工程抗体，抗体偶联药物及其用途的制作方法

工程抗体，抗体偶联药物及其用途
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求申请日为2020年11月20日的国际申请pct/cn2020/130409的优先权。本技术通过引用合并上述专利申请所公开的全文。


背景技术：

3.抗体是对抗外源病原体的关键免疫分子。单克隆抗体(monoclonal antibody，mab)技术的发展使得单克隆抗体在疾病的研究、诊断和治疗中被广泛应用。第一代mab(主要是单特异性的二价mab)的治疗应用在治疗多种疾病方面取得了成功，包括癌症、自身免病和传染病。然而，许多疾病，如实体瘤，已显示出对基于抗体的疗法具有很强的抵抗力。
4.抗体偶联药物(antibody drug conjugate，adc)是与活性毒性药物化学连接的mab，因此具有mab的靶向特异性和细胞毒性药物的癌症杀伤能力。选择特定的mab-毒性药物组合的能力以及mab和药物连接的进展为靶向癌症提供了新的可能性，同时最大限度地减少了对健康组织的暴露。截至2019年，fda共批准了7种adc，包括：恩美曲妥珠单抗(ado-trastuzumab emtansine，kadcyla
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)，维布妥昔单抗(brentuximab vedotin，adcetris
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)、奥英妥珠单抗(inotuzumab ozogamicin，besponsa
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)、吉妥珠单抗(gemtuzumab ozogamicin，mylotarg
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)、泊洛妥珠单抗(polatuzumab vedotin-piiq，polivy
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)、维汀-恩弗妥单抗(enfortumab vedotin，padcev
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)和德喜曲妥珠单抗(trastuzumab deruxtecan，enhertu
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)。除了已获准上市的这七种adc药物外，目前还有大量的adc正在临床开发中。
5.将药物附着于抗体的常规方法通常导致adc的异质混合物。例如，细胞毒性药物常通过表面暴露的赖氨酸或半胱氨酸(通过还原链间二硫键获得)与抗体偶联，产生在抗体上具有不同附着位点和不同药物抗体比(drug to antibody ratio，dar)的不同种类的adc。非特异性偶联对adc产品的偶联过程控制、产品表征和质量控制方面产生了挑战。此外，不同种类的adc可能具有非常不同的安全性和功效特征。由于igg1抗体的重链与其配对轻链之间的二硫键可能是偶联过程中待还原的优选键，由此产生的具有轻链偶联药物的adc种类可能不太稳定，并且容易在体内循环中丢失其轻链。
6.近年来，已经开发了一些位点特异的adc技术，以获得更同质的adc。例如，将特定氨基酸(如半胱氨酸)、非天然氨基酸残基(如p-乙酰苯丙氨酸(pacf))以及可被酶识别和修饰的短肽标签改造进抗体氨基酸序列中的选定位点。另一些人尝试使用附着在抗体重链上的聚糖进行聚糖介导的偶联。


技术实现要素：

7.本发明的一方面提供了一种分离的igg抗体，所述igg抗体包含：两条完全相同的重链，每条重链包含(a)铰链区，所述铰链区包含以下氨基酸序列：-(x1)-c-(x2)-cppcp-，其中x1为具有0-7个氨基酸残基的多肽片段，每个氨基酸残基独立地选自非半胱氨酸残基的任何氨基酸残基，并且x2为具有2-7个氨基酸残基的多肽片段，每个氨基酸残基独立地选自非半胱氨酸残基的任何氨基酸残基；和(b)位于所述铰链区上游并与所述铰链区连接的ch1
结构域，所述ch1结构域在根据imgt编号规则的第142位包含一个半胱氨酸。所述抗体还可以包含两条完全相同的kappa轻链，每条轻链与一条重链配对。
8.所述igg抗体的ch1结构域可以具有与天然人igg2、igg3或igg4亚类抗体的ch1结构域相同的序列。或者，所述igg抗体的ch1结构域的序列可以与具有s142c突变的天然人igg1抗体的ch1结构域的序列相同。
9.每条所述重链还可以包含天然人igg1、igg2、igg3或igg4亚类抗体的位于所述铰链区下游并与所述铰链区连接的ch2-ch3结构域。所述ch2-ch3结构域可以任选地包括一个或多个突变。
10.在一些实施方案中，所述铰链区的氨基酸序列选自由以下组成的组：(a)ckthtcppcp(seq id no:1)；(b)dktchtcppcp(seq id no:2)；
11.(c)erkscvecppcp(seq id no:3)；(d)epkscdkthtcppcp(seq id no:4)；(e)epksdckthtcppcp(seq id no:5)；(f)epksdkcthtcppcp(seq id no:6)；(g)epksdckthtvecppcp(seq id no:7)；(h)epksdcktvecppcp(seq id no:8)；(i)epksdkcthtvecppcp(seq id no:9)；(j)eppkscdkthtvecppcp(seq id no:10)；
12.(k)eppksdckthtvecppcp(seq id no:11)；(l)epppkscdkthtvecppcp(seq id no:12)；和(m)eppppkscdkthtvecppcp(seq id no:13)；和(n)eppksdcktktvecppcp(seq id no:28)。
13.在一些实施方案中，所述igg抗体还包含fab结构域，所述fab结构域与抗原特异性结合，所述抗原选自由以下组成的组：egfr、her2、her3、bcma、b7h3、cea、ceacam6、claudin 18.2、c-met、叶酸受体(folate receptor)、cd3、cd19、cd20、cd22、cd25、cd27l、cd30、cd33、cd37、cd48、cd56、cd70、cd73、cd74、cd79b、cd98、cd138、cd309(vegfr2)、胶原iv(collagen iv)、内皮素受体etb(endothelin receptor etb)、enpp3、纤维连接蛋白额外结构域b(fibronectin extra-domain b)、gcc、gpnmb、liv-1(zip6)、muc1、muc16、间皮素(mesothelin)、napi2b、粘连蛋白4(nectin 4)、p-钙粘蛋白(p-cadherin)、骨膜蛋白(periostin)、psma、sc-16(抗-fyn3)、slc44a4、sltrk6、steap1、肌腱蛋白c(tenascin c)、组织因子(tissue factor)、trop2和5t4(tpbg)。
