液体酶制剂的制作方法

1.本发明涉及一种液体酶制剂。更具体而言，本发明涉及活性稳定性优异的蛋白质脱酰胺酶的液体酶制剂。


背景技术：

2.作为对蛋白质中的谷氨酰胺残基和天冬酰胺残基的γ-酰胺基和β-酰胺基进行脱酰胺的酶，如专利文献1等中记载的那样，已知有来源于粘金黄杆菌(chryseobacterium gleum)jcm2410株的蛋白质谷氨酰胺酶和来源于解朊金黄杆菌(chryseobacterium proteolyticum)9670株的蛋白质谷氨酰胺酶。这样的蛋白质脱酰胺酶的酶制剂制品目前仅以粉末形态市售。
3.关于酶制剂，一般而言，如果考虑到除尘和处理这一点，则与粉末形态相比，优选为液体形态。因此，对各种酶研究将酶制剂以液态形态制剂化的技术。例如，专利文献2中提出了一种液体酶制剂，其特征在于，在多元醇-水悬浊液中包含至少1种乳蛋白交联和/或修饰酶，所述多元醇-水悬浊液包含25％～100％(w/w)的多元醇，具有4.4～5.1范围内的ph值。具体而言，在专利文献2中，发现在ph5.2中的转谷氨酰胺酶的稳定性低，基于该见解，公开了ph4.4～4.8的甘油-水悬浊液中的转谷氨酰胺酶制剂、ph4.6的山梨醇-水悬浊液中的转谷氨酰胺酶制剂的稳定性提高，与此同时，还公开了ph4.6的甘油-水悬浊液中的谷氨酰胺酶制剂和ph4.6的甘油-水悬浊液中的蛋白质谷氨酰胺酶制剂。现有技术文献专利文献
4.专利文献1：国际公开第2010/029685号专利文献2：国际公开第2013/064736号


技术实现要素：

发明所要解决的技术问题
5.专利文献2中，对于转谷氨酰胺酶制剂的液体酶制剂研究了稳定性，另一方面，对于蛋白质脱酰胺酶的液体酶制剂，仅公开了制剂处方，对于该酶的稳定性没有进行充分的研究。
6.因此，本发明的目的在于提供一种活性稳定性优异的蛋白质脱酰胺酶的液体酶制剂。用于解决技术问题的技术方案
7.本发明人进行了深入研究，结果发现，通过调整为ph5.5以上且配合30w/v％以上的山梨醇的新的配方，蛋白质脱酰胺酶的活性稳定性提高。本发明是基于该见解而完成的。本发明包括以下揭示的发明。
8.项1.一种液体酶制剂，其包含蛋白质脱酰胺酶和30w/v％以上的山梨醇，ph为5.5以上。
项2.根据项1所述的液体酶制剂，其中，所述山梨醇的含量为65w/v％以下。项3.根据项1或2所述的液体酶制剂，其中，所述液体酶制剂的ph为8.2以下。项4.根据项1～3中任一项所述的液体酶制剂，其中，所述液体酶制剂还包含亚硫酸盐、硫代硫酸盐和/或焦硫酸盐。项5.根据项1～4中任一项所述的液体酶制剂，其中，蛋白质脱酰胺酶活性为0.1～10000u/ml。项6.根据项1～5中任一项所述的液体酶制剂，其中，所述蛋白质脱酰胺酶来源于解朊金黄杆菌。项7.一种蛋白质脱酰胺酶的液体酶制剂的酶活性稳定剂，其包含山梨醇作为有效成分，在ph5.5以上的蛋白质脱酰胺酶的液体酶制剂中以30w/v％以上的浓度使用。项8.根据项7所述的蛋白质脱酰胺酶的液体酶制剂的酶活性稳定剂，其中，还包含亚硫酸盐、硫代硫酸盐和/或焦硫酸盐。项9.一种蛋白质脱酰胺酶的液体酶制剂的沉淀抑制剂，其包含山梨醇作为有效成分，在ph5.5以上的蛋白质脱酰胺酶的液体酶制剂中以30w/v％以上的浓度使用。发明效果
9.根据本发明，提供一种活性稳定性优异的蛋白质脱酰胺酶的液体酶制剂。
附图说明
10.图1是试验例2中得到的蛋白质脱酰胺酶(蛋白质谷氨酰胺酶：pg)的液体酶制剂的活性稳定性的试验结果。
具体实施方式
11.[1.液体酶制剂]本发明的液体酶制剂的特征在于，包含蛋白质脱酰胺酶和30w/v％以上的山梨醇，ph为5.5以上。以下，对本发明的液体酶制剂进行详细说明。
[0012]
