一种miRNA或其检测试剂的用途

一种mirna或其检测试剂的用途
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域。具体涉及一种通过检测胚胎培养液中mir-4466表达量来鉴定胚胎发育潜能的用途。


背景技术：

2.近年来，辅助生殖技术(art)的应用逐年增加，但种植率及活产率仍未达到理想水平。胚胎质量是影响移植的关键因素之一，当前，胚胎形态学特征和卵裂率是挑选优质胚胎的主要指征，但仍有许多经过筛选后的优质胚胎无法成功种植或在种植后发生胚胎停育。因此，寻找高特异性、无创、易于获取的胚胎发育潜能标志物对筛选优质胚胎以成功着床及妊娠至关重要。而随着art的广泛开展，胚胎培养基已成为体外受精胚胎移植后的日常副产品，胚胎培养基为精卵结合及胚胎发育提供了一个微环境，在早期胚胎发育和成熟过程中起着至关重要的作用，同时胚胎培养基中也含有大量胚胎释放的活性物质及代谢物质，是筛选无创生物标志物的首选来源。
3.研究发现，micrornas(mirnas)在胚胎发育过程中起到至关重要的作用。已有研究表明，一些mirnas参与不同物种胚胎发育，如研究发现胚胎着床前mirna-29b的抑制会导致早期胚胎发育的停滞，这种结果可能是由多种基因下调所致，mirna-29b可能通过调控多种靶基因而对胚胎发育发挥作用。mirna-21对于移植前胚胎具有抗凋亡作用，具体机制可能于il-6诱导的stat3信号通路通过增加细胞数量和抑制凋亡来提高体外胚胎的存活率。还有研究者在牛和人胚胎培养基中检测到mirna-25，其表达影响基因wwp2和fbxw7的调控，从而参与调节细胞的重新编程以促进诱导多能干细胞，mirna-25过表达还可促进细胞增殖，而其下调则促进细胞凋亡和氧化应激。mirna-320参与调控多种信号通路，包括wnt信号通路，而wnt信号通路参与受精过程中细胞膜的黏附和融合、调控细胞增殖、细胞粘附、多能性和极性的建立，在胚胎着床前发育和卵泡发育中起重要作用。近年相关发明专利陆续也有申请和授权，如mir-125a-5p在胚胎早期发育中的应用(cn 113061661 b)；与冷冻精子质量或其所形成胚胎发育相关microrna标志物及其应用(cn 114369668 a)，该申请保护的冷冻精子质量或胚胎发育相关的microrna标志物为mir-30b-5p、mir-148b-3p和mir-140-5p中的一种或多种。通过检测冷冻精子中3个靶标microrna的表达，用于预测冷冻精子样本的质量及其在后续所形成胚胎的发育潜能；通过检测mir-290家族表达鉴定胚胎发育潜能的方法(cn 115323059 a)。总之，micrornas做为胚胎发育过程中诊断或治疗的靶点，越来越受到重视。但做为无创标记物，在临床辅助生殖技术中的应用，较少报道。
4.本专利中我们收集了不同发育潜能的人类胚胎培养液(已经伦理审查批准)，经提取micrornas后高通量测序发现了一些差异表达的mirnas，后经实时pcr验证我们发现mir-4466是其中差异最为明显的一种，而经文献查询mir-4466在口腔鳞癌、胃癌、注意缺陷多动障碍患儿血清、缺氧诱导下人肺动脉内皮细胞中有差异表达，其他情况没有报导，可以成为预测胚胎质量的无创新型生物标志物，用以检测胚胎发育潜能。