14.在一些实施方案中，所述igg抗体具有以下结构之一：
15.(a)两条相同的重链，每条重链包含如seq id no:14所示的氨基酸序列；和两条轻链，每条轻链包含如seq id no:23所示的氨基酸序列；
16.(b)两条相同的重链，每条重链包含如seq id no:15所示的氨基酸序列；和两条轻链，每条轻链包含如seq id no:23所示的氨基酸序列；
17.(c)两条相同的重链，每条重链包含如seq id no:16所示的氨基酸序列；和两条轻链，每条轻链包含如seq id no:23所示的氨基酸序列；
18.(d)两条相同的重链，每条重链包含如seq id no:17所示的氨基酸序列；和两条轻链，每条轻链包含如seq id no:23所示的氨基酸序列；
19.(e)两条相同的重链，每条重链包含如seq id no:18所示的氨基酸序列；和两条轻链，每条轻链包含如seq id no:24所示的氨基酸序列；
20.(f)两条相同的重链，每条重链包含如seq id no:19所示的氨基酸序列；和两条轻链，每条轻链包含如seq id no:25所示的氨基酸序列；
21.(g)两条相同的重链，每条重链包含如seq id no:20所示的氨基酸序列；和两条轻链，每条轻链包含如seq id no:26所示的氨基酸序列；
22.(h)两条相同的重链，每条重链包含如seq id no:21所示的氨基酸序列；和两条轻链，每条轻链包含如seq id no:25所示的氨基酸序列；
23.(i)两条相同的重链，每条都包含如seq id no:22所示的氨基酸序列；和两条轻链，每条轻链包含如seq id no:27所示的氨基酸序列；和
24.(j)两条相同的重链，每条重链包含如seq id no:29所示的氨基酸序列；和两条轻链，每条轻链包含如seq id no:31所示的氨基酸序列；和
25.(k)两条相同的重链，每条重链包含如seq id no:30所示的氨基酸序列；和两条轻链，每条轻链包含如seq id no:32所示的氨基酸序列。
26.本公开在进一步的方面中还提供了一种抗体偶联药物(adc)或其药学上可接受的盐，其包含如本发明所述的抗体通过化学连接子与细胞毒性药物偶联。在一些实施方案中，所述细胞毒性药物选自由以下组成的组：单甲基奥瑞他汀e(monomethyl auristatin e，mmae)、单甲基奥瑞他汀f(monomethyl auristatin f，mmaf)、奥瑞他汀e(auristatin e)、奥瑞他汀f(auristatin f)、美登素(maytansine)dm1和dm4、美登素醇(maytansino)、山德霉素(sandramycin)、吡咯并苯并二氮杂卓(pyrrolobenzodiazepine)、吡咯并苯并二氮杂卓二聚体(pyrrolobenzodiazepine dimer)、蒽环类(anthracycline)、卡奇霉素(calicheamicin)、多拉司他汀10(dolastatin 10)、多卡霉素(duocarmycin)、多柔比星(doxorubicin)、泰兰斯他汀a(thailanstatin a)、钩霉素(uncialamycin)、鹅膏菌素(amanitin)、蓖麻毒素(ricin)、白喉毒素(diphtheria toxin)、艾立布林(eribulin(cas))、
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i、白细胞介素(interleukin)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor)、趋化因子(chemokine)、伊立替康(irinotecan，sn38)、依喜替康(exatecan)、依喜替康衍生物和纳米颗粒(nanoparticle)。
27.连接所述抗体部分和所述细胞毒性药物的化学连接子可以是可裂解的或不可裂解的。在一些实施方案中，所述连接子包含一个pegn间隔区，其中n为1至20(即具有1至20个重复单元的(ch2ch2o))。在一些实施方案中，所述化学连接子进一步包含一个与所述pegn间隔区相连的连接子片段。在一些实施方案中，所述化学连接子包含不含pegn间隔区的连接子片段。在一些实施方案中，所述连接子片段可以选自由以下组成的组：6-马来酰亚胺基己酰基(6-maleimidocaproyl，mc)、马来酰亚胺丙酰基(maleimidopropionyl，mp)、缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(ala-phe)、对氨基苄氧羰基(p-aminobenzyloxycarbonyl，pab)、6-马来酰亚胺基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基(mc-val-cit-pab)、mal-peg
n-val-cit-pab(n＝1-20)、phe-lys(fmoc)-pab、aloc-d-ala-phe-lys(aloc)-pab-pnp、boc-phe-(alloc)lys-pab-pnp和3-(吡啶-2-基二硫基)丙酸全氟苯基酯(perfluorophenyl 3-(pyridine-2-yldisulfanyl)propanoate)，或其组合。
28.在adc的具体实施方案中，所述抗体的两条重链分别包含如seq id no:21所示的氨基酸序列，所述抗体的两条轻链分别包含如seq id no:25所示的氨基酸序列，并且其中所述细胞毒性药物是艾立布林或mmae。
29.在adc的具体实施方案中，所述抗体的两条重链分别包含如seq id no:19所示的氨基酸序列，所述抗体的两条轻链分别包含如seq id no:25所示的氨基酸序列，并且其中
所述细胞毒性药物是艾立布林或mmae。
30.在adc的具体实施方案中，所述抗体的两条重链分别包含如seq id no:20所示的氨基酸序列，所述抗体的两条轻链分别包含如seq id no:26所示的氨基酸序列，并且其中所述细胞毒性药物是艾立布林或mmae。
31.在adc的具体实施方案中，所述抗体的两条重链分别包含如seq id no:29所示的氨基酸序列，所述抗体的两条轻链分别包含如seq id no:31所示的氨基酸序列，并且其中所述细胞毒性药物是艾立布林或mmae。
32.在adc的具体实施方案中，所述抗体的两条重链分别包含如seq id no:30所示的氨基酸序列，所述抗体的两条轻链分别包含如seq id no:32所示的氨基酸序列，并且其中所述细胞毒性药物是艾立布林或mmae。