[1-1.蛋白质脱酰胺酶]蛋白质脱酰胺酶是显示不伴有肽键切断和蛋白质交联的分解蛋白质的含酰胺基的侧链的作用的酶，其种类和来源等没有特别限定。另外，只要上述作用为主要活性，也可以进一步具有伴随有肽键切断和蛋白质交联的分解蛋白质的含酰胺基的侧链的作用。作为蛋白质脱酰胺酶的例子，可举出将蛋白质中的谷氨酰胺残基进行脱酰胺化，转化为谷氨酸的酶(例如蛋白质谷氨酰胺酶)、以及将蛋白质中的天冬酰胺残基进行脱酰胺化，转化为天冬氨酸的酶(例如蛋白质天冬酰胺酶)。作为蛋白质脱酰胺酶的更具体的例子，可举出jp2000-50887a、jp2001-218590a、wo2006/075772a1中公开的来源于金黄杆菌(chryseobacterium)属、黄杆菌(flavobacterium)属、稳杆菌(empedobacter)属、鞘氨醇杆菌(sphingobacterium)属、金杆菌属(aureobacterium)属或类香味菌(myroides)属的蛋白质脱酰胺酶，wo2015/133590中公开的来源于luteimicrobium属、壤霉菌(agromyces)属、微杆菌(microbacterium)属、或赖氏菌(leifsonia)属的蛋白质脱酰胺酶、以及来源于金黄杆菌属的蛋白质谷氨酰胺酶的市售品。作为这些蛋白质脱酰胺酶，可以单独使用1种，也可以组合使用多种。
[0013]
在这些蛋白质脱酰胺酶中，从制成活性稳定性更优异的液体酶制剂的观点出发，优选举出来源于金黄杆菌属的蛋白质脱酰胺酶，更优选举出来源于金黄杆菌属的蛋白质谷氨酰胺酶，进一步优选举出来源于解朊金黄杆菌属的蛋白质谷氨酰胺酶。
[0014]
蛋白质脱酰胺酶可由成为上述蛋白质脱酰胺酶的来源的微生物的培养液制备。作为具体的制备方法，可举出从上述微生物的培养液或菌体回收蛋白质脱酰胺酶的方法。例如，在使用蛋白质脱酰胺酶分泌型微生物的情况下，可根据需要预先通过过滤、离心处理等从培养液中回收菌体后，对酶进行分离和/或纯化。另外，在使用蛋白质脱酰胺酶非分泌型微生物的情况下，可根据需要预先从培养液回收菌体后，通过加压处理、超声波处理等破碎菌体而使酶露出后，对酶进行分离和/或纯化。作为酶的分离和/或纯化方法，可没有特别限制地使用公知的蛋白质分离和/或纯化方法，例如可举出离心分离法、uf浓缩法、盐析法、使用离子交换树脂等的各种色谱法等。
[0015]
作为本发明的液体酶制剂中的蛋白质脱酰胺酶的含量，没有特别限定，例如可举出0.1～10000u/ml、1～5000u/ml、10～2500u/ml、50～1000u/ml，优选为100～800u/ml，更优选为150～700u/ml，进一步优选为250～600u/ml、250～500u/ml，更进一步优选为300～400u/ml。
[0016]
关于蛋白质脱酰胺酶的活性，将苄氧羰基-l-谷氨酰胺酰甘氨酸(z-gln-gly)作为底物，将1分钟内游离1μmol的氨的酶量作为1个单位(1u)。
[0017]
[1-2.山梨醇]本发明的液体酶制剂含有山梨醇。山梨醇是为了使蛋白质脱酰胺酶的活性进行活性稳定化而配合的。
[0018]
从得到所期望的活性稳定性的观点出发，本发明的液体酶制剂中的山梨醇的含量为30w/v％以上。另外，在本发明的液体酶制剂中，关于每1u蛋白质脱酰胺酶的山梨醇的使用量，根据蛋白质脱酰胺酶和山梨醇的各含量而定，但从得到所期望的活性稳定性的观点出发，优选举出0.8mg以上。
[0019]
从表现出更优异的活性稳定性的观点出发，本发明的液体酶制剂中的山梨醇的含量有时优选为35w/v％以上或38w/v％以上。同样地，从表现出更优异的活性稳定性的观点出发，本发明的液体酶制剂中的每1u蛋白质脱酰胺酶的山梨醇的使用量有时优选为0.97mg以上或1mg以上。作为符合这些情况的例子，可举出本发明的液体酶制剂的ph(25℃下的ph值。以下相同。)为5.8～8.2，优选为6.0～8.0的情况。
