一种降低瘢痕真皮成纤维细胞胶原含量的多肽ADSCP8及其应用的制作方法

一种降低瘢痕真皮成纤维细胞胶原含量的多肽adscp8及其应用
技术领域
1.本发明涉及创面愈合与瘢痕领域，具体地说涉及一种降低瘢痕真皮成纤维细胞胶原含量的多肽adscp8及其应用。


背景技术：

2.增生性瘢痕是一类皮肤纤维化疾病，主要以胶原等细胞外基质局部过度沉积为特征，是烧伤、整形外科界面临的巨大挑战。其不仅影响美观，还会引起瘙痒、疼痛、挛缩等症状甚至残疾，严重降低患者的生活质量，给患者的身体和心灵带来巨大的痛苦。皮肤损伤及外科手术后的患者，增生性瘢痕的发生率为39％-68％，烧伤患者的发生率则高达91％。目前，多采用局部加压、激光干预、药物注射、手术切除等方法治疗增生性瘢痕，然而均存在局限性及不良并发症。因此，深入研究增生性瘢痕的形成与调控机制、寻找有效的瘢痕防治手段，具有重要的临床意义。
3.多肽是一类由3-50个氨基酸残基组成的生物活性物质，具有分子量小、容易合成、高效低毒等特点。目前全球上市的多肽药物有120多个，涵盖肥胖、糖尿病、抗肿瘤等多个领域。在皮肤相关领域，有用于改善卟啉病患者日光耐受性的阿法诺肽(afamelanotide，13肽)，用于治疗皮肤感染的杆菌肽(bacitracin)、短杆菌素(tyrothricin，环肽)等。目前尚没有用于治疗增生性瘢痕的多肽药物。
4.vimentin(波形蛋白)是中间丝的其中一种蛋白，是真核生物细胞骨架重要组成成分其对细胞的完整性和细胞骨架稳定性至关重要。vimentin表达于多种间充质细胞类型：成纤维细胞、内皮细胞等，以及从中胚层。据报道，vimentin的表达高，具有促进瘢痕的作用。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种多肽adscp8。
6.本发明的另一目的是提供该多肽的应用。
7.本发明的又一目的是提供一种含有该多肽的细胞培养液。
8.本发明的目的可通过以下技术方案实现：
9.本发明所述的多肽adscp8，氨基酸序列如seq id no.1所示。
10.所述多肽的获得可按照氨基酸序列通过固相合成方法获得；或者通过宿主微生物或细胞内克隆并表达携带编码所述多肽之一的核苷酸序列的dna片段，通过现有的重组dna技术制备获得。所使用的表达载体和宿主细胞均为重组技术为公众所知的。表达载体例如pet载体、pgex载体；宿主细胞例如大肠杆菌(e.coli)，放线菌(actinomycetes)，芽孢杠菌(bacillus)，链霉菌(streptomyces)，本发明所述的多肽可用常规的酶切方法将其从宿主细胞中分离，也可以通过常规的液相色谱法进行分离和纯化，上述的分离纯化方法都是本领域技术人员公知的技术。
11.本发明还提供编码前述多肽的核苷酸序列，其为seq id no.2所示的核苷酸序列。
12.含有本发明所述基因的重组表达载体。
13.本发明所述表达载体转染的宿主微生物细胞。
14.本发明所述的多肽adscp8在制备降低瘢痕真皮成纤维细胞胶原含量的药物或试剂中的应用。
15.本发明所述的一种多肽adscp8在制备降低肌成纤维细胞量的药物或试剂中的应用。
16.一种细胞培养液，含有所述的多肽adscp8。
17.本发明还提供含有前述多肽的组合物。
18.本发明所述的多肽可以单独应用，除此之外，本发明多肽还可以与其他多肽联合使用。多肽组合物中包含序列为seq id no.1的多肽。
19.所述的药用组合物的剂型选自胶囊、片剂、锭剂、丸剂、滴丸、栓剂、喷雾、乳膏、贴剂中的任意一种。
20.所述的药用组合物包含将所述多肽adscp8制备成所述的剂型的药用辅料。
21.有益效果：
22.多肽adscp8(liktvetrdgqvinetsqhhddle)，前体蛋白为vime，由24个氨基酸组成，目前尚无其相关功能报道。生物信息学分析及实验结果显示：
①
adscp8来源于vimentin蛋白羧基端的443-466位氨基酸；
②
protparam在线分析发现，adscp8的不稳定系数(instability index)为10.93，属于稳定型多肽，可稳定存在；脂肪系数(aliphatic index)为89.17，平均亲疏水性(grand average ofhydropathicity)为-1.025；
③
细胞培养液中加入adscp8，定量pcr实验证实adscp8可降低瘢痕真皮成纤维细胞中胶原基因col1a1、col1a2、col3a1及肌成纤维细胞主要标志物acta2的mrna表达量；western blot实验证实adscp8可降低i型胶原(包含col1a1、col1a2)、col3a1以及肌成纤维细胞主要标志物acta2的蛋白表达量。因此，adscp8可以在制备降低瘢痕真皮成纤维细胞胶原含量、降低肌成纤维细胞量的药物或试剂中应用。
附图说明
23.图1为试验例1中adscp8抑制瘢痕真皮成纤维细胞中胶原基因col1a1、col1a2、col3a1以及肌成纤维细胞主要标志物acta2的mrna表达量的图。**p《0.05。
