一种无需亚硝的胞外呼吸型厌氧氨氧化工艺

1.本发明属于水处理技术领域，具体涉及一种无需亚硝的胞外呼吸型厌氧氨氧化工艺


背景技术：

2.考虑到世界范围内日益严重的水污染问题，越来越多的研究致力于研发高效、节能、低碳生物脱氮技术。厌氧氨氧化(anammox)可谓污水脱氮领域的一项颠覆性技术，该新型工艺有效克服了传统脱氮技术(硝化-反硝化)供氧能耗高、碳源需求量大和处理费用太高等缺点，极大地推进污水脱氮处理的节能减排进程。在严格厌氧条件下，厌氧氨氧化菌(anaob)以hco
3-或co2为碳源，在厌氧酶体膜结构上将亚硝酸盐(no
2-‑
n)用作电子受体，直接转化氨氮(nh
4+-n)为n2，进而完成脱氮。根据anammox生物化学现有模型，anammox氮转化详细过程为：亚硝酸盐(no
2-‑
n)被亚硝酸盐还原酶(nir)还原为一氧化氮(no)。随后肼合成酶(hzs)催化no与氨氮(nh
4+-n)缩合生成自然界最强的化学还原剂——肼(n2h4；e`0＝-700mv)。最终，肼脱氢酶(hdh)将n2h4氧化成n2。同时，n2h4释放四个低电位电子并通过anammox所含致电呼吸复合体，经一系列细胞内电子转移路径建立膜电位并重返厌氧酶体，为no
2-‑
n还原及n2h4合成提供电子，从而形成完整胞内电子循环路径。作为无机自养生长，co2固定过程所耗电子由亚硝酸盐氧化还原酶(nxr)催化部分no
2-‑
n氧化为no
3-‑
n补偿。
3.然而，依赖于胞内电子传递的anammox仍存在存在诸多附属问题。第一点，胞内电子传递的anammox必须以废水中no
2-‑
n用作电子受体。由于no
2-‑
n极易被氧化或还原为其它形态，实际污水中给几乎不存在no
2-‑
n。因此，污水中罕见no
2-‑
n成为anammox工艺推广最大阻碍。第二点，氧化no
2-‑
n为no
3-‑
n以补偿胞内电子传递链上的电子空缺也会造成11％含氮副产物(相较于进水nh
4+-n含量)的积累，从而限定anammox的脱氮生理极限仅为89％。因此，亟待开发一种区别于以no
2-‑
n为电子受体的胞外呼吸型anammox路径，从而解决no
2-‑
n供给限制并清除所有的no
3-‑
n的副产物的限制。shi等人(2016)基于希瓦氏菌(shewanella)和地杆菌(geobacter)为胞外电子传递路径提供了设计理念：
①
特定微生物可以利用金属矿物作为终端电子汇进行呼吸作用，以直接跨过胞内电子受体的阻隔；
②
微生物细胞膜是一个电子交换的物理屏障，可以通过由氧化还原蛋白(例如c型细胞色素)和结构蛋白(如微生物纳米线和其他细胞结构)组成的转移通路来克服，该途径有望出现在相同或不同物种中并参与电子跨越整个细胞域，使胞内所产电子与细胞外电子受体进行交换。然而，由于anaob独特的细胞结构，该过程是否适配anammox体系仍很大程度未知，这使得其可行性依然面临从基础研究到工业应用的挑战。
4.基于此，本研究以anammox体系原生功能菌种及已知酶库为基础，通过原位激发新型非亚硝依赖anammox通路以驱动高效的胞外呼吸型氮代谢，并提供详细的胞外电子转移路径和分子机制。本发明首次开发了一种无需亚硝的胞外呼吸型厌氧氨氧化工艺，从根本上解决anammox电子受体供给受阻及副产物积累等瓶颈，扩宽anammox应用领域的同时进一步完善全球氮循环认知，对于推动面向主流城镇含氨废水未来型污水处理厂的设计及优化
具有重要意义。


技术实现要素：

5.综上所述，no
2-‑
n稳定供给及no
3-‑
n副产物积累成为anammox工艺实际化推广的根本阻碍。因此，本发明提供了一种无需亚硝的胞外呼吸型厌氧氨氧化工艺，创新性以胞外电子受体为终端电子汇开发非亚硝依赖型anammox工艺，直接输送nh
