一种大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体的检测试剂盒及其检测方法与流程

1.本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体的检测试剂盒及其检测方法。


背景技术：

2.大口黑鲈，俗称加州鲈，具有生长快、病害少、耐低温等特点，是我国重要的淡水养殖品种之一。2022年，国内大口黑鲈养殖总产量超过70万吨，养殖产量呈逐年增长趋势。大口黑鲈虹彩病毒可感染不同规格鱼，死亡率在10％～40％之间，苗期可达100％。对于该病的防治，目前尚无有效的药物或方案。
3.卵黄抗体是指鸟类(多指鸡)经特定抗原免疫后，产生相应的特异性抗体，并转运、储存于卵黄中，进而通过特定的提取技术从卵黄中获得高产量的特异性多克隆抗体。将病毒或者细菌制备成疫苗免疫蛋鸡后，从鸡蛋中提取的卵黄抗体，能有效中和病毒粒子或者杀灭病原菌，达到预防或者治疗疾病的效果。基于卵黄抗体本身的优势，比如成本低廉、产量高、绿色健康等，使得卵黄抗体具备替代抗生素发挥防控疾病作用的潜力。
4.近年来，已有多种水产病毒卵黄抗体的研究报道，例如对虾白斑综合征病毒、鲤鱼疱疹病毒、大口黑鲈弹状病毒。体内实验表明，卵黄抗体通过口服或者注射方式免疫实验动物后，显示出高效的抗病毒能力，能够显著提高养殖动物存活率。卵黄抗体为水产病毒病的防控提供了新的解决思路，可能是防控大口黑鲈虹彩病毒病的潜在手段。但目前尚无大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体的研究报道，也缺少大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体水平的评价方法，制约了卵黄抗体在大口黑鲈虹彩病毒病防控中的应用。因此，急需构建大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体水平的评估方法，助力大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体产品的开发与应用，从而为大口黑鲈虹彩病毒的防治提供解决方案，促进大口黑鲈的绿色健康养殖。


技术实现要素：

5.本发明第一方面的目的，在于提供一种大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体的制备方法。
6.本发明第二方面的目的，在于提供一种大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体。
7.本发明第三方面的目的，在于提供上述大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体的应用。
8.本发明第四方面的目的，在于提供一种试剂盒。
9.本发明第五方面的目的，在于提供一种大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体elisa检测方法。
10.本发明所采取的技术方案是：
11.本发明的第一方面，提供一种大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：
12.(1)将灭活的虹彩病毒作为抗原免疫蛋鸡，首次免疫105～107tcid50病毒，第2～3次免疫107tcid50病毒；
13.(2)免疫后采集蛋样，分离蛋黄，纯化得卵黄抗体。
14.优选地，大口黑鲈虹彩病毒的灭活方法为使用0.5～1.5
‰
β-丙内酯灭活。
15.优选地，所述灭活条件为2～6℃灭活70～74h，35～39℃水浴1～3h终止灭活。
16.优选地，所述抗原的制备方法包括：向灭活后的病毒液中加入表面活性剂，混匀，得水相抗原；然后加入白油，乳化，即得。
17.优选地，所述病毒液与表面活性剂的体积比为(20～28)：1。
18.优选地，所述表面活性剂包括吐温80。
19.优选地，所述水相抗原与白油的体积比为1：(1～3)。
20.优选地，所述纯化包括将蛋黄混匀后使用含有无水乙酸钠、冰醋酸和正辛酸水溶液将蛋黄液稀释2～3倍，加热混匀0.5～1.5h后，过滤。