技术实现要素：

5.发明目的：
6.本发明的目的是公开一种mir-4466或其检测试剂的用途，可用于无创性检测胚胎发育潜能，作为辅助生殖技术中筛选优质胚胎的依据。
7.技术方案：
8.所述胚胎发育潜能检测阶段为卵裂期，通常为受精卵培养第3天。
9.具体检测包括以下步骤：收集卵裂期胚胎的培养基，对应胚胎可冻存或更换新培养基，提取培养基中的总mirna，将总mirna反转录为cdna，实时pcr技术检测mir-4466表达量。
10.本发明的实验证明，优质胚胎培养基实验组(a组)mir-4466的表达量较劣势胚胎培养基对照组明显上升，其结果提示：胚胎培养基种mir-4466的表达量可作为制备检测胚胎早期发育潜能的指标，并可制备相关检测产品使用。本发明为检测胚胎早期发育潜能和择优移植提供了一个全新的指标。本发明的优点是新颖性和无创性。
附图说明
11.附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
12.附图1显示优质胚胎培养基实验组(a组)与劣势胚胎培养基对照组(b组)mir-4466表达量的差异。a组培养基对应胚胎移植后依据后续移植情况，无法成功种植或在种植后发生胚胎停育的标本删除对应数据。
具体实施方式
13.为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件。在不背离本发明实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明范围。
14.实施例1
15.根据形态学标准将移植前胚胎分级后对应的培养基分为优质胚胎培养基实验组(a组)和劣势胚胎培养基对照组(b组)，分别液氮冻存，记录相应的临床质料，a组培养基对应胚胎移植后依据后续移植情况，无法成功种植或在种植后发生胚胎停育的标本删除其在a组中的对应数据。
16.1.培养基中总mirna的提取
17.本发明中使用全式金mirnakit试剂盒进行mirna提取，可商购获得，亦可采用其它同类产品。将样本于液氮中取出后立即加入1ml lysis buffer 10，待其溶解后充分振荡混匀，室温静置5分钟；加入0.2ml rna extraction agent，剧烈震荡30秒，室温静置3分钟；10000
×
g 4℃离心15分钟，吸取上层的无色水相；转移无色的水相于新的离心管中，并加入1/3转移液体积的无水乙醇，颠倒混匀；将上述溶液全部加入rna spin column中，12000
×
g室温离心30秒，保留流出液；准确测量流出液体积，转移到干净的1.5ml rnase-free离心管中，加入1.25倍流出液体积的无水乙醇，轻轻颠倒混匀；将上述溶液全部
加入mirna spin column中，12000
×
g室温离心30秒，弃掉流出液；加入500μl wash buffer 10(使用前加入无水乙醇并混匀)，室温12000
×
g离心30秒，弃掉流出液；重复步骤8一次；室温12000
×
g离心2分钟，彻底去除残留的乙醇；将mirna spin column放入1.5ml rnase-free中，加入30μl rnase-free water在离心柱的中央，室温静置1分钟；室温12000
×
g离心1分钟，洗脱mirna；将mirna置于-80℃保存，以备后续实验。
18.2.mirna反转录为cdna
19.本发明中使用全式金mirna first-strand cdna synthesis supermixqpcr试剂盒进行mirna反转录，可商购获得，亦可采用其它同类产品。混合各组分，20μl体系包含total mirna 7μl、mirna rt enzyme mix 1μl、2
×
ts mirna reaction mix 10μl、rnase-free water 2μl；37℃孵育1小时；85℃加热5秒钟失活rt enzyme mix；置于-80℃保存，以备后续实验。
20.3.qpcr(实时pcr)
21.本发明中使用全式金green qpcr supermix试剂盒进行qpcr实验，可商购获得，亦可采用其它同类产品。依据mir-4466的核苷酸序列为acgcgggugcgggccggcgggg，设计mir-4466primer序列为：gggtgcgggccggcgggg。u6 primer购自生工生物工程上海股份有限公司，编号：b661602-002，亦可采用其它同类产品。20μl体系种包含cdna 2μl、mir-4466primer或u6 primer(10μm)0.5μl、universal mirna qpcr primer(10μm)0.5μl、2
×
green qpcr supermix 10μl、nuclease-free water 7μl。轻轻混匀，置于roche480实时pcr仪中进行检测，采用三步法，程序如下：94℃30sec，(94℃5sec，56℃15sec，72℃10sec)共计45个循环。ct(mir-4466)-ct(u6)为该样本mir-4466的相对表达量，表示为
△
ct。将b组样本中最小的
△
ct值定为标准(
△
ct
标
)，则2
(
△
ct
‑△
ct标)
》1标记为优势胚胎，2
(-(
△
ct
‑△
ct标)
≤1标记为劣势胚胎。
22.实施例2
23.某女，30岁，取卵10枚，培养第三年共形成卵裂期胚胎8枚，其中一级胚胎(8细胞)3枚，一级胚胎(7细胞)1枚，二级胚胎(8细胞)2枚，二级胚胎(3细胞)1枚，四级胚胎(2细胞)1枚。分别收集前6枚胚胎培养基，提取培养基中的总mirna，将总rna反转录为cdna，实时pcr技术检测mir-4466表达量。记录6个培养基样本mir-4466的ct值，ct≤29标记为优势胚胎，ct》29标记为劣势胚胎。

技术特征：
1.一种mirna或其检测试剂的用途，其特征在于用于检测体外胚胎发育潜能，其中所述的mirna为mir-4466。2.如权利要求1所述的一种mirna或其检测试剂的用途，其特征在于所述mir-4466的核苷酸序列为acgcgggugcgggccggcgggg。3.如权利要求1所述的一种mirna或其检测试剂的用途，其中所述其检测试剂为以检测mir-4466表达量为目的相关试剂。4.如权利要求1所述的一种mirna或其检测试剂的用途，其特征在于所述胚胎发育潜能检测阶段为卵裂期。5.如权利要求1所述的一种mirna或其检测试剂的用途，其特征在于检测对象为胚胎培养基。

技术总结
本发明提供了一种miRNA或其检测试剂的用途，属于生物技术领域。具体说，本发明提供了miR-4466或其检测试剂的用途，用于检测辅助生殖技术中的胚胎发育潜能。本发明实验证明，miR-4466在发育状态良好的胚胎培养基中明显高表达；通过实时PCR检测胚胎培养基中miR-4466表达情况可以预测辅助生殖技术中的胚胎发育潜能，为预测胚胎发育潜能提供了一种无创生物标志物。生物标志物。生物标志物。


技术研发人员：于晓艳 霍文博 邹颖刚
受保护的技术使用者：吉林大学
技术研发日：2023.05.29
技术公布日：2023/8/6