4+-n电子至胞外，成功避免了anammox的对胞内电子受体no
2-‑
n的需求以及no
3-‑
n生成风险，极大地扩宽anammox工艺的应用广度及治理深度。其面临的主要难题是如何快速转变“正常”胞内呼吸型anammox工艺为胞外呼吸依赖型体系，从而为anammox工艺无需no
2-‑
n便可实现单一nh
4+-n去除以及突破生理脱氮极限创造可能。
6.为此，本发明提供了以下技术方案。
7.所述一种无需亚硝的胞外呼吸型厌氧氨氧化工艺包括以下步骤：
8.步骤1、构建no
2-‑
n和氨氮同步供应的厌氧氨氧化体系：
9.将接种污泥投放入序批式反应装置中，采用含有no
2-‑
n和nh
4+-n的人工配水作为反应器进水以满足anammox细菌营养需求，采用间歇运行，单周期时长为6-12h，包含进水、搅拌、沉淀、出水、闲置五个环节；
10.所述接种污泥特性满足以下条件中的至少一项：
11.a、所述接种污泥体积占反应器总容积的20～40％；
12.b、搅拌后形成的初始混合液中总的悬浮物的量为5000～6000mg/l；
13.c、搅拌后形成的初始混合液中，挥发性悬浮物(即有机生物质含量)/总悬浮物质量比为0.4～0.6，保证污泥中拥有充足有机微生物。
14.(1)该步骤中所述污水包含no
2-‑
n、nh
4+-n及含有微量元素的介质溶液：no
2-‑
n浓度为30-80mg/l，nh
4+-n配置浓度为no
2-‑
n浓度的12-1.3倍；利用去离子水配制含有5-20mg/lpo
43-‑
p、50-80mg/lcacl2、500-1000mg/lkhco3的微量元素营养液；
15.(2)通过调整反应器水力停留时间，使得出水总氮去除率高于85％，最终完成“正常”厌氧氨氧化体系的启动；
16.步骤2、本发明在步骤1制得的厌氧氨氧化体系的基础上添加胞外电子受体物质，每间隔3-4天下调进水no
2-‑
n质量浓度5-10mg/l，以此降低进水no
2-‑
n/nh
4+-n进水质量浓度比值，原位激发anaob电子外传潜能，最终构建无需亚硝的胞外呼吸型厌氧氨氧化工艺；
17.步骤3、采用步骤2构建的胞外呼吸型厌氧氨氧化反应器对仅含氨污水进行处理；
18.进一步的，还包括ph、do测定仪，所述ph、do测定仪的探头设置在所述反应器中，以便时刻检测并调控反应器脱氮过程中ph及do有利于功能菌生存。优选的，ph、do测定仪的探头设置在所述反应器的排水口处。
19.进一步的，还包括原水池，所述原水池通过进水管与进水口连接，所述人工配水通过曝气维持溶解氧为0-0.5mgo2/l。
20.所述污水ph控制在7.3～7.5，采用hcl或naoh溶液对污水ph进行调节，示例性的，hcl或naoh溶液浓度为1m。
21.此外，本发明除anammox驯化单元外，还配备了胞外电子受体物质改性单元，即胞外电子受体需经该单元改性后方可更易成为anammox细菌的胞外电子受体；
22.进一步的，胞外电子受体物质的筛选，所添加物质表面存在电子空缺，即可接受anammox外传电子：可选择三氧化铁(fe2o3)、四氧化三铁(fe3o4)、二氧化锰(mno2)、纤铁矿(γfeo(oh))和腐殖质。优选的，纤铁矿(γfeo(oh))，这考虑到anammox细菌作为嗜铁菌及铁源素参与多种功能蛋白和血红素合成，且纤铁矿(γfeo(oh))来源广泛、价格低廉；
23.进一步的，为保证胞外电子受体物质更好贴合细菌表面以接受菌内外传电子，提取存活微生物表面胞外聚合物作为包埋剂以包裹所添加胞外电子受体物质，增加菌剂与材料之间粘连程度；优选的，所采用的存活微生物取自污水处理厂的二沉池剩余污泥，符合“以废治废”原则；