24.图2为试验例2中adscp8抑制瘢痕真皮成纤维细胞中i型胶原(包含col1a1、col1a2)、col3a1以及肌成纤维细胞主要标志物acta2的蛋白表达量的图。
具体实施方式
25.实施例1
26.委托上海科肽生物科技有限公司通过固相法合成如下seq id no.1所示序列：
27.leu ile lys thr val glu thrargasp gly gln val ileasn glu thr ser gln his his aspasp leu glu
28.这是24个氨基酸组成的多肽，通过在线工具获取前述多肽序列的主要生物学参数如下：
29.等电点(pi)为4.57，分子质量(molecular weight)2777.98da。
30.上述序列为来源于人脂肪干细胞培养上清中的天然序列，除了通过化学固相合成法获得，还可以通过对长链多肽通过生物酶切技术获得，亦可通过宿主微生物或细胞内克隆并表达携带编码所述多肽之一的核苷酸序列的dna片段，通过现有的重组dna技术制备获得。编码上述多肽的核苷酸序列为：
31.ctgattaagacggttgaaactagagatggacaggttatcaacgaaacttctcagcatcacgatgaccttgaa(seq id no.2)。
32.所使用的表达载体和宿主细胞均为重组技术为公众所知的。表达载体例如pet载体、pgex载体；宿主细胞例如大肠杆菌(e.coli)，放线菌(actinomycetes)，芽孢杠菌(bacillus)，链霉菌(streptomyces)，本发明所述的多肽可用常规的酶切方法将其从宿主细胞中分离，也可以通过常规的液相色谱法进行分离和纯化，上述的分离纯化方法都是本领域技术人员公知的技术。
33.实施例2
34.实施例1所述的多肽可以单独应用，除此之外，这些多肽还可以多肽组合物联合使用。多肽组合物中包含序列为seq id no.1的多肽。
35.实施例3
36.本实施例提供前述实施例1所述的一种多肽，或者实施例2所述的多肽组合物可制备成药学上可接受的载体，例如：胶囊、片剂、锭剂、丸剂、滴丸、栓剂、喷雾、乳膏、贴剂等形式。
37.实施例4
38.一、试验材料
39.rna逆转录试剂盒和rna检测试剂盒等购自南京诺唯赞公司，成纤维细胞培养基购自美国sciencell公司。
40.二、adscp8多肽的合成与稀释
41.本实验实施例1中固相合成获得的多肽adscp8为例。取10mg多肽，用无菌双蒸水稀释成50mm-40℃储存备用。
42.三、实时定量pcr(rt-pcr)检测多肽adscp8对人瘢痕真皮成纤维细胞中胶原基因col1a1、col1a2、col3a1以及肌成纤维细胞主要标志物acta2的mrna表达影响
43.在37℃、5％co2孵箱中，培养人瘢痕真皮成纤维细胞，按105/ml密度接种于6孔板中，待细胞融合度达60％左右时，将多肽adscp8(终浓度为25μm)加入人瘢痕真皮成纤维细胞，24h后，细胞长满，弃去培养基，尽量吸净培养基，分别直接加入trizol 1ml；室温裂解5分钟，加入200μl氯仿，充分涡旋震荡混匀15s，室温静置2min，12000rpm，4℃离心15min；轻轻吸取上层水相450μl至无rna酶的ep管，加入450μl异丙醇，-20℃放置过夜，12000rpm，4℃离心15min，管底可见细小片状沉淀；用75％乙醇(depc水配制)洗涤沉淀，12000rpm，4℃离心5min，小心弃去上清；再次12000rpm，4℃离心2min，用黄枪头小心吸掉上清；放入超净台或通风橱干燥10-15min；使用depc水30μl溶解rna。
44.提取好的rna，采用南京诺唯赞公司的逆转录试剂盒进行逆转录，按照说明书的具体步骤实施如下：
①
去除可能的基因组dna，反应体系总体积为16μl，具体如下：
[0045][0046]
将上述试剂加入在一个ep管中之后，移液器轻轻吹打使其混匀，放入42℃水浴锅2min。
②
配制逆转录反应体系，总体积为20μl，即在上一步的ep管中加入4μl的含有逆转录酶的逆转录反应溶液(5
×
hiscript iii qrt supermix)，用移液器轻轻吹打使其混匀。
③
进行逆转录反应，37℃ 15min，85℃ 5s。产物可立即用于qpcr反应，或者-20℃保存，并在半年内使用。
[0047]
使用到的引物由上海生工公司合成。引物序列如下：
[0048][0049]
实时荧光定量pcr(qrt-pcr)使用南京诺唯赞公司的chamq universal sybr qpcr master mix试剂盒进行。
[0050]
在qpcr管中配制如下混合液：
[0051][0052][0053]
按照pcr仪默认的两步法pcr扩增的标准程序设定：预变性95℃ 10s；pcr反应95℃