33.在所述adc或其药学上可接受的盐的制剂中，至少80％的adc是通过抗体重链上的半胱氨酸与化学连接子偶联。在所述制剂的一些实施方案中，药物抗体比(dar)为2的adc分子占adc分子总量的60％以上。
34.本公开的进一步的方面提供了一种抗体偶联药物(adc)或其药学上可接受的盐，其包含以下反应的产物：如本发明所述的igg抗体，所述igg抗体经历了至少部分还原，使得所述抗体的铰链区中对应半胱氨酸之间的至少一些h-h二硫键被还原为游离的巯基；和连接到细胞毒性药物分子的包含末端硫醇反应基团的化学连接子。
35.本公开的进一步的方面提供了一种生产抗体偶联药物(adc)或其药学上可接受的盐的方法，所述方法包含：至少部分还原如本发明所述的igg抗体的铰链区中相应的半胱氨酸之间的h-h二硫键，以获得游离的巯基；和使铰链区的半胱氨酸的巯基与含有末端硫醇反应基团的化学连接子反应，从而使抗体通过化学连接子偶联一个或多个细胞毒性药物分子。
附图说明
36.图1显示了本技术中使用的抗体的氨基酸编号系统的示意图。(a)人igg1(κ)基于imgt的氨基酸编号体系。(b)突变体(对于igg1铰链区)的编号体系。
37.图2的a部分显示了根据本发明实施方案的工程抗体的示意图。图2的b部分显示了根据本发明实施方案的igg抗体中的二硫键。
38.图3显示了本发明实施例的抗体的特征。(a)hek293细胞生产的抗体的纯度和产量；(b)还原(r)抗体和非还原(nr)抗体的sds-page分析；(c)纯化抗体的sec-hplc分析。
39.图4显示了由天然人igg1(κ)、igg2(κ)和本发明实施例的工程抗体制备的adc的hic谱图。a：igg1(κ)-mmae、b：igg2(κ)-mmae、c：bb0500-2a-mmae、d：bb0500-2b-mmae、e：bb0500-2g-mmae、f：bb0500-2n-mmae、g：br0301-mmae和h：br0302-mmae。
40.图5显示了本发明特定实施例的adc的ce-sds谱图。a：igg1(κ)-mmae、b：igg2(κ)-mmae、c：bb0500-2a-mmae和d：bb0500-2g-mmae。
41.图6显示了根据本发明实施方案的不同工程抗体和对照(wt)抗体与蛋白egfr(a)、her3(b)和her2(c)的结合曲线。
42.图7显示了根据本发明实施方案的工程adc对表达egfr的癌细胞(a：a431细胞，b：nugc3细胞)的细胞毒性曲线；和根据本发明实施方案的其他工程adc对表达her2的癌细胞
(c：nci-n87(her2高表达)，和d：a431(her2低表达))的细胞毒性曲线。
具体实施方式
43.本公开的一方面提供了一种新形式的工程抗体，所述工程抗体的重链含有ch1结构域，在所述ch1结构域在其第142位氨基酸处或附近具有半胱氨酸残基，并且所述工程抗体的铰链区包含以包括三个半胱氨酸的模式排列的序列，其可被视为包括位于人igg1铰链区中两个固有半胱氨酸上游的第三个或附加的半胱氨酸残基的序列。该第三个半胱氨酸残基在本文中被称为“hg3半胱氨酸”。
44.含有这种形式的重链的抗体优选在ch1结构域的c142(或第142位附近的半胱氨酸，位点的定义如下文进一步描述的imgt编号系统)与轻链中最后一个半胱氨酸残基之间形成h-l链间二硫键。天然cppcp序列上游铰链区中的半胱氨酸残基形成第三个h-h链间二硫键。在ch1结构域第142位或附近氨基酸的半胱氨酸可以通过igg1亚型中单个氨基酸的突变或插入来引入，或者可以是来自igg2、igg3或igg4亚型的ch1结构域中的天然半胱氨酸残基。与igg1中的天然h-l二硫键(其位于igg1抗体重链铰链区中的半胱氨酸与配对的轻链的末端之间)相比，这种形式的h-l二硫键更稳定，并且在药物偶联到抗体的过程中可以在还原性条件下保持完整。这大大降低了获得含有轻链偶联药物的adc的可能性。
45.铰链区第三个半胱氨酸的精确位置及其周围的氨基酸序列可能会有所不同。第三个h-h链间二硫键比固有h-h链间二硫键或h-l链间二硫键更容易还原。该二硫键的易还原特性可促进位点特异性的药物偶联。选定的还原和药物偶联条件可用于获得主要与第三个半胱氨酸“hg3半胱氨酸”位点特异性的药物偶联。
46.免疫球蛋白超家族的imgt编号系统在本文中用于简化编号体系，其中vh或vl结构域各自包含氨基酸残基1-128位。因此，ch1结构域中的氨基酸编号为aa 129-226；kappa结构域为aa 129-235；铰链区为aa 227-241(根据igg1)；ch2为aa 242-351，ch3为aa 352-456(见图1的a部分)。基于这种编号体系，野生型igg1(κ)中的h-l链间二硫键将在h(c231)-l(c235)之间形成，而在igg2(κ)(或igg3(κ)或igg4(κ))中，它可以在h(c142)-l(c235)之间形成。重链第230位丝氨酸变为半胱氨酸的igg1突变体被命名为igg1(s230c)，而c231缺失的igg1突变体被命名为igg1(
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231)。在c231之后插入一个赖氨酸的igg1突变体将命名为k231.1，在c231之后插入kl两个氨基酸的igg1突变体将命名为k231.1l231.2(参见图1的b部分，其显示了在igg1的铰链区中引入了突变的几个符号示例)。
47.本文所用术语“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。特异性结合抗原的分离的抗体基本上不含不结合该抗原的抗体。
48.本文所用术语“单克隆抗体”是指具有基本上同源分子组成的抗体分子群体的制剂，其中抗体分子群体中的单个抗体都是相同的，除了可能以极少量存在的可能的天然发生的突变。
49.在一些实施方案中，本公开提供了一种分离的igg抗体，所述igg抗体包含：两条完全相同的重链，每条重链包含(a)铰链区，所述铰链区包含以下氨基酸序列：-(x1)-c-(x2)-cppcp-，其中x1为具有0-7个氨基酸残基的多肽片段，每个氨基酸残基独立地选自非半胱氨酸残基的任何氨基酸残基，并且x2为具有2-7个氨基酸残基的多肽片段，每个氨基酸残基独立地选自非半胱氨酸残基的任何氨基酸残基；和(b)位于所述铰链区上游并与所述铰链区
连接的ch1结构域，所述ch1结构域在根据imgt编号规则的第142位包含一个半胱氨酸。
50.所述igg抗体还可以包含两条完全相同的kappa轻链。所述kappa轻链c-末端的半胱氨酸可以与ch1 c142形成二硫键。
51.在所述igg抗体的一些实施方案中，所述igg抗体的ch1结构域具有与天然人igg2、igg3或igg4亚类抗体的ch1结构域相同的序列。
52.在所述igg抗体的一些实施方案中，所述igg抗体的ch1结构域的序列与具有s142c突变的天然人igg1抗体的ch1结构域的序列相同。
53.在所述igg抗体的一些实施方案中，每条所述重链还可以包含天然人igg1、igg2、igg3或igg4亚类抗体的位于所述铰链区下游并与所述铰链区连接的ch2-ch3结构域的氨基酸序列。
