咖啡银皮提取物在制备代谢酶抑制剂中的用途

1.本发明属于咖啡银皮提取物制备及应用领域，特别涉及一种咖啡银皮提取物作为α-糖苷酶、α-淀粉酶和黄嘌呤氧化酶天然抑制剂的用途，本发明为预防、改善或治疗2型糖尿病和高尿酸血症提供了应用方案。


背景技术：

2.血糖控制被认为是二型糖尿病的有效方法。α-糖苷酶和α-淀粉酶能够通过水解α-1,4-葡萄糖苷键催化碳水化合物的消化，因此α-糖苷酶和α-淀粉酶抑制剂的使用近年来被认为是一种有效改善二型糖尿病的方式而受到广泛关注。但是，一些临床上使用的α-糖苷酶和α-淀粉酶抑制剂如阿卡波糖、伏格列波糖，不仅费用昂贵，还伴随着许多副作用，如腹泻、腹胀、肝病和腹部痉挛等。因此，开发一些价格低廉，易获得，无副作用的天然植物提取物作为α-糖苷酶和α-淀粉酶抑制剂是很有必要的。高尿酸血症的典型表现是尿酸含量升高，会导致痛风、慢性肾脏疾病、高血压、糖尿病、溶血性疾病、动脉粥样硬化等。尿酸是由关键酶黄嘌呤氧化酶催化次黄嘌呤和黄嘌呤生成，因此，抑制黄嘌呤氧化酶活性是缓解高尿酸血症的主要方法之一。目前临床使用的黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇和非布索坦等虽能有效抑制体内黄嘌呤氧化酶活性，降低体内尿酸含量，但长期服用会出现腹泻、皮疹、头晕等副作用。因此有必要研发新的、安全的天然植物来源的黄嘌呤氧化酶抑制剂。
3.咖啡银皮是包裹咖啡豆的最后一层外皮，会在烘焙时脱落。研究发现，咖啡银皮具有良好的抗菌抗氧化活活性。在咖啡的烘焙过程中，会产生大量的工业废弃物，特别是咖啡银皮。因此，有必要开发食品加工副产物的潜在应用，提高其经济价值，目前尚未有关于咖啡银皮提取物对α-糖苷酶、α-淀粉酶和黄嘌呤氧化酶抑制的相关报道。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种咖啡银皮提取物的新用途，即其在制备α-糖苷酶、α-淀粉酶和黄嘌呤氧化酶等代谢酶天然抑制剂中的应用，通过实验证明采用本发明提取方法所获得的咖啡银皮提取物能够有效地抑制α-糖苷酶、α-淀粉酶、黄嘌呤氧化酶活性，本发明为进一步开发利用咖啡银皮提供了新的途径。
5.本发明目的通过以下技术方案实现：1、咖啡银皮提取物的制备将咖啡银皮冻干粉碎过40目筛筛分，在咖啡银皮粉末中添加石油醚脱脂，800g-1200g下离心，收集沉淀，沉淀物用甲醇-丙酮水溶液提取，500g-1500g下离心，收集上清液，浓缩去除溶剂后，用盐酸溶液将上清液ph调节为1-4，用乙醚-乙酸乙酯混合液萃取，直至有机相无色澄清后，收集合并有机相，旋转蒸发冷冻干燥制得；所述甲醇-丙酮水溶液是体积浓度50-70%甲醇水溶液和体积浓度50-70%丙酮水溶液按体积比1:2-2:1的比例混合制得；乙醚-乙酸乙酯混合液是乙醚和乙酸乙酯按体积比1:2-2:1的比例混合制得；调节ph的盐酸溶液的浓度为2-6mol/l；
石油醚脱脂是添加石油醚后超声处理15-30min；2、咖啡银皮提取物活性检测本发明对咖啡银皮提取物抑制体外α-糖苷酶、α-淀粉酶和黄嘌呤氧化酶活性进行了研究，实验结果显示本发明方法制得的咖啡银皮提取物能显著抑制α-糖苷酶、α-淀粉酶和黄嘌呤氧化酶的活性；本发明所述的咖啡银皮提取物的用途，是将咖啡银皮提取物用作制备α-糖苷酶、α-淀粉酶和黄嘌呤氧化酶天然抑制剂，用于制备药物或食品，或用作原料。
6.本发明所述的代谢酶抑制剂的成分（或有效成分）为咖啡银皮提取物，还可以加入一种或多种药物或食品可接受的辅料，以改善药物、食品的吸收效果或便于使用，制成适宜的使用剂型，如制成胶囊或丸剂、粉剂、片剂、粒剂、口服液和注射液等。
7.与现有技术相比，本发明具有如下优点：1、本发明制得的咖啡银皮提取物在体外对α-糖苷酶、α-淀粉酶和黄嘌呤氧化酶活性具有抑制作用，为咖啡银皮的应用提供了一个新的领域；2、咖啡银皮是咖啡烘焙副产物，原料易得，咖啡银皮来自天然植物，安全性高；咖啡银皮提取物来自于可食用的天然植物原材料，制备工艺简单，市场前景可观、蕴藏着较好的社会和经济价值。
附图说明
8.图1为不同浓度咖啡银皮提取物对α-糖苷酶的抑制作用；图2为不同浓度咖啡银皮提取物对α-淀粉酶的抑制作用；图3为不同浓度咖啡银皮提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制作用；图中不同字母表示存在显著性差异（p《0.05）。
实施方式