24.进一步的，胞外聚合物的提取在独立的改性单元内完成，具体流程为取15ml剩余污泥至离心管并稀释至40ml，离心管依次通过离心处理、冰水浴环境的超声处理、钠型阳离子交换树脂、第二离心处理、过滤环节后，取上清液；
25.进一步的，离心所需离心力为1500-2500g(第一)和4500-5500g(第二)，时间20-30min；超声处理频率为20-26khz，时间3min；过滤采用0.22μm纤维滤膜；钠型离子交换树脂投加量为60-90g/g污泥样品；
26.进一步的，将上清液与胞外电子受体充分摇匀、经零下20-30℃冷冻后，经冻干机冻干收获粉末状eps包埋型胞外电子受体；
27.进一步的，eps上清液与外电子受体物质按体积/质量(ml/mg)为2：1进行包埋处理，并投加至anammox反应器中；
28.进一步的，eps包埋型胞外电子受体投加量以质量计与反应器中污泥体积比为50-100mg/l
29.最终，基于功能菌种及相关酶注释功能及本发明还提出了一种连贯的、可行的氨电子外传的微生物机理，从而支撑anammox体系无需no
2-‑
n作为电子受体便可实现电子传递闭环。
30.初步的，肼电子的跨厌氧酶体运输：anaob通过一种未知氧化还原酶将n2h4氧化释放4个电子储存于甲基喹啉池，由此在厌氧酶体膜上建立质子动力，驱动atp合成；随后，anaob的rieske/cytbbc1复合物氧化双电子载体喹啉同步偶联高氧化还原电位的电子受体(如nad(p))的还原反应合成nad(p)h，并释放出游离电子。同时，nad(p)h所含电子也会被nadh:醌氧化还原酶释放并传递给rnf型电子传递复合物生成铁氧化还原蛋白(fd
red
)。最终，n2h4氧化释放4个电子以以胞质游离电子、nad(p)h和fd
red
等形式成功跨越厌氧酶体膜。
31.进一步的，细胞色素介导的胞质迁移：anaob表达一种类似于cyma的内膜c型细胞色素(cyta:4个血红素)将甲基喹啉池释放电子(即上文所提胞质游离电子)转移至周质单血红素c型细胞色素(cyta:1个血红素)。随后，anaob分泌外膜蛋白复合物(ompafamily protein)并通过电子传递链将电子从周质转移到细菌表面。
32.最终的，细菌表面的电子跃迁：由于anaob缺乏用于远程电子传输的载体，anaob释放电子只能通过直接接触到达胞外电子受体物质表面，这无疑需要细菌与胞外受体间更紧密的贴合度。本发明所提供的改性胞外电子受体物质恰好满足这一要求，胞外电子受体物质的外层胞外聚合物包埋剂有利于与anaob旺盛的分泌物所粘附，进一步缩短胞内电子向胞外调子受体传质距离。
33.本发明所述的一种无需亚硝的胞外呼吸型厌氧氨氧化工艺，其创造的技术效果在
于：1.本发明提供的胞外呼吸型厌氧氨氧化工艺，采用胞外电子受体物质替代水中不稳定的no
2-‑
n,彻底消除no
3-‑
n副产物积累的难题，降低了偶联工艺的高昂造价及复杂的运营管理，极大地扩宽anammox工艺的应用场景，有助于单一anammox在主流城镇废水的直接实施。在缺乏胞内电子受体的同时，优质的胞外电子受体激发anaob多种胞外电子传输相关活性酶的表达，利用细胞外固态电子受体作为终端电子汇进行高效率nh
4+-n去除。具体而言，anaob通过rieske/cytb bc1介导跨厌氧酶体(anaob特有的胞内膜式细胞器)转移，依托多血红素细胞色素(cyta)的细胞质迁移，以及细胞表面电子跃迁，将nh
4+-n电子运输到细胞外。因此，本发明所提供的新型anammox工艺无需no
2-‑
n作为必需的电子供体也可实现高效的nh
4+-n去除，为富含氨氮城镇废水的高效、节能、低碳的处理带来了曙光。
34.此外，微生物群落介导anammox工艺被视为污水脱氮技术的变局者，引发了污水界一场广泛而深刻革命，且存在多项实施案例。然而，11％的no
3-‑