54.在一些实施方案中，所述铰链区的氨基酸序列选自由以下组成的组：(a)ckthtcppcp(seq id no:1)；(b)dktchtcppcp(seq id no:2)；(c)erkscvecppcp(seq id no:3)；(d)epkscdkthtcppcp(seq id no:4)；(e)epksdckthtcppcp(seq id no:5)；(f)epksdkcthtcppcp(seq id no:6)；(g)epksdckthtvecppcp(seq id no:7)；(h)epksdcktvecppcp(seq id no:8)；(i)epksdkcthtvecppcp(seq id no:9)；(j)eppkscdkthtvecppcp(seq id no:10)；(k)eppksdckthtvecppcp(seq id no:11)；(l)epppkscdkthtvecppcp(seq id no:12)；(m)eppppkscdkthtvecppcp(seq id no:13)；和(n)eppksdcktktvecppcp(seq id no:28)。
55.所述抗体还可包含fab结构域，所述fab结构域与抗原特异性结合，所述抗原选自由以下组成的组：egfr、her2、her3、bcma、b7h3、cea、ceacam6、claudin 18.2、c-met、叶酸受体(folate receptor)、cd3、cd19、cd20、cd22、cd25、cd27l、cd30、cd33、cd37、cd48、cd56、cd70、cd73、cd74、cd79b、cd98、cd138、cd309(vegfr2)、胶原iv(collagen iv)、内皮素受体etb(endothelin receptor etb)、enpp3、纤维连接蛋白额外结构域b(fibronectin extra-domain b)、gcc、gpnmb、liv-1(zip6)、muc1、muc16、间皮素(mesothelin)、napi2b、粘连蛋白4(nectin 4)、p-钙粘蛋白(p-cadherin)、骨膜蛋白(periostin)、psma、sc-16(抗-fyn3)、slc44a4、sltrk6、steap1、肌腱蛋白c(tenascin c)、组织因子(tissue factor)、trop2和5t4(tpbg)。
56.所述igg抗体的序列的示例包括：
57.(a)两条相同的重链，每条重链包含如seq id no:14所示的氨基酸序列；和两条轻链，每条轻链包含如seq id no:23所示的氨基酸序列；
58.(b)两条相同的重链，每条重链包含如seq id no:15所示的氨基酸序列；和两条轻链，每条轻链包含如seq id no:23所示的氨基酸序列；
59.(c)两条相同的重链，每条重链包含如seq id no:16所示的氨基酸序列；和两条轻链，每条轻链包含如seq id no:23所示的氨基酸序列；
60.(d)两条相同的重链，每条重链包含如seq id no:17所示的氨基酸序列；和两条轻链，每条轻链包含如seq id no:23所示的氨基酸序列；
61.(e)两条相同的重链，每条重链包含如seq id no:18所示的氨基酸序列；和两条轻链，每条轻链包含如seq id no:24所示的氨基酸序列；
62.(f)两条相同的重链，每条重链包含如seq id no:19所示的氨基酸序列；和两条轻
链，每条轻链包含如seq id no:25所示的氨基酸序列；
63.(g)两条相同的重链，每条重链包含如seq id no:20所示的氨基酸序列；和两条轻链，每条轻链包含如seq id no:26所示的氨基酸序列；
64.(h)两条相同的重链，每条重链包含如seq id no:21所示的氨基酸序列；和两条轻链，每条轻链包含如seq id no:25所示的氨基酸序列；
65.(i)两条相同的重链，每条都包含如seq id no:22所示的氨基酸序列；和两条轻链，每条轻链包含如seq id no:27所示的氨基酸序列；
66.(j)两条相同的重链，每条重链包含如seq id no:29所示的氨基酸序列；和两条轻链，每条轻链包含如seq id no:31所示的氨基酸序列；和
67.(k)两条相同的重链，每条重链包含如seq id no:30所示的氨基酸序列；和两条轻链，每条轻链包含如seq id no:32所示的氨基酸序列。
68.可通过本领域已知的多种方法制备编码起始多肽的氨基酸序列变体的dna。这些制备方法包括但不限于通过对初期制备的编码多肽的dna进行定点(或寡核苷酸介导的)诱变、pcr诱变和盒式诱变。重组抗体的变体也可以通过限制性片段操作或与合成的寡核苷酸重叠延伸pcr来构建。诱变引物编码半胱氨酸密码子替换。可采用标准诱变技术产生编码此类突变工程改造抗体的dna。
69.本公开的更进一步的方面提供了一种编码如本发明所述的抗体或任何所述抗体的抗原结合部分的核酸分子。一种包含含有所述核酸分子的表达载体的宿主细胞(例如，cho细胞、淋巴细胞、人胚胎肾细胞或微生物(例如大肠杆菌，和真菌例如酵母))，其可被用于生产本公开的抗体，优选单克隆抗体。在一个实施方案中，编码本公开的部分或全长抗体的dna可通过标准分子生物学技术获得，其被插入一个或多个表达载体中，使得基因可操作地连接至转录和翻译调控序列。术语“可操作地连接(operatively linked)”旨在表示抗体基因被连接到载体中，使得载体中的转录和翻译控制序列发挥其调节抗体基因的转录和翻译的预期功能。术语“调控序列(regulatory sequence)”旨在包括控制抗体基因的转录或翻译的启动子、增强子和其它表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。例如，在goeddel(gene expression technology.methods in enzymology 185,academic press,san diego,calif.(1990))中描述了此类调控序列。哺乳动物宿主细胞表达的优选调控序列包括在哺乳动物细胞中引导蛋白质高水平表达的病毒元件，例如来源于巨细胞病毒(cytomegalovirus，cmv)、猿猴病毒40(simian virus 40，sv40)、腺病毒(adenovirus，例如腺病毒主要晚期启动子(admlp))和多瘤病毒(polyoma)的启动子和/或增强子。或者，可以使用非病毒调节序列，如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。此外，调节元件由来自不同来源的序列组成，例如srα启动子系统，其包含来自sv40早期启动子和人t细胞白血病病毒1型的长末端重复的序列(takebe et al.,(1988)mol.cell.biol.8:466-472)。选择与所使用的表达宿主细胞兼容的表达载体和表达控制序列。