21.本发明的第二方面，提供一种大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体，所述大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体由本发明第一方面所述方法制备。
22.本发明的第三方面，提供本发明第二方面所述大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体在以下至少一种中的应用：
23.(1)制备检测、预防或治疗大口黑鲈虹彩病毒感染引起的相关疾病的制剂；
24.(2)检测大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体或制备检测大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体的产品中的应用。
25.本发明的第三方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含：大口黑鲈虹彩灭活病毒、大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体、封闭液、酶标抗体、显色液、终止液、缓冲液、阳性对照、阴性对照、洗涤液。
26.本发明的第四方面，提供一种大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体elisa检测方法，包含以下步骤：
27.1)以大口黑鲈虹彩灭活病毒作为包被抗原包被酶标板、孵育、洗涤；
28.2)加入封闭液孵育、洗涤；
29.3)加入待检测卵黄抗体、阳性对照、阴性对照，孵育、洗涤；
30.4)添加酶标抗体反应后洗涤；
31.5)加入显色液反应后终止，使用酶标仪检测od450吸光度；
32.6)当待检测卵黄抗体od450/阴性对照od450≥2.1时的最高稀释滴度为该待检测样品效价。
33.优选地，所述孵育的条件为35～39℃，1～3h。
34.优选地，阴性对照、阳性对照临界值确定为阳性样品od450/阴性样品od450≥2.1时的最高稀释滴度为当次检测效价最高值，以此最高稀释滴度为标准，判定阳性对照结果是否成立。
35.优选地，所述阳性对照为第三次免疫28～32d后制备的大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体。
36.优选地，所述灭活病毒的制备包括：病毒增殖、冻干保存。
37.优选地，所述冻干保存时的冻干保护剂配方为海藻糖7～9％、人血清白蛋白0.5～1.5％、甘露醇0.5～1.5％、右旋糖苷(葡聚糖)1.5～2.5％、蔗糖0.5～1.5％，使用酸碱调节剂，将保护剂ph调至与病毒液一致。
38.优选地，所述酸碱调节剂包括0.5～1.5mol/l hcl。
39.优选地，所述病毒液与冻干保护剂1:(1～2)混合后，-60～-80℃冻干40～50h。
40.优选地，所述大口黑鲈虹彩病毒的增殖使用的是鳜鱼脑细胞系，病毒繁殖快滴度高。
41.优选地，步骤1)中所述灭活病毒的浓度为106～108tcid
50
/0.1ml，使用包被液进行稀释，稀释比例为1:80～120。
42.优选地，步骤2)中所述封闭液为包含4～6％牛血清蛋白的缓冲液。
43.优选地，所述缓冲液为pbs。
44.优选地，步骤3)中所述卵黄抗体及阳性、阴性对照分别做1:100～1:204800倍比稀释。
45.优选地，步骤4)中所述酶标抗体稀释倍数为40000～60000。
46.优选地，步骤4)中所述酶标抗体为酶标羊抗鸡抗体。
47.优选地，步骤4)中所述酶标抗体的反应条件为：35～39℃孵育40～60min。
48.优选地，步骤5)中所述显色液的反应条件为：35～39℃避光孵育5～15min。
49.优选地，所述洗涤液为含有0.4～0.6
‰
吐温-20的pbs。
50.优选地，所述洗涤次数为3～5次。
51.本发明的有益效果是：
