，包括如下步骤：(1)取待测样本，加入权利要求1所述的重组菌的分生孢子，然后提取样本中的总dna；以提取的dna样本为模板，分别对待测样品和重组菌进行qpcr检测；(2)将步骤(1)中对待测样品进行qpcr检测得到的ct值代入公式1，得到检测值；对重组菌进行qpcr检测得到的ct值代入公式2，得到内参值；(3)根据公式：回收效率＝内参值/重组菌的实际添加量，计算得到回收效率；然后根据公式：校正后含量＝检测值/回收效率，计算得到假禾谷镰刀菌的含量；公式1：y＝a
×
10
(39.359-x)/3.0795
/c；其中，y为每g土壤中假禾谷镰刀菌含量，单位为基因组拷贝数/g土，x为ct值，a为单次提取dna的最终体积，单位为μl，c为单次提取的土壤质量，单位为g；公式2：y＝a
×
10
(41.821-x)/3.6309
/c；其中，y为每g土壤中内参菌株含量，单位为基因组拷贝数/g土，x为ct值，a为单次提取dna的最终体积，单位为μl，c为单次提取的土壤质量，单位为g。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，qpcr检测的反应程序为：95℃预变性5min；之后进行45个循环，每个循环包括95℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 45s，72℃采集信号。8. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，重组菌的分生孢子加入量为5
×
103ꢀ‑ꢀ4×
104个分生孢子/克干土。9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述待测样本为土壤。

技术总结
本发明属于假禾谷镰刀菌检测领域，具体涉及一种用于假禾谷镰刀菌定量PCR检测内参菌株及其应用。一种重组菌是通过重组载体转化出发菌缺失突变体得到。本发明通过对不同地区、不同质地的12份土壤样品中假禾谷镰刀菌进行测定，发现使用内参菌株校正可以将假禾谷镰刀菌回收效率提高2.92-16.57倍，更接近于理论回收效率，有效提高了假禾谷镰刀菌qPCR定量检测的准确性。同时，该内参菌株也可用于判断假禾谷镰刀菌qPCR检测中的假阴性结果，即在定量加入了内参菌株的试验中未检测到内参菌株，则表明该次检测因为试剂、操作等原因导致检测失败，需重新检测。需重新检测。需重新检测。


技术研发人员：吴玉星 王亚娇 韩森 孔令晓 栗秋生
受保护的技术使用者：河北省农林科学院植物保护研究所
技术研发日：2023.06.20
技术公布日：2023/8/6