n副产物产生的直接排放不仅造成二次污染，而且，限定了anammox工艺的脱氮生理极限为89％。因此，常规anammox工艺排放出水前还需要对残留no
3-‑
n含量作进一步监测和清除。本发明所提非亚硝依赖型anammox工艺不再通过氧化no
2-‑
n为no
3-‑
n便可实现细菌体内的电子闭环，从根本上杜绝了的no
3-‑
n副产物排放。
35.2.本发明提供的胞外呼吸型厌氧氨氧化工艺，极大提升功能菌的新陈代谢水平，加速细胞自我复制能力，缩短时代时间，有效改善反应器启动时间。anammox技术有如此显著的优势，然而其工程化应用却非常缓慢。据不完全统计，目前在我国境内的anammox工程案例仅有十余项。这一窘境与anaob表现出的极低生长速率密切相关。先前研究证实颗粒污泥形态的anammox菌在32-33℃下最大比生长速率仅为0.05-0.06d-1
(世代时间高达10-12d)。因此，长期以来anaob被认为属于生长极其缓慢的物种，从而导致在没有外源接种的前提下anammox系统启动周期极长(位于rotterdam的第一座anammox工程启动周期近3年)，极大地限制了anammox技术的推广应用。本发明所提一种无需亚硝的胞外呼吸型厌氧氨氧化工艺有效改善anaob的生长速率。一方面，胞外呼吸依赖型工艺将生产更多的铁还原蛋白(fd)以此协助氨电子的跨厌氧酶体转运。相较于胞内呼吸，无需no
2-‑
n的胞外呼吸型anammox工艺将在微生物体内积累更多的铁还原蛋白(fd)，从而改善无机碳和nh
4+-n等无机成分合成生物质，促进anaob生长和富集。主要原因为：在使用乙酰辅酶a途径生物中，co2还原步骤中电子转移主要由低氧化还原电位的fd介导。新型anammox工艺中更多的fd在厌氧酶体呼吸复合物和anaob中心碳代谢、氮同化之间充当电子穿梭器，加快电子沟通效率，从而改善anaob的种群富集效率。
36.3.更为重要的是，本发明提供的胞外呼吸型厌氧氨氧化工艺突破了anammox的扩散通量限制，加速细菌对营养底物的摄取水平，从而为细胞分裂提供合成元素及能量。第一点，无需no
2-‑
n的运行特点，使得新型体系不再受限于no
2-‑
n的扩散通量；第二点，胞内电子被源源不断释放于水环境中，从而降低反应器整体的氧化还原水平，更加有利于正电离子(nh
4+-n)的迁移与传输。这将有利于更多的nh
4+-n输送anaob表面；第三点，anaob具备摄取胞外无机电子的能力，以铁化物或铁基矿物质等作为胞外电子受体为例，其接受氨电子后被还原为游离性二价铁离子(fe(ⅱ))，游离性二价铁离子(fe(ⅱ))也可作为电子参与代谢，加速atp的合成效率，从而为胞外基质的跨膜运输提供能量；第四点，过度的nh
4+-n需求及充足的atp供应，anammox表面大量合成氨转运特异性蛋白(amt),提升nh
4+-n向胞内转移
的运输通道。综上所述，胞外呼吸型厌氧氨氧化工艺的建立全面突破厌氧环境中的底物扩散通量限制。营养物质的快速摄取及定向的生物质合成改善anaob自身的新陈代谢水平，加快细胞自我复制进程，有望突破anammox富集生理极限，在极短时代时间内完成种群扩增，进而培育具备高菌密度的改性anammox颗粒污泥，极大地扩宽新型工艺的应用广度及治理深度。
附图说明
37.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
38.图1是本发明无需亚硝的胞外呼吸型厌氧氨氧化装置的结构示意图；
39.图2是厌氧氨氧化细菌无需no
2-‑
n的细胞外电子转移路径；
40.附图标记：