52.本发明提供了一种大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体的制备方法，可以用于制备防治大口黑鲈虹彩病毒引起的疾病的药物，具有良好的应用前景。本发明还提供了一种大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体的elisa检测方法，将灭活虹彩病毒油乳剂疫苗免疫蛋鸡制备卵黄抗体，使用冻干剂将扩增的虹彩病毒冻干保存制备成标准品，通过筛选抗原包被浓度、稀释和孵育条件，建立了虹彩病毒卵黄抗体的elisa检测方法，并评估了方法的敏感性、重复性和特异性。
53.本发明提供的大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体的elisa检测方法操作简单，不需构建重组表达蛋白，直接使用灭活大口黑鲈虹彩病毒优化检测条件，解决了特异性差、敏感性低等检测方法的普遍问题；另外，该方法耗时短，可在一天内获得检测结果，适用于实时监测蛋鸡免疫过程中不同免疫阶段抗体的消减水平，有助于解决虹彩病毒卵黄抗体体外效价评估的问题，为虹彩病毒卵黄抗体免疫程序的筛选提供指导，进而对大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体的开发和应用奠定基础。
附图说明
54.图1灭活病毒液孵育的细胞(p1)和对照组(x)第七天的状态。
55.图2p1上清液孵育的细胞(p2)和对照组(x)第七天的状态。
具体实施方式
56.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
57.实施例1：大口黑鲈虹彩病毒的增殖与冻干保存
58.病毒的增殖：将实验室分离到的大口黑鲈虹彩病毒在鳜脑细胞系中进行传代扩培，收集90％以上病变后的细胞培养液，在-80℃条件下冻融2次后，离心去掉细胞碎片，获得大口黑鲈蛙虹彩病毒的病毒粗提液。
59.病毒滴度测定：将上述的100μl滤过液加入900μl无血清l15培养基稀释成10-1
，吸取100μl的10-1
病毒液加入900μl的l15培养基中稀释成10-2
，以此类推10-3
、10-4
、10-5
、10-6
、10-7
、10-8
、10-9
，每个浓度设置8个复孔，同时用不含病毒的纯培养基做空白对照。分别加入长满细胞的96孔板中，每孔100μl；28℃吸附2h，补加100μl的4％fbs l15培养基，继续28℃培养，每天观察细胞病变情况，持续一周。
60.病毒冻干：称取海藻糖1.6g、人血清白蛋白0.2g、甘露醇0.2g、右旋糖苷(葡聚糖)0.4g、蔗糖0.2g，加入20ml的pbs，使用磁力搅拌器充分溶解，使用1mol/l hcl，将保护剂ph调至与病毒液一致。吸取病毒液，按照1:1的比例将病毒液加入上述配制好的保护剂中，使用孔径0.22μm滤膜过滤后，分装入冻干瓶，-80℃冷冻2h以上。待冻干机温度达到-70℃时，将样品放置冻干机内，-70℃真空冷冻干燥45h后，取出样品，立即盖盖，并使用压盖机将铝片叠在胶塞上，防止漏气。同时取出3瓶样品，使用病毒5倍体积pbs立即复溶，并进行滴度测定，滴度测定方法同上。
61.病毒冻干结果：冻干45h后，冻干制品呈米白色，有发泡的情况，其余部分为疏松蜂窝状。冻干制品密封性好，37℃保存7d后，无吸潮塌陷现象，外观形状无明显变化。与冻干前病毒液(滴度1
×
10
7.89
tcid50/0.1ml)对比，冻干45h立即复溶病毒滴度为1
×
10
7.63
tcid50/0.1ml，病毒滴度下降1
×
10
0.26
tcid/ml，病毒含量下降1.8倍，即冻干45h过程，病毒损耗1.8倍；与37℃保存前对比，冻干45h后37℃保存7d后，病毒滴度为1
×
10
7.71
tcid50/0.1ml，病毒滴度上升1
×
10
0.08
tcid50/0.1ml，病毒含量上升1.2倍。
62.实施例2：大口黑鲈虹彩病毒的灭活
63.将冻干保存的病毒在室温下解冻，使用5倍体积的pbs复溶。取商品化β-丙内酯按照1:1000的比例多次加入病毒液中，将混均的病毒液置于4℃冰箱中灭活72h，每隔4h震荡混匀；灭活结束后将病毒液放置于37℃的水浴锅中水解2h；水解后取1ml在鳜鱼脑细胞上盲传2代，验证灭活效果，剩余的灭活病毒液用于制备油乳剂疫苗。