[0020]
进而，从表现出更优异的活性稳定性的观点出发，本发明的液体酶制剂中的山梨醇的含量有时优选为45w/v％以上或48w/v％以上。同样地，从表现出更优异的活性稳定性的观点出发，本发明的液体酶制剂中的每1u蛋白质脱酰胺酶的山梨醇的使用量有时优选为1.2mg以上或1.3mg以上。作为符合这些情况的例子，可举出本发明的液体酶制剂的ph为6.5～7.5、优选为6.8～7.2、进一步优选为6.9～7.1的情况。
[0021]
作为本发明的液体酶制剂中的山梨醇的含量范围的上限，没有特别限定，从表现出更优异的活性稳定性的观点和/或易制备性的观点出发，例如可举出65w/v％以下，优选为60w/v％以下，更优选为57w/v％以下，进一步优选为55w/v％以下，进一步优选为52w/v％以下。同样地，作为本发明的液体酶制剂中的每1u蛋白质脱酰胺酶的山梨醇的使用量范围的上限，没有特别限定，但从表现出更优异的活性稳定性的观点和/或易制备性的观点出
发，例如可举出1.8mg以下、优选为1.67mg以下、更优选为1.59mg以下、进一步优选为1.53mg以下、进一步优选为1.4mg以下。
[0022]
从表现出更优异的活性稳定性的观点出发，作为本发明的液体酶制剂中的山梨醇的含量范围的上限，有时优选为50w/v％以下、更优选为47w/v％以下，进一步优选为45w/v％以下、进一步优选为42w/v％以下。同样地，从表现出更优异的活性稳定性的观点出发，作为本发明的液体酶制剂中的每1u蛋白质脱酰胺酶的山梨醇的使用量范围的上限，有时优选为1.4mg以下、更优选为1.3mg以下、进一步优选为1.25mg以下、更进一步优选为1.16mg以下。作为符合这些情况的例子，可举出本发明的液体酶制剂的ph为5.5～8.0、优选为5.5～7.2、更优选为5.8以上且小于6.5、进一步优选为5.9～6.3、更进一步优选为6.0～6.2的情况。
[0023]
在本发明的特定方式中，液体酶制剂中的30w/v％以上的山梨醇除了活性的稳定化以外，有时以抑制沉淀为目的进行配合。在该方式中，从提高沉淀抑制效果的观点出发，作为本发明的液体酶制剂中的山梨醇的含量，可举出优选为38w/v％以上或45w/v％以上、更优选为48w/v％以上或55w/v％以上、进一步优选为58w/v％以上。同样地，在本发明的特定方式中，液体酶制剂中的每1u蛋白质脱酰胺酶0.8mg以上的山梨醇除了活性的稳定化以外，有时以抑制沉淀为目的进行配合。在该方式中，从提高沉淀抑制效果的观点出发，作为本发明的液体酶制剂中的每1u蛋白质脱酰胺酶的山梨醇的使用量，优选为1mg以上或1.25mg以上，更优选为1.3mg以上或1.5mg以上，进一步优选为1.6mg以上。作为符合这些方式的例子，可举出本发明的液体酶制剂的ph为5.5以上且小于6.75、更优选为5.5～6.5的情况。
[0024]
另外，在本发明的另一特定方式中，本发明的液体酶制剂中的38w/v％以上或45w/v％以上的山梨醇除了活性的稳定化以外，有时也以抑制沉淀为目的进行配合。在该方式中，从提高沉淀抑制效果的观点出发，作为本发明的液体酶制剂中的山梨醇的含量，可举出优选为48w/v％以上或55w/v％以上，更优选为58w/v％以上。同样地，在本发明的另一特定方式中，本发明的液体酶制剂中的每1u蛋白质脱酰胺酶1mg以上或1.25mg以上的山梨醇除了活性的稳定化以外，有时也以抑制沉淀为目的进行配合。在该方式中，从提高沉淀抑制效果的观点出发，作为本发明的液体酶制剂中的每1u蛋白质脱酰胺酶的山梨醇的使用量，可举出优选为1.3mg以上或1.5mg以上，更优选为1.6mg以上。作为符合这些方式的例子，可举出本发明的液体酶制剂的ph为6.75以上且小于7.5、更优选为6.8～7.2的情况。