9.下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但这些实施例不得用于解释对本发明的限制；下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售；在阅读了本发明的记载以后，本领域的科技人员对其等效的各种改动、修改和修饰，都属于本发明权利要求所限定的范围；实施例1：咖啡银皮提取物的制备将采集自云南保山市的咖啡银皮冻干打粉，过60目筛，获得咖啡银皮粉，在50g咖啡银皮粉中添加石油醚250ml，超声处理30min脱脂，800g离心10min，收集沉淀，沉淀物中加入甲醇-丙酮水溶液（体积浓度70%甲醇水溶液和体积浓度70%丙酮水溶液按体积比1:1的比例混合配制）提取30min，800g下离心10min，收集上清液，在40℃下浓缩去除上清液中的有机试剂后，用6mol/l盐酸调节ph=2，在调节ph后的溶液中添加乙醚-乙酸乙酯混合液（乙醚和乙酸乙酯按体积比1: 1的比例混合制得）萃取，直至有机相无色澄清后，收集合并有机相，40℃下旋蒸，浓缩液冷冻干燥，制得咖啡银皮提取物1.17g，获取率为2.34%。
10.实施例2：咖啡银皮提取物对α-糖苷酶和α-淀粉酶和黄嘌呤氧化酶抑制作用实验1、对α-糖苷酶酶活测定以实施例1制得的咖啡银皮提取物为实验样品，并用ph为6.8、浓度为0.2mol/l的
磷酸缓冲盐溶液稀释制得浓度为20、30、40、50、60μg/ml的样品液；配制1u/ml的α-糖苷酶溶液，用ph为6.8、浓度为0.05mol/l的磷酸缓冲盐溶液（pbs）配制5mmol/l的对硝基苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷(pnpg)溶液作为底物反应液；设置空白组、空白对照组、样品组、样品对照组；空白组为60μl pbs溶液+20μl pnpg溶液；空白对照组为40μl pbs溶液+20μl α-糖苷酶溶液+20μl pnpg溶液；样品组为20μl pbs溶液+20μl的样品溶液＋20μl α-糖苷酶溶液+20μl pnpg溶液；样品对照组为40μl pbs溶液+20μl的样品溶液+20μl的pnpg溶液；每组设置3个复孔，整个反应体系在37℃孵育30min，在405nm下测量吸光值；具体计算公式如下：抑制率%=（（b
1-b2）/（a
2-a1））
×
100公式中a1代表空白组的吸光度值，a2代表空白对照组的吸光度值，b1代表样品组的吸光度值，b2代表样品对照组的吸光度值；结果见图1，从图中可以看出随着咖啡银皮提取物浓度的增加，其对α-糖苷酶的抑制作用逐渐增强，咖啡银皮提取物对α-糖苷酶的ic50值为40.28
±
1.40μg/ml。
11.2、对α-淀粉酶活的测定以实施例1制得的咖啡银皮提取物为实验样品，并用ph为6.9、浓度为0.2mol/l的磷酸缓冲盐溶液稀释制得浓度为40、80、120、160、200μg/ml的样品液；配制2u/ml的α-淀粉酶溶液，用ph为6.9、浓度为0.2 mol/l的磷酸缓冲盐溶液（pbs）配制1%的淀粉溶液作为底物反应液；设置空白组、空白对照组、样品组、样品对照组；空白组为50μl pbs溶液+50μl淀粉溶液；空白对照组为25μl pbs溶液+25μl α-淀粉酶溶液+50μl淀粉溶液；样品组为25μl样品溶液+25μl α-淀粉酶溶液+50μl淀粉溶液；样品对照组为25μl pbs溶液+25μl样品溶液+50μl淀粉溶液；每组设置3个复孔，整个反应体系在37℃孵育10min后加入200μl的二硝基水杨酸溶液，并在沸水浴中保持15min，冷却至室温后在540nm下测量吸光值；具体计算公式如下：抑制率%=（（b
1-b2）/（a
2-a1））
×
100公式中a1代表空白组的吸光度值，a2代表空白对照组的吸光度值，b1代表样品组的吸光度值，b2代表样品对照组的吸光度值；结果见图2，从图中可以看出随着咖啡银皮提取物浓度的增加，其对α-淀粉酶的抑制作用逐渐增强，咖啡银皮提取物对α-淀粉酶的ic50值为114.52
±
3.62μg/ml。
12.3、对黄嘌呤氧化酶活的测定以实施例1制得的咖啡银皮提取物为实验样品，并用ph为7.5、浓度为0.2mol/l的磷酸缓冲盐溶液稀释制得浓度为25、50、100、150、200μg/ml的样品液；配制0.1u/ml的黄嘌呤氧化酶溶液，用ph为7.5、浓度为0.2mol/l的磷酸缓冲盐溶液（pbs）配制0.8mmol/l的黄嘌呤溶液作为底物反应液；设置空白组、空白对照组、样品组、样品对照组；空白组为300μl pbs溶液+100μl黄嘌呤溶液；空白对照组为200μl pbs溶液+100μl黄嘌呤氧化酶溶液+100μl黄嘌呤溶液；样品组为100μl pbs溶液+100μl的样品溶液＋100μl黄嘌呤氧化酶溶液+100μl的黄嘌呤溶液；样品对照组为200μl pbs溶液+100μl样品溶液+100μl黄嘌呤溶液；每组设置3个复孔，整个反应体系在37℃孵育30min，在295nm下测量吸光
值；具体计算公式如下：抑制率%=（（b
1-b2）/（a
2-a1））
×
100公式中a1代表空白组的吸光度值，a2代表空白对照组的吸光度值，b1代表样品组的吸光度值，b2代表样品对照组的吸光度值。
13.结果见图3，从图中可以看出随着咖啡银皮提取物浓度的增加，其对黄嘌呤氧化酶抑制效果逐渐增强，咖啡银皮提取物对黄嘌呤氧化酶的ic50值为34.05
±
3.10μg/ml；由此可以看出咖啡银皮提取物对α-糖苷酶、α-淀粉酶和黄嘌呤氧化酶活性有很好的抑制作用。