64.病毒灭活结果：用灭活病毒液孵育的细胞为盲传第一代(p1)，细胞形态正常(图1)；用p1上清液孵育的细胞称为盲传第二代(p2)，细胞形态正常且与对照组相似(图2)。
65.实施例3：大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体样品的制备
66.取灭活的虹彩病毒，按照灭活病毒：吐温80＝96：4的体积比，将吐温80加入灭活病毒液中，使用均质机混匀，制备成水相抗原；按照水相抗原：marcol52白油佐剂＝1：2的体积比，将水相抗原缓慢加入白油佐剂中，边加边使用均质机低速搅拌；待抗原完全加入佐剂中后，将均质机速度调整至8000rpm，连续作用10min，暂停机器5min防止疫苗过热，再次使用8000rpm连续作用10min，获得乳白色的油乳剂疫苗；取1ml疫苗3000rpm离心15min，疫苗不分层表示合格。将制备好的疫苗免疫200日龄海兰灰蛋鸡，连续免疫3次，首次免疫106tcid50病毒，第二次和第三次免疫107tcid50病毒，以仅免疫marcol52白油佐剂的蛋鸡作为阴性对照。每次免疫前一天采集蛋样，第三次免疫后每隔10天采集蛋样。对于采集的鸡蛋，无菌条件下分离蛋黄，蛋黄混匀后使用含有无水乙酸钠、冰醋酸和正辛酸水溶液将蛋黄液稀释2.5倍，加热混匀1h后，使用丙纶过滤布过滤获得卵黄抗体粗提液。
67.实施例4：筛选大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体阳性样品和阴性样品
68.通过对不同免疫批次的样品进行检测，使用棋盘法寻找阳性、阴性样品。
69.1)包被：以大口黑鲈虹彩灭活病毒(调整滴度至107tcid
50
/0.1ml)作为抗原，使用包被液(biopanda，cb-003)将上述抗原1:50、1:100、1:200稀释，将上述稀释后的抗原100μl/孔加入到酶标板中，4℃条件下孵育18h，弃包被液，洗涤液(含有0.5
‰
吐温-20的pbs)200μl/孔加入到酶标板中，洗涤3次，每次5min，拍干；
70.2)封闭：封闭液(含5％牛血清白蛋白的pbs溶液)200μl/孔加入酶标板中，37℃孵育2h，弃封闭液，洗涤液200μl/孔加入到酶标板中，洗涤3次，每次5min，拍干；
71.3)卵黄抗体作用条件：使用封闭液对辛酸法纯化后的抗体进行1:100倍稀释处理，得待检测抗体稀释混合液，100μl/孔添加待检测抗体稀释混合液，37℃条件下孵育1h后甩干，洗涤液洗涤3次，每次5min，拍干；
72.4)添加酶标抗体：将酶标羊抗鸡用封闭液按1:50000进行稀释，100μl/孔添加酶标二抗，37℃条件下孵育50min后甩干，洗涤液洗涤3次，每次5min，拍干；
73.5)底物显色：100μl/孔加入tmb底物显色液，37℃条件避光下孵育10min；
74.6)终止反应：50μl/孔加入终止液，终止显色反应，使用酶标仪od
450
读取数据；
75.7)阴、阳临界值确定：p/n(阳性样品od
450
/阴性样品od
450
)≥2.1时的最高稀释滴度为当次检测效价最高值；
76.8)结果判定：p/n(待检测样品od
450
/阴性样品od
450
)≥2.1时的最高稀释滴度为该待检测样品效价；
77.按照上述方法进行阳性、阴性样品筛选：评估一免，二免，三免10d、20d、30d免疫组蛋黄抗体效价(od
450
均值)。
78.表1
[0079][0080][0081]
综上所述，三免30d免疫组样品孔p/n≥2.1，暂选三免30d免疫组样品作为阳性对照，三免30d对照组作为阴性对照进行检测方法条件优化。
[0082]
实施例5：虹彩病毒卵黄抗体elisa检测方法的建立
[0083]
1、棋盘法确定最适抗原浓度
[0084]
1)包被：以大口黑鲈虹彩灭活病毒107tcid
50
/0.1ml作为抗原，使用包被液1:25、1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200进行稀释，将上述稀释后的抗原100μl/孔加入到酶标板中，4℃条件下孵育18h，弃包被液，洗涤液