[0025]
进而，在本发明的又一特定方式中，本发明的液体酶制剂中的48w/v％以上或55w/v％以上的山梨醇除了活性的稳定化以外，有时也以抑制沉淀为目的进行配合。在该方式中，从提高沉淀抑制效果的观点出发，作为本发明的液体酶制剂中的山梨醇的含量，优选举出58w/v％以上。同样地，在本发明的另一特定方式中，本发明的液体酶制剂中的每1u蛋白质脱酰胺酶1.3mg以上或1.5mg以上的山梨醇，除了活性的稳定化以外，有时也以抑制沉淀为目的进行配合。在该方式中，从提高沉淀抑制效果的观点出发，作为本发明的液体酶制剂中的每1u蛋白质脱酰胺酶的山梨醇的使用量，优选举出1.6mg以上。作为符合这些方式的例子，可举出本发明的液体酶制剂的ph为7.5以上的情况。
[0026]
[1-3.亚硫酸盐、硫代硫酸盐、以及焦硫酸盐]从表现出更优异的活性稳定性的观点出发，本发明的液体酶制剂进一步优选包含
亚硫酸盐、硫代硫酸盐和/或焦硫酸盐作为规定的盐。作为这些规定的盐，具体而言，可举出碱金属盐(钾盐、钠盐等)、碱土类金属盐(钙盐等)的金属盐。这些规定的盐可以单独使用1种，也可以组合使用多种。
[0027]
其中，从进一步表现出优异的活性稳定性的观点出发，更优选亚硫酸盐和焦硫酸盐，进一步优选亚硫酸盐，或更优选碱金属盐，进一步优选钠盐。进而，从表现出特别优异的活性稳定性的观点出发，特别优选亚硫酸碱金属盐，最优选亚硫酸钠。
[0028]
在本发明的液体酶制剂包含上述规定的盐的情况下，作为该规定的盐的配合量没有特别限定，只要根据应该赋予的活性稳定化的提高效果适当设定即可，例如可举出0.01～2w/v％，优选为0.03～1w/v％，优选为0.04～0.8w/v％，更优选为0.06～0.6w/v％或0.08～0.6w/v％，进一步优选为0.15～0.55w/v％、0.2～0.55w/v％、0.3～0.55w/v％、或0.4～0.55w/v％。或者，作为每1u蛋白质脱酰胺酶的该规定的盐的配合量，例如可举出0.00025～0.05mg，优选为0.0008～0.026mg，优选为0.001～0.023mg，更优选为0.0015～0.017mg或0.002～0.017mg，进一步优选为0.004～0.015mg、0.005～0.015mg、0.008～0.015mg、或0.01～0.015mg。
[0029]
[1-4.其他成分]本发明的液体酶制剂除了上述的蛋白质脱酰胺酶和山梨醇以外，也可以在不影响本发明的效果的程度包含其他成分。作为其他成分，可举出蛋白质脱酰胺酶以外的其他酶、添加剂等。
[0030]
作为其他酶，例如可举出淀粉酶(α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶)、葡糖苷酶(α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶)、半乳糖苷酶(α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶)、蛋白酶(酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶)、肽酶(亮氨酸肽酶、氨基肽酶)、脂肪酶、酯酶、纤维素酶、磷酸酶(酸性磷酸酶、碱性磷酸酶)、核酸酶、脱氨酶、氧化酶、脱氢酶、谷氨酰胺酶、果胶酶、过氧化氢酶、葡聚糖酶、转谷氨酰胺酶、普鲁兰酶等。这些其他酶可以单独包含1种，也可以以多种的组合包含。
[0031]