5s，60℃ 31s，共40个循环；融解曲线获取程序即默认的dissociation stage。反应结束后确认qrt-pcr的扩增曲线和引物的融解曲线正常，用2
‑△△
ct法分析所得数据。
[0054]
试验结果：如图1所示，通过实时定量pcr实验发现，adscp8多肽处理组(25μm)的瘢痕真皮成纤维细胞中胶原基因col1a1、col1a2、col3a1以及肌成纤维细胞主要标志物acta2的mrna表达量均显著降低，表明多肽adscp8可显著抑制瘢痕真皮成纤维细胞中胶原基因col1a1、col1a2、col3a1以及肌成纤维细胞主要标志物acta2的mrna表达量。四、western blot法检测多肽adscp8对人瘢痕真皮成纤维细胞中i型胶原(包含col1a1、col1a2)、col3a1以及肌成纤维细胞主要标志物acta2蛋白表达量的影响
[0055]
分别收集多肽处理组(终浓度为25μm)及对照组的人瘢痕真皮成纤维细胞，进行如下操作：
[0056]
加入100μl ripa细胞裂解液(含蛋白酶抑制剂)冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。之后4℃、12000rpm离心5min，取裂解液上清分装于1.5ml的ep管中并放置于-80℃保存。采用bca(bicinchoninic acid)法测定蛋白含量，具体如下：首先制作bsa蛋白标准品的标准曲线，在酶标仪上测定蛋白浓度。
[0057]
获得蛋白之后，加入5
×
sds(sodium dodecyl sulfate，十二烷基磺酸钠)上样缓冲液，于沸水中煮5min使蛋白变性。制备sds-page分离胶与浓缩胶进行实验，每个孔上样同样的蛋白量。电泳1.5h，电压为80v，观察到溴酚兰刚跑出即可终止电泳(一般1-2h)，随后进行转膜。转膜时一般运用60v转移2h，之后进行封闭1h，加入一抗(用tbst(tris-buffered saline andtween 20)稀释，抗体稀释比例为1：1000)；室温下孵育1～2h之后，在室温下脱色摇床上用tbst洗两次，每次10min；之后用tbs洗一次，10min。根据一抗来源分别加入相应的二抗(用tbst稀释，抗体稀释比例为1：5000)，室温下孵育1～2h之后，在室温下脱色摇床上用tbst洗两次，每次10min；之后用tbs洗一次，10min。随后用ecl(efficient chemiluminescence kit)试剂盒等进行化学发光反应。拍照，条带运用image j进行灰度分析。
[0058]
抗体信息如下，购自对应的公司：
[0059][0060]
试验结果：如图2所示，通过western blot实验发现，adscp8多肽处理组的瘢痕真皮成纤维细胞中i型胶原(包含col1a1、col1a2)、col3a1以及肌成纤维细胞主要标志物acta2的蛋白表达量降低，表明多肽adscp8可抑制瘢痕真皮成纤维细胞中胶原以及肌成纤维细胞主要标志物acta2的蛋白表达量。
[0061]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.多肽adscp8，其特征在于氨基酸序列如seq id no.1所示。2.编码权利要求1所述的多肽adscp8的基因。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于核苷酸序列如seq id no.2所示。4.含有权利要求2所述基因的重组表达载体。5.权利要求4所述表达载体转染的宿主微生物细胞。6.权利要求1所述的多肽adscp8在制备降低瘢痕真皮成纤维细胞胶原含量的药物或试剂中的应用。7.权利要求1所述的多肽adscp8在制备降低肌成纤维细胞量的药物或试剂中的应用。8.含有权利要求1所述人脂肪干细胞培养上清来源肽adscp8的组合物。9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于权利要求1所述多肽adscp8以治疗有效量存在于组合物中。10.一种细胞培养液，其特征在于含有权利要求1所述的多肽adscp8。

技术总结
本发明公开了一种降低瘢痕真皮成纤维细胞胶原含量的多肽ADSCP8及其应用。一种多肽ADSCP8，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。多肽ADSCP8能够抑制人瘢痕真皮成纤维细胞中胶原基因COL1A1、COL1A2、COL3A1的mRNA表达量，显著降低了人瘢痕真皮成纤维细胞中肌成纤维细胞主要标志物ACTA2的蛋白表达量。本发明多肽ADSCP8可用于制备抑制瘢痕真皮成纤维细胞胶原含量、降低肌成纤维细胞量的药物或试剂，为抑制瘢痕增生提供了新的靶点。抑制瘢痕增生提供了新的靶点。抑制瘢痕增生提供了新的靶点。


技术研发人员：李俊 李景云 陈玲 张恩远 曾思奇 蒋静彬
受保护的技术使用者：南京市妇幼保健院
技术研发日：2023.06.16
技术公布日：2023/8/6