200μl/孔加入到酶标板中，洗涤3次，每次5min，拍干；
[0085]
2)封闭：封闭液200μl/孔加入酶标板中，37℃孵育2h，弃封闭液，洗涤液200μl/孔加入到酶标板中，洗涤3次，每次5min，拍干；
[0086]
3)卵黄抗体作用条件：使用封闭液对阳性、阴性对照分别进行1:25、1:50、1:100、1:200倍稀释处理，得待检测抗体稀释混合液，100μl/孔添加待检测抗体稀释混合液，37℃条件下孵育1h后甩干，洗涤液进行洗涤3次，每次5min，拍干；
[0087]
4)添加酶标抗体：将酶标羊抗鸡用封闭液按1:50000进行稀释，100μl/孔添加酶标二抗混合液，37℃条件下孵育50min后甩干，洗涤液进行洗涤3次，每次5min，拍干；
[0088]
5)底物显色：100μl/孔加入tmb底物显色液，37℃条件避光下孵育10min；
[0089]
6)终止反应：50μl/孔加入终止液，终止显色反应，使用酶标仪od
450
读取数据；
[0090]
7)阴、阳临界值确定：p/n(阳性样品od
450
/阴性样品od
450
)≥2.1时的最高稀释滴度为当次检测效价最高值；
[0091]
8)结果判定：p/n(待检测样品od
450
/阴性样品od
450
)≥2.1时的最高稀释滴度为该待检测样品效价；
[0092]
按上述方法对抗原最适包被浓度进行筛选(od
450
均值)；
[0093]
表2
[0094][0095][0096]
9)p/n值
[0097]
表3
[0098][0099]
10)按照实验结果p/n值分析，选取p/n≥2.1的最高值阳性对照相对稀释比例最低时的条件，确定最适抗原工作浓度为105tcid50/0.1ml，抗体起始稀释倍数为100倍。
[0100]
2、最适包被条件摸索
[0101]
1)包被：以大口黑鲈虹彩灭活病毒107tcid
50
/0.1ml作为抗原，使用包被液1:100进行稀释，将上述稀释后的抗原混合液100μl/孔加入到酶标板中，分别以4℃18h、37℃1h、37℃2h、室温1h、室温2h条件下孵育，孵育结束后弃包被液，洗涤液200μl/孔加入到酶标板中，洗涤3次，每次5min，拍干；
[0102]
2)封闭：封闭液200μl/孔加入酶标板中，37℃孵育2h，弃封闭液，洗涤液200μl/孔加入到酶标板中，洗涤3次，每次5min，拍干；
[0103]
3)卵黄抗体作用条件：使用封闭液对阳性、阴性对照分别进行1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800倍稀释处理，得待检测抗体稀释液，100μl/孔添加待检测抗体稀释液，37℃条件下孵育1h后甩干，洗涤液洗涤3次，每次5min，拍干；
[0104]
4)添加酶标抗体：将酶标羊抗鸡用封闭液按1:50000进行稀释，100μl/孔添加酶标二抗混合液，37℃条件下孵育50min后甩干，洗涤液进行洗涤3次，每次5min，拍干；
[0105]
5)底物显色：100μl/孔加入tmb底物显色液，37℃条件避光下孵育10min；
[0106]
6)终止反应：50μl/孔加入终止液，终止显色反应，使用酶标仪od
450
读取数据；
[0107]
7)阴、阳临界值确定：p/n(阳性样品od
450
/阴性样品od
450
)≥2.1时的最高稀释滴度为当次检测效价最高值；
[0108]
8)结果判定：p/n(待检测样品od
450
/阴性样品od
450
)≥2.1时的最高稀释滴度为该待检测样品效价；
[0109]
按上述方法对抗原最适包被条件进行筛选(od
450
均值)；
[0110]
表4
[0111][0112]
表5
[0113][0114]
9)p/n值
[0115]
表6
[0116][0117][0118]
10)照实验结果p/n值分析，选择检测敏感性较高且相对节省时间的条件，37℃包被2h。
[0119]
3、最适封闭条件摸索
[0120]
1)包被：以保存的大口黑鲈虹彩灭活病毒107tcid
50
/0.1ml作为抗原，使用包被液
1:100进行稀释，将上述稀释后的抗原混合液100μl/孔加入到酶标板中，37℃孵育2h，孵育结束后弃包被液，洗涤液200μl/孔加入到酶标板中，洗涤3次，每次5min，拍干；