70.可将编码抗体的dna插入所述表达载体中。重组表达载体可编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。可将编码抗体的dna克隆进载体中，使得信号肽在框内与编码抗体氨基末端的dna连接。所述信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白的信号肽)。
71.本公开在进一步的方面中还提供了一种抗体偶联药物(adc)或其药学上可接受的
盐，其包含如本发明所述的抗体通过化学连接子与细胞毒性药物偶联。所述细胞毒性药物可以选自由以下组成的组：单甲基奥瑞他汀e(monomethyl auristatin e，mmae)、单甲基奥瑞他汀f(monomethyl auristatin f，mmaf)、奥瑞他汀e(auristatin e)、奥瑞他汀f(auristatin f)、美登素(maytansine)dm1和dm4、美登素醇(maytansino)、山德霉素(sandramycin)、吡咯并苯并二氮杂卓(pyrrolobenzodiazepine)、吡咯并苯并二氮杂卓二聚体(pyrrolobenzodiazepine dimer)、蒽环类(anthracycline)、卡奇霉素(calicheamicin)、多拉司他汀10(dolastatin 10)、多卡霉素(duocarmycin)、多柔比星(doxorubicin)、泰兰斯他汀a(thailanstatin a)、钩霉素(uncialamycin)、鹅膏菌素(amanitin)、蓖麻毒素(ricin)、白喉毒素(diphtheria toxin)、艾立布林(eribulin)、
131
i、白细胞介素(interleukin)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor)、趋化因子(chemokine)、伊立替康(irinotecan，sn38)、依喜替康(exatecan)、依喜替康衍生物和纳米颗粒(nanoparticle)。
72.连接所述抗体部分和所述细胞毒性药物的化学连接子可以是可裂解的或不可裂解的。在一些实施方案中，所述连接子包含一个pegn间隔区，其中n为1至20(即具有1至20个重复单元的(ch2ch2o))。在一些实施方案中，所述化学连接子进一步包含一个与所述pegn间隔区相连的连接子片段。在一些实施方案中，所述化学连接子包含不含pegn间隔区的连接子片段。在一些实施方案中，所述连接子片段可以选自由以下组成的组：6-马来酰亚胺基己酰基(6-maleimidocaproyl，mc)、马来酰亚胺丙酰基(maleimidopropionyl，mp)、缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(ala-phe)、对氨基苄氧羰基(p-aminobenzyloxycarbonyl，pab)、6-马来酰亚胺基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基(mc-val-cit-pab)、mal-peg
n-val-cit-pab(n＝1-20)、phe-lys(fmoc)-pab、aloc-d-ala-phe-lys(aloc)-pab-pnp、boc-phe-(alloc)lys-pab-pnp和3-(吡啶-2-基二硫基)丙酸全氟苯基酯(perfluorophenyl 3-(pyridine-2-yldisulfanyl)propanoate)，或其组合。
73.在adc的具体实施方案中，所述抗体的两条重链分别包含如seq id no:21所示的氨基酸序列，所述抗体的两条轻链分别包含如seq id no:25所示的氨基酸序列，并且其中所述细胞毒性药物是艾立布林或mmae。
74.在adc的具体实施方案中，所述抗体的两条重链分别包含如seq id no:19所示的氨基酸序列，所述抗体的两条轻链分别包含如seq id no:25所示的氨基酸序列，并且其中所述细胞毒性药物是艾立布林或mmae。
75.在adc的具体实施方案中，所述抗体的两条重链分别包含如seq id no:20所示的氨基酸序列，所述抗体的两条轻链分别包含如seq id no:26所示的氨基酸序列，并且其中所述细胞毒性药物是艾立布林或mmae。
76.在adc的具体实施方案中，所述抗体的两条重链分别包含如seq id no:29所示的氨基酸序列，所述抗体的两条轻链分别包含如seq id no:31所示的氨基酸序列，并且其中所述细胞毒性药物是艾立布林或mmae。
77.在adc的具体实施方案中，所述抗体的两条重链分别包含如seq id no:30所示的氨基酸序列，所述抗体的两条轻链分别包含如seq id no:32所示的氨基酸序列，并且其中所述细胞毒性药物是艾立布林或mmae。
78.在本公开中，adc的药学上可接受的盐包括无机酸、羧酸和磺酸的酸加成盐，例如
下列酸的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸、马来酸和苯甲酸。
79.本公开的抗体偶联药物的药学上可接受的盐还包括常规碱的盐，例如碱金属盐(例如钠盐和钾盐)、碱土金属盐(例如钙盐和镁盐)和衍生自氨或含有1至16个碳原子的有机胺的铵盐，其中有机胺是例如乙胺、二乙胺、三乙胺、乙基二异丙胺、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二环己胺、二甲氨基乙醇、普鲁卡因(procaine)、二胺、n-甲基哌啶、n-甲基吗啉、精氨酸、赖氨酸和1,2-乙二胺。
80.应当理解，本文所用的adc是指均包含药物分子和抗体(或其抗原结合部分)的分子，其中药物和抗体(或其抗原结合部分)通过连接子共价连接。本文中的“adc制剂”是指adc分子的集合或群体，其结构可能由于化学连接子与抗体(或其抗原结合部分)可能不同的附着位点而不同。在一些实施方案中，化学连接子主要或绝大多数(例如≥80％、≥85％、≥90％、≥95％或≥98％)与重链上的半胱氨酸偶联，导致adc制剂基本上没有轻链偶联。在一些实施方案中，化学连接子主要通过抗体重链铰链区中的半胱氨酸与抗体偶联。在某些实施方案中，药物抗体比率(dar)为2的adc分子占adc分子总量的至少60％、至少70％、至少80％、至少85％或至少90％。
81.在进一步的方面，所述adc或其药学上可接受的盐为或包含以下反应的产物：如本发明所述的抗体经历了至少部分还原，使得所述抗体的铰链区中对应半胱氨酸之间的至少一些h-h二硫键被还原为游离的巯基；和连接到细胞毒性药物分子的包含末端硫醇反应基团的化学连接子。
82.本公开的进一步的方面提供了一种生产所述adc或其药学上可接受的盐的方法，所述方法包含：至少部分还原如本发明所述的抗体的铰链区中相应的半胱氨酸之间的h-h二硫键，以获得游离的巯基；和使铰链区的半胱氨酸的巯基与含有末端硫醇反应基团的化学连接子反应，从而使抗体通过化学连接子偶联一个或多个细胞毒性药物分子。