41.anammox定向驯化单元：1-原水池，2-第一时间控制器，3-进水泵，4-进水管，5-第二时间控制器，6-搅拌装置，7-搅拌桨，8-ph测定探头，9-do测定探头，10-ph、do测定仪，11-第三时间控制器，12-电磁阀，13-排水管，14-出水池；胞外电子受体物质改性单元：15-0℃冰浴装置，16-高速离心机，17-超声装置，18-钠型阳离子交换树脂，19-胞外电子受体物质，20-冻干机。
具体实施方式
42.提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
43.实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
44.实施例1
45.本实施例提供了一种无需亚硝的胞外呼吸型厌氧氨氧化工艺，其装置结构如图1所示，包括，anammox驯化单元和胞外电子受体物质改性单元；
46.具体的，所述anammox驯化单元的核心反应器采用序批式运作模式，严格遵守进水、搅拌、沉淀、出水、闲置等五道工序。所述反应器结构上部设置有进水口、下部设置有出水口；
47.所述搅拌装置包括驱动电机6和搅拌单元7，所述搅拌单元设置在反应器中；
48.为了便于监测反应的ph值和do含量，还包括ph、do测定仪10，所述ph、do测定仪的ph测定探头8、do测定探头9设置在所述反应器中，位于anammox反应区域。
49.如图1所示，本实施例装置还包括原水池1，所述原水池1通过进水管4与进水口连通，在所述进水管4上设置有进水泵3，用于将原水池1中的污水泵入反应器。与所述进水泵3
连接设置有第一时间控制器2，用于控制进水泵3的工作时间。
50.本实施方式中螺旋桨片的旋转轴与反应器同轴设置，所述螺旋浆片的驱动电机与第三时间控制器5连接。所述反应器的排水口与排水管13连接，在所述排水管13安装有电磁阀12，所述电磁阀12与第四时间控制器11连接，排水管13将处理后的污水排至出水池14。
51.所述胞外电子受体物质改性单元，剩余污泥依次包括第一离心处理16、冰水浴环境15的超声处理17、钠型阳离子交换树脂18、第二离心处理16、过滤环节被提取，并与胞外电子受体物质均质后经冻干20完成包埋流程；
52.该方法的第一、第二离心处理、超声处理和钠型粒子交换树脂集成于一个离心桶进行。并明确规定步骤所需材料的型号参数，包括离心所需离心力为1500-2500g(第一)和4500-5500g(第二)，时间20-30min；超声处理频率为20-26khz，时间3min；过滤采用0.22μm纤维滤膜；钠型离子交换树脂投加量为60-90g/g污泥样品；
53.实施例2
54.本实施例提供了一种无需亚硝的胞外呼吸型厌氧氨氧化工艺，采用实施例1中的装置，采用序批式反应工艺对人工污水进行处理；
55.所述序批式反应工艺单周期时长为12h，其中进水10min、搅拌680min、沉淀15min、出水10min、闲置5min；
56.所述无需亚硝的胞外呼吸型厌氧氨氧化工艺及高密度功能菌培养方法包括以下步骤：
57.首先，构建稳定的“正常”厌氧氨氧化体系：
58.(1)采用“正常”anammox污泥为接种污泥，本实施例中anammox污泥中经鉴定以candidatusbrocadia菌属为主导功能菌；
59.(2)将接种污泥投放入反应器中，接种污泥容积占反应器总容积的20％。利用去离子水配制含有130mg/l no
2-‑
n、100mg/lnh
4+-n、10mg/lpo
43-‑
p、60mg/lcacl2、1000mg/lkhco3的人工废水，将人工废水的ph保持在7.5。将上述人工废水泵入反应器，然后进行搅拌，得到的初始混合液中，总的悬浮物约为5000mg/l，初始混合液中挥发性悬浮物/总的悬浮物(ρ(vss)/ρ(ss))比值为0.6，污泥平均粒径800.6μm。然后进行沉淀、出水。其中，测定anammox污泥的生长速率仅为0.07μ
·
d-1
，其相应世代时间高达12天。