技术特征：
1.一种咖啡银皮提取物在制备代谢酶抑制剂中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：咖啡银皮提取物是将咖啡银皮冻干粉碎过筛，在咖啡银皮粉末中添加石油醚脱脂，离心，收集沉淀，沉淀物用甲醇-丙酮水溶液提取，离心，收集上清液，浓缩去除溶剂后，用盐酸溶液将上清液ph调节为1-4，用乙醚-乙酸乙酯混合液萃取，直至有机相无色澄清后，收集合并有机相，旋转蒸发冷冻干燥制得。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：代谢酶包括α-糖苷酶、α-淀粉酶、黄嘌呤氧化酶。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：甲醇-丙酮水溶液是体积浓度40-70%甲醇水溶液和体积浓度40-70%丙酮水溶液按体积比1:2-2:1的比例混合制得。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：乙醚-乙酸乙酯混合液是乙醚和乙酸乙酯按体积比1:2-2:1的比例混合制得。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：石油醚脱脂是添加石油醚后超声处理20-30min。

技术总结
本发明公开了一种咖啡银皮提取物的新用途，即其在制备α-糖苷酶和α-淀粉酶和黄嘌呤氧化酶天然抑制剂中的应用；所述咖啡银皮提取物是将咖啡银皮冻干粉碎过筛，经石油醚脱脂后离心去除上清液，沉淀物用甲醇-丙酮水溶液提取，离心收集上清液，旋转蒸发浓缩去除溶剂，用盐酸调节上清液的pH，用乙醚-乙酸乙酯混合液萃取，直至有机相无色澄清后，收集合并有机相，旋转蒸发除去有机试剂并冷冻干燥制得；本发明咖啡银皮提取物在体外对α-糖苷酶、α-淀粉酶和黄嘌呤氧化酶活性具有抑制活性，本发明中咖啡银皮提取物作为代谢酶天然抑制剂具有较好的开发利用前景。的开发利用前景。的开发利用前景。


技术研发人员：蔡圣宝 董师宇 熊文云 郑靖义 马爽
受保护的技术使用者：昆明理工大学
技术研发日：2023.01.13
技术公布日：2023/8/5