83.本公开的进一步的方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明的一种或多种抗体、一种或多种adc或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体。如本文所用，“药学上可接受的载体”包括药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。它们包括但不限于生理学上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、表面活性剂、增稠剂或乳化剂、固体粘合剂、分散或悬浮助剂、增溶剂、着色剂、调味剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂和等渗剂等。合适载体的选择在本领域技术人员的知识范围内。
84.组合物可以包含一种或多种附加的药物活性成分，例如另一种抗体和药物(例如细胞毒性剂或抗肿瘤剂)。本发明的药物组合物还可以在联合治疗中给药，例如与另一种抗癌剂和另一种抗炎剂等。
85.所述药物组合物可适用于静脉内(intravenous)、肌内(intramuscular)、皮下(subcutaneous)、肠胃外(parenteral)、表皮(epidermal)和其它给药途径。根据给药途径，活性成分可以包被于一种材料或以其他方式负载在材料或结构中，以保护其免受酸和可能使其失活的其他天然条件的作用。本文所用的短语“肠胃外给药”是指除肠内和局部(topical)给药之外的给药模式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内(intraarterial)、鞘内(intrathecal)、囊内(intracapsular)、眼眶内(intraorbital)、心内(intracardiac)、皮内(intradermal)、腹膜内(intraperitoneal)、经气管
(transtracheal)、皮下(subcutaneous)、表皮下(subcuticular)、关节内(intraarticular)、包膜下(subcapsular)、蛛网膜下(subarachnoid)、椎管内(intraspinal)、硬膜外(epidural)和胸骨内(intrasternal)注射和输注。或者，本发明的组合物可以通过非肠胃外途径给药，例如局部、表皮或粘膜给药途径(例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或外用给药)。
86.实施例
87.1.工程抗体的设计
88.设计并制备表1中的抗体，其中这些抗体的ch1结构域在第142位氨基酸含有半胱氨酸残基。在一些抗体中，ch1结构域中第142位氨基酸的半胱氨酸是通过单个氨基酸的突变或插入(表1中的s142c为半胱氨酸替换了第142位的丝氨酸)引入的，在其他抗体中，c142来自igg2亚型(表1中表示为g2ch1)的ch1结构域中的天然半胱氨酸残基。每个抗体在cppcp序列上游包括一段含有第三个半胱氨酸残基(hg3半胱氨酸)的人工铰链序列，以代替天然铰链区。hg3半胱氨酸残基周围的氨基酸序列在不同的工程抗体中可能不同。通过在工程抗体的ch1中的第142位引入半胱氨酸残基，可以在ch1结构域的c142和轻链中的c235之间形成h-l链间二硫键。hg3半胱氨酸可以与另一条h链相同位置的半胱氨酸配对，除了固有的h-h链间二硫键外，还形成了额外的h-h链间二硫键(图2)。
89.表1：工程抗体的列表
[0090][0091]
实施例的工程抗体的结构和序列描述如下：
[0092]
1.bb0500-3以igg2κ同型的形式制备，其重链含有：vh(抗egfr)-ch1(igg2)-铰链(seq id no:3)-ch2ch3(igg2)，以及其轻链含有：vl-cl(κ)。bb0500-3的重链的序列如seq id no:14所示。bb0500-3的轻链的序列如seq id no:23所示。
[0093]
2.bb0500-5以igg1κ同型的形式制备，其重链含有：vh(抗egfr)-ch1(s142c)-铰链(seq id no:4)-ch2ch3(igg1)，以及其轻链含有：vl-cl(κ)。bb0500-5的重链的序列如seq id no:15所示。bb0500-3的轻链的序列如seq id no:23所示。
[0094]
3.bb0500-2a以igg1κ同型的形式制备，其重链含有：vh(抗egfr)-ch1(igg2)-铰链(seq id no:4)-ch2ch3(igg1)，以及其轻链含有：vl-cl(κ)。bb0500-2a的重链的序列如seq id no:16所示。bb0500-2a的轻链的序列如seq id no:23所示。
[0095]
4.bb0500-2b以igg1κ同型的形式制备，其重链含有：vh(抗egfr)-ch1(igg2)-铰链(seq id no:5)-ch2ch3(igg1)，以及其轻链含有：vl-cl(κ)。bb0500-2b的重链的序列如seq id no:17所示。bb0500-2b的轻链的序列如seq id no:23所示。
[0096]
5.bb0500-6a以igg1κ同型的形式制备，其重链含有：vh(抗egfr)-ch1(igg2)-铰链(seq id no:6)-ch2ch3(igg1)，以及其轻链含有：vl-cl(κ)。bb0500-6a的重链的序列如seq id no:18所示。bb0500-6a的轻链的序列如seq id no:24所示。
[0097]
6.bb0500-2f以igg2κ同型的形式制备，其重链含有：vh(抗egfr)-ch1(igg2)-铰链(seq id no:9)-ch2ch3(igg2)，以及其轻链含有：vl-cl(κ)。bb0500-2f的重链的序列如seq id no:19所示。bb0500-2f的轻链的序列如seq id no:25所示。
[0098]
7.bb0500-2g以igg2κ同型的形式制备，其重链含有：vh(抗egfr)-ch1(igg2)-铰链(seq id no:10)-ch2ch3(igg2)，以及其轻链含有：vl-cl(κ)。bb0500-2g的重链的序列如seq id no:20所示。bb0500-2g的轻链的序列如seq id no:26所示。
[0099]
8.bb0500-2n以igg1κ同型的形式制备，其重链含有：vh(抗egfr)-ch1(igg2)-铰链(seq id no:11)-ch2ch3(igg1)，以及其轻链含有：vl-cl(κ)。bb0500-2n的重链的序列如seq id no:21所示。bb0500-2n的轻链的序列如seq id no:25所示。
[0100]
9.bb0802以igg1κ同型的形式制备，其重链含有：vh(抗her3)-ch1(s142c)-铰链(seq id no:12)-ch2ch3(igg1)，以及其轻链含有：vl-cl(κ)。bb0802的重链的序列如seq id no:22所示。bb0802的轻链的序列如seq id no:27所示。
[0101]