60.反应器出水中总氮去除率高于85％该体系脱氮效果达到稳定状态。
61.同步地，进行胞外电子受体改性，本实施例优选,[γfeo(oh)]粉末为胞外电子受体；
[0062]
(1)eps的提取在独立的改性单元内完成，具体流程为取15ml剩余污泥至离心管并稀释至40ml，离心管依次通过第一离心处理、冰水浴环境的超声处理、钠型阳离子交换树脂、第二离心处理、过滤环节后，取eps上清液；离心所需离心力为1500-2500g(第一)和4500-5500g(第二)，时间20-30min；超声处理频率为20-26khz，时间3min；过滤采用0.22μm纤维滤膜；钠型离子交换树脂投加量为60-90g/g污泥样品；
[0063]
(2)将eps上清液与[γfeo(oh)]粉末按体积/质量(ml/mg)为2：1充分摇匀、经零下20-30℃冷冻后，经冻干机冻干收获粉末状eps包埋型胞外电子受体；
[0064]
随后，本发明在基于培养的“正常”厌氧氨氧化体系中投加100mg/l的eps包埋型改性[γfeo(oh)]粉末，逐步降低进水no
2-‑
n/nh
4+-n比值，原位构建无需亚硝的胞外呼吸型厌
氧氨氧化工艺。
[0065]
最终，采用构建的胞外呼吸型厌氧氨氧化反应器对人工合成污水进行处理；
[0066]
对实施例2中的反应器进水和出水中no
2-‑
n、nh
4+-n以及po
43-‑
p的含量进行逐天检测，同时测定anaob的生长速率。
[0067]
表1进出水污染物浓度
[0068][0069]
表2实施例2中污染物处理率
[0070][0071]
由以上实验结果可知，与“正常”anammox体系相比较(实验例0-13天)，本发明在远低于理论所需no
3-‑
n/nh
4+-n情况下,[γfeo(oh)]-胞外聚合物改性粉末的引入对于单一nh
4+-n及总氮的去除效果均可有效强化(表1)，显著高于前人研究，整体脱氮效率接近100％；平均磷去除率峰值也由45.01％提升至80.58％(表2)，且反应体系运行稳定，且无no
3-‑
n积累。最为重要的是，本实施例中anammox的生长速率被显著优化，优良的生存环境及铁还原蛋白的激发极大提升细菌生长速率5倍左右，anammox菌的生长速率可以达到0.33d-1
(世代时间2.1d，30℃)，与硝化细菌基本相当。
[0072]
同时，采用宏基因组学及宏转录组学数据，对比接种污泥与实验例2末期污泥的基因组数据，识别anammox细菌的所依赖的电子外传路径：先前研究证实anammox细菌rieske/cytb复合物在双电子载体喹啉氧化和c型细胞色素还原中起核心作用。利用这种电子分岔机制，通过(甲基)喹啉氧化偶联高氧化还原电位的电子受体(如nad(p))的还原反应合成nad(p(h在热力学上是可行的，从而释放出游离电子。比较转录组学分析显示，当,[γfeo(oh)]-胞外聚合物改性粉末被引入后，复合物rieske/cytbbc1表达量提升3.40倍(表3)。显然，更多bc1络合物可能被用于催化(甲基)喹啉氧化生成nad(p)h(reactiona；图2)参与胞外电子传递。相应地，在细胞质中，编码nadh基因(metf)表达提升1.35倍(表3)。根据anammox生物化学现有知识，,[γfeo(oh)]-胞外聚合物改性粉末也激发anaob中一系列代谢响应以应对nad(p)h积累。首先，nad(p)h被nadh:醌氧化还原酶氧化，所释放能量(δg0'＝-47kj)优先被上调钠依赖性rnf型电子传递复合物(表1)用于转移na离子，进而产生na动力(reaction b；图2)。此外，na动力促使上调nad依赖氧化还原酶、喹啉脱氢酶或nad依赖脱氢酶来驱动相反的、不利的nad+还原(表3)，进一步生成nad(p)h(reaction c；图2)。最终，