作为添加剂，可举出赋形剂、缓冲剂、悬浊剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水、多元醇(是指上述山梨醇以外的多元醇。以下相同。)、ph调节剂等。这些添加剂可以单独包含1种，也可以以多种的组合包含。
[0032]
这些添加剂中，从进一步提高本发明的液体酶制剂的活性稳定性的观点出发，本发明的液体酶制剂优选实质上不包含多元醇。在多元醇中，包含甘油、丙二醇等非糖多元醇、以及山梨醇以外的糖醇。应予说明，实质上不含多元醇是指允许包含不损害本发明的液体酶制剂的活性稳定性的程度的多元醇，具体而言，作为多元醇的含量，可举出1w/v％以下、优选为0.1w/v％以下、更优选为0.01w/v％以下，最优选为0w/v％。
[0033]
[1-5.制剂形态等]本发明的液体酶制剂为液剂。本发明的液体酶制剂可以通过如下方式制备：向水中添加规定量的配合的各成分并使其溶解，或者，从蛋白质脱酰胺酶产生株的培养液中通过分离和/或纯化除去夹杂高分子等不需要成分，加入山梨醇水溶液，然后，适当添加ph调节剂，调整为规定的ph，和/或根据需要配合亚硫酸盐、硫代硫酸盐和/或焦硫酸盐，进一步根据需要进行灭菌。
[0034]
从得到所期望的活性稳定性的观点出发，本发明的液体酶制剂的ph(25℃)为5.5
以上。作为本发明的液体酶制剂的ph范围的上限，没有特别限定，但从表现出更优异的活性稳定性的观点出发，可举出8.2以下，优选为8.0以下，更优选为7.6以下，进一步优选为7.2以下，进一步优选为7.0以下、6.8以下、6.5以下、6.2以下、6.0以下、或5.7以下。
[0035]
[1-6.用途]作为本发明的液体酶制剂的用途，可以利用于利用蛋白质脱酰胺酶活性的任意用途。例如，本发明的液体酶制剂可以以蛋白质的改性为目的而使用。作为蛋白质的改性的具体方式，没有特别限定，只要利用通过蛋白质的谷氨酰胺残基和天冬酰胺残基的γ-酰胺基和β-酰胺基的脱酰胺化产生羧基而引起的蛋白质的特性变化即可。具体而言，作为蛋白质的改性，可举出蛋白质的可溶性的增大、水分散性的增大、乳化能力的提高、以及乳化稳定性等。
[0036]
因此，本发明的蛋白质脱酰胺酶液体酶制剂可以在食品领域中广泛使用。具体而言，可举出在作为通常的食品的ph范围的弱酸性条件环境中提高动物性蛋白质和/或植物性蛋白质的可溶性、分散性、乳化性等的用途(例如，咖啡增白剂、果汁等酸性饮料、调料、蛋黄酱、奶油的制造用途)；植物性难溶性蛋白质的可溶性、分散性的增大化(例如，使用小麦面筋的天妇罗粉等的制造用途)；制面包、制点心中的面团的改性用途(例如，脆饼、饼干、曲奇饼、披萨或馅饼皮的制造用途)；食品中的过敏性蛋白质中的过敏原的去除或降低化用途(例如，小麦过敏患者用的食品的制造用途)；降低蛋白质的矿物质敏感性、提高包含蛋白质和矿物质的液体中的可溶性矿物质含量、提高矿物质向人体的吸收性的用途(例如，含有高矿物质(例如钙)的饮料、矿物质(例如钙)的吸收促进剂的制造用途)；使苦味降低的用途、提高蛋白酶的蛋白质分解率的用途、和/或使谷氨酸含量增强的用途(例如，氨基酸类调味料(动物性蛋白质的水解物(hap)、植物性蛋白质的水解物(hvp))、味噌
·
酱油的制造用途)等。
[0037]
[2.蛋白质脱酰胺酶的液体酶制剂的酶活性稳定剂和蛋白质脱酰胺酶的液体酶制剂的沉淀抑制剂]如上所述，在包含蛋白质脱酰胺酶的ph5.5以上的液体酶制剂中，以30w/v％以上的浓度配合的山梨醇提高了液体酶制剂的活性稳定性，即蛋白质脱酰胺酶活性的稳定性。因此，本发明还提供一种蛋白质脱酰胺酶的液体酶制剂的酶活性稳定剂，其包含山梨醇作为有效成分，在ph5.5以上的蛋白质脱酰胺酶的液体酶制剂中以30w/v％以上的浓度使用。从表现出更优异的活性稳定性的观点出发，本发明的蛋白质脱酰胺酶的液体酶制剂的酶活性稳定剂优选除了山梨醇以外，还包含亚硫酸盐、硫代硫酸盐和/或焦硫酸盐作为规定的盐。