10.br0301以igg1κ同型的形式制备，其重链含有：vh(抗her2)-ch1(igg2)-铰链(seq id no:28)-ch2ch3(igg1)，以及其轻链含有：vl-cl(κ)。br0301的重链的序列如seq id no:29所示。br0301的轻链的序列如seq id no:31所示。
[0102]
11.br0302以igg1κ同型的形式制备，其重链含有：vh(抗her2)-ch1(igg2)-铰链(seq id no:28)-ch2ch3(igg1)，以及其轻链含有：vl-cl(κ)。br0302的重链的序列如seq id no:30所示。br0302的轻链的序列如seq id no:32所示。
[0103]
2.工程抗体的表达与纯化。
[0104]
进行密码子优化和基因合成以表达工程抗体。将特定的全长重链和全长轻链dna分别克隆到一个单独的pcdna3质粒中。使用成对质粒瞬时转染hek293细胞和并进行一步蛋白a纯化以制备用于检测的足够蛋白。以这种形式制备的抗体表达良好，产率可观，可通过一步蛋白a纯化过程进行高纯度纯化(图3的a、b、c部分)。
[0105]
3.由天然igg1(κ)和igg2(κ)制备的抗体偶联药物的谱图。
[0106]
在温和的还原条件下(tris(2-氯乙基)磷酸酯(tris(2-chloroethyl)phosphate，tcep):mab＝1-3，中性ph，室温下《240分钟)，igg抗体的链间二硫键可以部分还原并与药物-连接子偶联形成adc。纯化抗体通过连接子与细胞毒性药物偶联(例如，mmae、dm1或艾立
布林(eribulin))。向中性ph的磷酸盐缓冲液中的纯化抗体加入tcep进行部分还原，以生成偶联药物。将药物-连接子(mc-val-cit-pab-mmae或mal-peg
2-val-cit-pab-艾立布林)加入到dma中，并使其与抗体反应，以获得所需的药物抗体比(drug-to-antibody ratio，dar)。为表征抗体和adc，使用疏水作用色谱(hydrophobic interaction chromatography，hic)评估adc中的药物分布以及药物与抗体的摩尔比。还对非还原性adc进行了ce-sds，以评估adc产品中非共价连接组分的百分比，如游离轻链(l)、游离重链(h)、半抗体(hl)、完整抗体(lhhl)和缺失一条或两条轻链的抗体(hhl或hh)。
[0107]
igg1(κ)adc的hic谱图显示在反应期结束时剩余的裸抗(dar0)非常少，并且所得的adc产物是dar2-8种类的混合物(图4的a部分)。非还原adc产物的ce-sds结果显示存在高百分比的游离轻链(l，18％)和缺少一条或两条轻链的结构(20％+18％)，表明发生在形成h-l链间二硫键的半胱氨酸残基处的偶联占高百分比(图5的a部分)。
[0108]
相反地，在类似的还原和偶联条件下，igg2(κ)更能大幅抵抗反应。h-l或h-h链间二硫键打开的百分比非常低，并且大多数igg2分子在反应期结束时保持为dar0(图4的b部分)。ce-sds谱图显示igg2(κ)adc产物中存在高百分比的完整抗体(lhhl，89％)，而游离轻链(l，～1％，表示轻链偶联药物)的水平极低(图5的b部分)。这些结果表明igg2(κ)分子中的二硫键比igg1抗体中的稳定得多。
[0109]
4.药物与工程抗体的偶联。
[0110]
hic谱图显示，基于工程抗体的adc产物(例如图4的c和d部分中的bb0500-2a和2b)由dar0-10种类的混合物组成，其中dar2种类占最高百分比(35-50％)，其次是dar0(注意dar0是指在偶联过程中未转化为adc的抗体(或其部分))、dar4和dar6种类(在10-25％的范围内)。dar8-10种类在混合物中占据非常小的百分比(《5％)(图4的c和d部分)。ce-sds结果验证了与igg1(κ)相比，工程抗体的总体还原抗性，尤其是仅占～2％的游离轻链(表示偶联的轻链)的h-l链间二硫键(图5的c部分)。因此，所得的adc产物主要由仅含重链的偶联物组成。
[0111]
5.位点选择性药物偶联。
[0112]
由本公开的特定工程抗体制成的adc主要是dar2 adc种类(如图4的e部分和图4的f部分中所示约为60-70％，其中adc中的抗体分别是bb0500-2g和bb0500-2n，并且如图4的g部分和图4的h部分所示约70-80％，其中adc中的抗体分别是br0301和br0302)。这些克隆中铰链区的序列被认为使得hg3半胱氨酸之间的h-h链间二硫键比其余的链间二硫键更易于还原，使得hg3半胱氨酸成为优选的或主要的药物偶联位点。含有不同的围绕hg3半胱氨酸的铰链氨基酸序列的抗体需要不同的还原和偶联条件以获得dar2为主的adc产物。ce-sds谱图显示这些adc产品中存在极低水平(～1％)的游离轻链(表示轻链偶联药物)(图5的d部分)。
[0113]
通过lc-ms和lc-ms/ms分析，在非还原条件下用胰蛋白酶消化评估工程抗体的二硫键模式。通过它们的分子量和序列鉴定所有二硫键连接的肽。当结合lc-uv和lc-ms检测时，总序列覆盖率为100％。验证了含有cys 142的轻链和重链之间的二硫键，以及两条重链之间的额外二硫键(源于铰链区中cppcp序列上游的附加cys)。其他14个二硫键连接与典型的igg1型二硫键连接一致。
[0114]
偶联后，偶联位点通过肽图谱中的晚期洗脱峰的特征来确定。峰的分布基于观察
到的偶联的肽的质量和ms/ms谱。主要的偶联位点被确定为重链铰链区的cppcp序列上游的附加cys残基。还检测到铰链区中cppcp序列中cys残基的低水平偶联。这与铰链区中两条重链之间的链间二硫键处的预期偶联位点一致。
[0115]
6.不同的工程抗体与蛋白egfr、her2或her3的结合活性
[0116]
使用elisa法检测并比较工程抗体和对照野生型(wt)抗体之间的egfr、her2或her3结合能力。将人egfr、her2和her3蛋白包被在96孔板上，并将平板孵育过夜。稀释工程抗体样品或相应的对照抗体。然后将稀释的样品转移到蛋白包被的平板上并在室温下孵育。使用hrp标记的山羊抗人igg fc抗体(sigma)作为检测试剂，并使用tmb进行比色反应，在450/650nm下用酶标仪(美谷分子仪器，spectramax 190)读取酶标板上的吸光度，并使用四参数逻辑模型的剂量反应曲线格式进行数据分析。
[0117]
图6中的结果显示，与相应的对照相比，不同靶点的工程抗体具有相似的结合活性，表明新形的工程抗体不影响工程抗体对靶蛋白的活性。
[0118]
7.由工程抗体制成的adc对egfr高/低表达细胞的细胞毒性。
[0119]