[0121]
2)封闭：封闭液200μl/孔加入酶标板中，分别以4℃18h、37℃1h、37℃2h、室温1h、室温2h条件下孵育，弃封闭液，洗涤液200μl/孔加入到酶标板中，洗涤3次，每次5min，拍干；
[0122]
3)卵黄抗体作用条件：使用封闭液对阳性、阴性对照分别进行1:25、1:50、1:100、1:200倍稀释处理，得待检测抗体稀释混合液，100μl/孔添加待检测抗体稀释混合液，37℃条件下孵育1h后甩干，洗涤液进行洗涤3次，每次5min，拍干；
[0123]
4)添加酶标抗体：将酶标羊抗鸡用含封闭液按1:50000进行稀释，100μl/孔添加酶标二抗混合液，37℃条件下孵育50min后甩干，洗涤液进行洗涤3次，每次5min，拍干；
[0124]
5)底物显色：100μl/孔加入tmb底物显色液，37℃条件避光下孵育10min；
[0125]
6)终止反应：50μl/孔加入终止液，终止显色反应，使用酶标仪od
450
读取数据；
[0126]
7)阴、阳临界值确定：p/n(阳性样品od
450
/阴性样品od
450
)≥2.1时的最高稀释滴度为当次检测效价最高值；
[0127]
8)结果判定：p/n(待检测样品od
450
/阴性样品od
450
)≥2.1时的最高稀释滴度为该待检测样品效价；
[0128]
按上述方法对封闭条件进行筛选(od
450
均值)；
[0129]
表7
[0130][0131]
表8
[0132]
[0133]
9)p/n值
[0134]
表9
[0135][0136]
10)照实验结果p/n值分析，选择选择检测敏感性较高且相对节省时间的条件，37℃封闭2h。
[0137]
4、elisa检测方法特异性验证
[0138]
1)取spf蛋鸡、免疫前蛋鸡、弹状病毒免疫蛋鸡所收集鸡蛋，经纯化处理后，应用上述优化后的试验条件，分别检测以上蛋黄抗体，并设立阳性、阴性样品组及空细胞包被组和不加抗体组作为空白对照。
[0139]
表10
[0140]
抗体od
450
均值结果阳性对照1.414+阴性对照0.099-空细胞包被组0.085-空白对照0.077-spf蛋鸡0.066-免疫前蛋鸡0.063-弹状病毒0.128-[0141]
2)除阳性对照外，与其他样品均无特异性反应。
[0142]
5、elisa检测方法重复性验证
[0143]
此方法目的为检测不同免疫期蛋黄抗体效价水平的消减规律，每次检测中以阳性对照的敏感性作为重复性验证的依据。
[0144]
实施例6：测试例
[0145]
取二免前、三免前、三免10天、三免20天、三免30天、三免40天的卵黄抗体样品，使用上述构建的检测方法，检测不同批次卵黄抗体样品的效价情况，结果显示，二免前、三免前和三免后10天效价水平低于1:100，无抗体产生，三免后20天检测到大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体效价，效价值为1:3200，三免后30天至三免后40天效价处于上升水平，效价值分别为1:6400和1:12800，阳性对照效价稳定，值为1:6400。检测方法可用于监测大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗免疫蛋鸡后，特异性卵黄抗体水平的变化规律，确定制备该卵黄抗体产品的高
效免疫程序及高免蛋收集时间。
[0146]
表11
[0147][0148][0149]
表12
[0150]
[0151][0152]
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

技术特征：