[0038]
另外，如上所述，在包含蛋白质脱酰胺酶的ph5.5以上的液体酶制剂中，以30w/v％以上的浓度配合的山梨醇能够抑制液体酶制剂的沉淀。因此，本发明还提供一种蛋白质脱酰胺酶的液体酶制剂的沉淀抑制剂，其包含山梨醇作为有效成分，在ph5.5以上的蛋白质脱酰胺酶的液体酶制剂中以30w/v％以上的浓度使用。
[0039]
更优选本发明的沉淀抑制剂在ph5.5以上且小于6.75的蛋白质脱酰胺酶的液体酶制剂中以30w/v％以上的浓度使用，在ph6.75以上且小于7.5的蛋白质脱酰胺酶的液体酶制剂中以38w/v％以上的浓度使用，或者在ph7.5以上的蛋白质脱酰胺酶的液体酶制剂中以48w/v％以上的浓度使用。
[0040]
在本发明的蛋白质脱酰胺酶的液体酶制剂的酶活性稳定剂和蛋白质脱酰胺酶的液体酶制剂的沉淀抑制剂中，关于各成分的种类和使用量等，如上述“1.液体酶制剂”一栏所示。实施例
[0041]
以下通过实施例对本发明进行具体说明，但本发明并不限于这些实施例。
[0042]
[试验例1]从作为蛋白质谷氨酰胺酶产生株的解朊金黄杆菌株的培养液中除去夹杂高分子等的不需要成分，加入山梨醇水溶液和/或甘油水溶液，然后，使用1n盐酸或1n氢氧化钠水溶液将ph调整为5.0或6.0，制备作为蛋白质脱酰胺酶的蛋白质谷氨酰胺酶(pg)、山梨醇、甘油的浓度如表1中所示的液体酶制剂。
[0043]
将得到的液体酶制剂在60℃下放置72小时。通过以下方法测定在放置前后的蛋白质脱酰胺酶活性值。
[0044]
向包含30mm z-gln-gly的0.2m磷酸缓冲液(ph6.5)1ml中添加包含蛋白质脱酰胺酶的试样溶液0.1ml，在37℃下，放置10分钟后，加入0.4m tca溶液1ml，停止反应。作为空白，在包含30mm z-gln-gly的0.2m磷酸缓冲液(ph6.5)1ml中加入0.4m tca试剂1ml，进一步添加包含蛋白质脱酰胺酶的试样溶液0.1ml，在37℃下放置10分钟。
[0045]
对于上述得到的溶液，使用ammonia-test wako(富士胶片和光纯药)，进行在反应液中产生的氨量的测定。由使用氨标准液(氯化铵)制作的、表示氨浓度与吸光度(630nm)的关系的校准曲线，求出反应液中的氨浓度。
[0046]
将在1分钟内生成1μmol的氨的酶量作为1个单位(1u)，由下式算出蛋白质脱酰胺酶的活性。式中，反应液量为2.1，酶溶液量为0.1，df为酶溶液的稀释倍率。另外，17.03是氨的分子量。
[0047]
[数1]蛋白质脱酰胺酶活性(u/ml)＝反应液中的氨浓度(mg/l)
×
(1/17.03)
×
(反应液量/酶溶液量)
×
(1/10)
×
df
[0048]
算出将放置前的蛋白质脱酰胺酶活性值作为100％时的放置后的蛋白质脱酰胺酶活性值的相对值(％)作为残存活性。结果如表1所示。
[0049]
[表1]
[0050]
如表1所示，在pg的液体酶制剂中配合甘油的情况(比较例2～6)、配合20w/v％山梨醇的情况(比较例7)、以及配合30w/v％山梨醇且将ph调整为5.0的情况(比较例8)的任一情况下，与比较例1相比，活性稳定性不怎么提高，但在配合30w/v％的山梨醇且将ph调整为6.0的情况下(实施例1)，确认到活性稳定性的显著提高。
[0051]
[试验例2]除了将ph调整为5.5、6.0、6.5、7.0或8.0，将山梨醇的配合量设为0w/v％、20w/v％、30w/v％、40w/v％、50w/v％或60w/v％以外，与试验例1相同地制备包含作为蛋白质脱酰胺酶的蛋白质谷氨酰胺酶(pg)和山梨醇(不含甘油)的液体酶制剂。液体酶制剂中的pg含量为360u/ml。对于得到的液体酶制剂，与试验例1相同地进行，测定在60℃下放置72小时后的残存活性。将结果示于图1。