在膜结合rnf复合物中，来自nadh氧化电子被转移到铁氧化还原蛋白(fd
red
)(reactiond；图2)。由于fd
red
(e0'fd＝-500～-420mv)氧化还原电位比nad+/nadh(e0'nadh＝-320mv)更负，多余能量被用于fd
re
d跨膜转运。因此，肼脱氢酶(hdh)释放部分能量以胞质游离电子、nad(p)h和fd
red
等形式跨越厌氧酶体膜。
[0073]
除上述复杂的电子跨厌氧酶体运输，后续电子外传方式遵循希瓦氏菌(shewanella)和地杆菌(geobacter)类似电子转移路径设计。胞外呼吸型厌氧氨氧化工艺中，anaob表达一种类似于cyma的内膜c型细胞色素(cyta:4个血红素)将甲基喹啉氧化电子(即上文所提胞质游离电子)转移至高度上调周质单血红素c型细胞色素(cyta:1个血红素)(图2；表3)。其中，cyta(1个血红素)也与金属氧化细菌shewanella的mtra同源，进而可以作为cyta(4个血红素)和外膜细胞色素之间的电子穿梭体。随后，anaob中外膜孔隙-细胞色素复合物同源物(ompa familyprotein)高效表达(表达量提高1.06倍)。通过电子传递链将电子从周质转移到细菌表面(图2)。然而，转录组学数据显示没有检测到用于远程电子传递细胞色素(如核黄素)(表3)。由于缺乏远程电子传输载体，anaob释放电子只能通过直接接触到达胞外电子受体表面。因此，遵循上述路径，氨电子无需由no
2-‑
n接收，便可实现高效的nh
4+-n去除。
[0074]
表3在两种实验条件下(“正常”anammox和胞外呼吸依赖型anammox体系)具有相似表达的能量守恒相关基因列表
[0075]
[0076][0077]
实施例3
[0078]
本实施例提供了一种无需亚硝的胞外呼吸型厌氧氨氧化工艺，与实施例2基本相同，区别在于本实施例中采用实际污水且胞外电子受体为包裹细菌胞外聚合物的腐殖质。由于实际污水中仅含有nh
4+-n，且浓度低于实施例2中人工合成污水。因此，调整序批式反应工艺单周期时长为6h，其中进水10min、搅拌320min、沉淀15min、出水10min、闲置5min；为了进一步验证本发明在实际应用中的可行性，对实施例2中的反应器进水和出水中no
3-‑
n、no
2-‑
n、nh
4+-n含量进行逐天检测。
[0079]
实施例3中反应器所采用的进水为生活污水，取自北京工业大学家属院下水道，水质指标为：no
3-‑
n为3-5mg/l、nh
4+-n浓度为40-46mg/l、no
2-‑
n浓度为0.8-1.1mg/l。实验结果表明，在胞外呼吸型anammox工艺下，出水平均no
3-‑
n、no
2-‑
n、nh
4+-n浓度分别为1.89mg/l、0.32mg/l、0mg/l和0.49mg/l，满足城镇污水一级a排放标准。同时，经测定污泥停留时间仅为3-4天，anaob的生长速率提升至0.3μ
·
d-1
以上。
[0080]
对比例1
[0081]
为证实本发明有效改善anammox工艺所面临的no
2-‑
n稳定供给及no
3-‑
n副产物积累的难题。对比实施例2中步骤1(0-13天)和步骤2(55-60天)中反应器的处理性能，如表2所示。较正常“anammox”体系，本发明所提供的一种无需亚硝的胞外呼吸型厌氧氨氧化工艺，anammox体系no
2-‑
n/nh
4+-n比值逐步由1.3下降低0，污染物去除效率由87％提升至98％，出水no
3-‑
n含量由15mg/l下降至1mg/l。anaob的世代时间由12天下降至3天，有利于anaob的快速自我复制。
[0082]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