1.一种大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：(1)将灭活的虹彩病毒作为抗原免疫蛋鸡，首次免疫105～107tcid50病毒，第2～3次免疫106～108tcid50病毒；(2)免疫后采集蛋样，分离蛋黄，纯化得卵黄抗体。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述抗原的制备方法包括：向灭活后的病毒液中加入表面活性剂，混匀，得水相抗原；然后加入白油，乳化，即得；优选地，所述病毒液与表面活性剂的体积比为(20～28)：1，所述水相抗原与白油的体积比为1：(1～3)。3.一种大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体，其特征在于，所述卵黄抗体由权利要求1～2任一项所述方法制备。4.权利要求3所述的大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体在以下至少一种中的应用：(1)制备检测、预防或治疗大口黑鲈虹彩病毒感染引起的相关疾病的制剂；(2)检测大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体或制备检测大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体的产品中的应用。5.一种试剂盒，所述试剂盒包含：大口黑鲈虹彩灭活病毒、大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体、封闭液、酶标抗体、显色液、终止液、缓冲液、阳性对照、阴性对照、洗涤液。6.一种大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体elisa检测方法，包含以下步骤：1)以大口黑鲈虹彩灭活病毒作为包被抗原包被酶标板、孵育、洗涤；2)加入封闭液后孵育，洗涤；3)加入待检测卵黄抗体、阳性对照、阴性对照样品，孵育、洗涤；4)添加酶标抗体反应后洗涤；5)加入显色液反应后终止，使用酶标仪检测od450吸光度；6)当待检测样品od450/阴性样品od450≥2.1时的最高稀释滴度为该待检测样品效价；优选地，所述孵育的条件为35～39℃，1～3h。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述灭活病毒的制备包括：病毒增殖后置于冻干保护剂中冻干保存；优选地，病毒增殖所用的细胞系为鳜鱼脑细胞系；优选地，所述病毒液与冻干保护剂的体积比1:(1～2)；优选地，所述冻干保护剂包含海藻糖7～9％、人血清白蛋白0.5～1.5％、甘露醇0.5～1.5％、右旋糖苷1.5～2.5％、蔗糖0.5～1.5％。8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述灭活病毒的浓度为106～108tcid50/0.1ml，稀释比例为1:(80～120)；优选地，所述封闭液为包含4～6％牛血清蛋白的缓冲液。9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述酶标抗体稀释倍数为40000～60000；优选地，所述酶标抗体的反应条件为：35～39℃孵育40～60min；优选地，所述显色液的反应条件为：35～39℃避光孵育5～15min。10.根据权利要求6～9任一项所述的方法，其特征在于，所述洗涤液为含有0.4～0.6
‰
吐温的pbs；优选地，所述洗涤次数为3～5次。

技术总结
本发明公开了一种大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体的检测试剂盒及其检测方法。本发明提供的大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体的ELISA检测方法操作简单，不需构建重组表达蛋白，直接使用灭活大口黑鲈虹彩病毒优化检测条件，解决了特异性差、敏感性低等检测方法的普遍问题；另外，该方法耗时短，可在一天内获得检测结果，适用于实时监测蛋鸡免疫过程中不同免疫阶段抗体的消减水平，有助于解决虹彩病毒卵黄抗体体外效价评估的问题，为虹彩病毒卵黄抗体免疫程序的筛选提供指导，进而对大口黑鲈虹彩病毒卵黄抗体的开发和应用奠定基础。的开发和应用奠定基础。


技术研发人员：仲颖 李硕 陈静妮 赵立宁 罗明菊 郑果
受保护的技术使用者：广东海大集团股份有限公司
技术研发日：2023.04.07
技术公布日：2023/8/5