[0052]
如图1所示，包含蛋白质脱酰胺酶和30w/v％以上的山梨醇且ph5.5为以上的液体酶制剂中，确认到活性稳定性的显著提高。
[0053]
[试验例3]将试验例2中得到的液体酶制剂各1ml分注到微型管(容量2.0ml)中，观察在60℃下放置72小时后的外观，基于以下的基准评价沉淀的有无及其程度。将符合各自的基准的外观的代表图示于表2。将结果示于表3。
[0054]-：未观察到沉淀，液体酶制剂为澄清。+：确认到极少的沉淀++：确认到少量的沉淀+++：确认到大量的沉淀
[0055]
[表2]
[0056]
[表3]
[0057]
如表3所示，在不包含山梨醇的情况下产生大量的沉淀，但通过添加30w/v％以上的山梨醇，确认到沉淀的抑制。特别是在液体酶制剂的ph为5.5、6.0以及6.5的情况下，通过添加30w/v％以上的山梨醇，确认到优异的沉淀抑制效果，在液体酶制剂的ph为7.0的情况下，通过添加40w/v％以上的山梨醇，确认到优异的沉淀抑制效果，在液体酶制剂的ph为8.0的情况下，通过添加50w/v％以上的山梨醇，确认到优异的沉淀抑制效果。
[0058]
[试验例4]制备在试验例1中制备的实施例1的液体酶制剂以及在实施例1的液体酶制剂中进一步以表4所示的量配合了亚硫酸钠、硫代硫酸钠、焦硫酸钠、硫酸镁、乙二胺四乙酸二氢二钠或氯化钾的液体酶制剂，将这些液体酶制剂的放置条件设为40℃、2周，除此以外，与试验例1相同地测定残存活性。将结果示于表4。
[0059]
[表4]
[0060]
由表4可知，在包含蛋白质谷氨酰胺酶和30w/v％的山梨醇的ph6.0的液体酶制剂中进一步配合各种盐的情况下，也能够有效地得到酶活性稳定化效果。其中，在进一步配合亚硫酸钠、硫代硫酸钠或焦硫酸钠的情况下，可得到更高的酶活性稳定化效果，该倾向在配合亚硫酸钠和焦硫酸钠的情况下，特别是在配合亚硫酸钠的情况下显著。

技术特征：
1.一种液体酶制剂，其特征在于，包含蛋白质脱酰胺酶和30w/v％以上的山梨醇，ph为5.5以上。2.根据权利要求1所述的液体酶制剂，其中，所述山梨醇的含量为65w/v％以下。3.根据权利要求1或2所述的液体酶制剂，其中，所述液体酶制剂的ph为8.2以下。4.根据权利要求1～3中任一项所述的液体酶制剂，其中，所述液体酶制剂还包含亚硫酸盐、硫代硫酸盐和/或焦硫酸盐。5.根据权利要求1～4中任一项所述的液体酶制剂，其中，蛋白质脱酰胺酶活性为0.1～10000u/ml。6.根据权利要求1～5中任一项所述的液体酶制剂，其中，所述蛋白质脱酰胺酶来源于解朊金黄杆菌。7.一种蛋白质脱酰胺酶的液体酶制剂的酶活性稳定剂，其特征在于，包含山梨醇作为有效成分，在ph5.5以上的蛋白质脱酰胺酶的液体酶制剂中以30w/v％以上的浓度使用。8.根据权利要求7所述的蛋白质脱酰胺酶的液体酶制剂的酶活性稳定剂，其中，所述酶活性稳定剂还包含亚硫酸盐、硫代硫酸盐和/或焦硫酸盐。9.一种蛋白质脱酰胺酶的液体酶制剂的沉淀抑制剂，其特征在于，包含山梨醇作为有效成分，在ph5.5以上的蛋白质脱酰胺酶的液体酶制剂中以30w/v％以上的浓度使用。

技术总结
本发明提供一种活性稳定性优异的蛋白质脱酰胺酶的液体酶制剂。一种液体酶制剂，包含蛋白质脱酰胺酶和30w/v％以上的山梨醇，pH为5.5以上，该液体酶制剂能够提高蛋白质脱酰胺酶活性的稳定性。酶活性的稳定性。


技术研发人员：乘船沙纪 田中裕介
受保护的技术使用者：天野酶制品株式会社
技术研发日：2021.12.02
技术公布日：2023/8/5