技术特征：
1.一种无需亚硝的胞外呼吸型厌氧氨氧化工艺，其特征在于，基于厌氧氨氧化工艺引入胞外电子受体，构建无需亚硝的胞外呼吸型厌氧氨氧化体系，实现单一氨氮的直接去除，无硝酸盐副产物生成；包括以下步骤：步骤1、构建no
2-‑
n和氨氮同步供应的厌氧氨氧化体系：将接种污泥投放入反应器中，然后将污水加入反应器中；所接种污泥满足以下条件中的至少一项：a、所述接种污泥体积占反应器总容积的20～40％；b、搅拌后形成的初始混合液中总的悬浮物的量为5000～6000mg/l；c、搅拌后形成的初始混合液中，挥发性悬浮物/总的悬浮物质量比为0.4～0.6，保证污泥中拥有充足有机微生物。该步骤中所述污水包含no
2-‑
n、nh
4+-n及含有微量元素的介质溶液；no
2-‑
n浓度为30-80mg/l，nh
4+-n配置浓度为no
2-‑
n浓度的1.2-1.3倍；利用去离子水配制含有5-20mg/lpo
43-‑
p、50-80mg/lcacl2、500-1000mg/lkhco3的微量元素营养液；其中，污水ph控制在7.0～7.5；步骤2、步骤1制得的厌氧氨氧化体系的基础上添加胞外电子受体物质；所述胞外电子受体物质投加量以质量计与反应器中污泥体积比为50-100mg/l；每间隔3-4天开始下调进水no
2-‑
n质量浓度5-10mg/l，直至进水no
2-‑
n质量为0mg/l，最终构建无需亚硝的胞外呼吸型厌氧氨氧化工艺；步骤3、对仅含氨污水进行处理。2.根据权利要求1所述的一种无需亚硝的胞外呼吸型厌氧氨氧化工艺，其特征在于，所述胞外电子受体物质种类包括三氧化铁(fe2o3)、四氧化三铁(fe3o4)、二氧化锰(mno2)、纤铁矿(γfeo(oh))或腐殖质。3.根据权利要求1所述的一种无需亚硝的胞外呼吸型厌氧氨氧化工艺，其特征在于，所述胞外电子受体物质需通过细菌胞外聚合物(eps)包埋预处理后投加，以确保厌氧氨氧化细菌与胞外受体间完整的、便捷的电子传输通道。4.根据权利要求3所述的一种无需亚硝的胞外呼吸型厌氧氨氧化工艺，其特征在于，待包埋外电子受体物质eps上清液中待包埋外电子受体物质的质量浓度为20-50mg/mleps上清液。5.根据权利要求4所述的一种无需亚硝的胞外呼吸型厌氧氨氧化工艺，其特征在于，eps上清液经过离心处理、冰水浴环境的超声处理、钠型阳离子交换树脂、第二离心处理、过滤环节由污水处理厂剩余污泥中提取。6.根据权利要求1-5任一项所述的胞外呼吸型厌氧氨氧化工艺，其特征在于：nh
4+-n释放电子通过细菌体内的电子外传路径到达细菌胞外受体，而非no
2-‑
n；详细的电子转移路径为：厌氧氨氧化细菌通过rieske/cytb bc1介导跨厌氧酶体转移，依托多血红素细胞色素(cyt a)的细胞质迁移，以及细胞表面电子跃迁，将nh
4+-n氧化电子直接运输到细胞外。

技术总结
一种无需亚硝的胞外呼吸型ANAMMOX工艺，属于水处理领域，克服亚硝供给困难、副产物积累限定生理脱氮极限等缺陷。本发明包括以下步骤：步骤1、构建常规ANAMMOX体系；步骤2、引入细菌胞外聚合物包埋处理的胞外电子受体，驯化并激发氨氮电子向细胞表面的直接传递，所选细菌胞外聚合物提取自污水处理厂剩余污泥，符合“以废治废”原则。步骤3、采用步骤2构建的胞外呼吸型ANAMMOX反应器对仅含氨污水进行处理。本发明详细提供了胞外电子受体筛选及与处理流程、详实的ANAMMOX电子外传路径，证实无亚硝供给下的脱氮可行性，极大地扩宽ANAMMOX工艺的应用场景，有助于单一ANAMMOX在主流城镇废水的直接实施。水的直接实施。水的直接实施。


技术研发人员：张莉 豆全浩 范润凝 杨嘉春
受保护的技术使用者：北京工业大学
技术研发日：2023.05.21
技术公布日：2023/8/6