为了研究衍生自工程抗体的adc的细胞毒性，在基于比色的细胞毒性试验中评估对靶点表达癌细胞的体外细胞毒性。为进行试验，将靶细胞以每个细胞系的优化细胞密度接种到96孔平底组织培养板中，并在37℃、5％co2下孵育过夜(16-20小时)。将连续稀释的adc样本转移至细胞平板，并将待测平板培养一段特定的时间(3-5天，取决于细胞系)，以实现最佳杀伤效果。数据分析采用四参数逻辑模型的剂量反应曲线。图7中的结果显示，包含由bb0500-2f、2g或2n的工程抗体部分制成的含有艾立布林的egfr靶向adc对egfr高表达细胞(a431细胞，图7的a部分)和egfr低表达细胞(nugc3细胞，图7的b部分)发挥有效的细胞毒性。类似地，包含bb0301或bb0302的抗体部分的含有mmae的her2靶向adc的结果显示其对her2高表达细胞(nci-n87细胞，图7的c部分)和her2低表达细胞(a431细胞，图7的d部分)发挥有效的细胞毒性。
[0120]
序列表
[0121]
seq id no:1-13和28在表1中提供。
[0122]
seq id no:14(bb0500-3重链):
[0123]
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[0124]
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[0125]
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[0126]
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[0127]
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[0128]
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[0129]
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[0130]
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[0131]
seq id no:15(bb0500-5重链):
[0132]
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[0133]
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[0134]
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[0135]
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[0136]
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[0137]
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[0138]
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[0139]
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[0140]
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[0141]
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[0142]
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[0144]
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[0145]
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[0146]
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[0147]
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[0148]
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[0149]
seq id no:17(bb0500-2b重链):
[0150]
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[0151]
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[0153]
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[0157]
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[0159]
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[0160]
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[0161]
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[0162]
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[0163]
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[0164]
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[0165]
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[0166]
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[0167]
seq id no:19(bb0500-2f重链):
[0168]
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[0169]
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技术特征：
1.一种分离的igg抗体，所述igg抗体包含：两条完全相同的重链，每条重链包含(a)铰链区，所述铰链区包含以下氨基酸序列：-(x1)-c-(x2)-cppcp-，其中x1为具有0-7个氨基酸残基的多肽片段，每个氨基酸残基独立地选自非半胱氨酸残基的任何氨基酸残基，并且x2为具有2-7个氨基酸残基的多肽片段，每个氨基酸残基独立地选自非半胱氨酸残基的任何氨基酸残基；和(b)位于所述铰链区上游并与所述铰链区连接的ch1结构域，所述ch1结构域在根据imgt编号规则的第142位包含一个半胱氨酸。2.如权利要求1所述的igg抗体，其中所述igg抗体还包含两条完全相同的kappa轻链。3.如权利要求1-2任一项所述的igg抗体，其中所述igg抗体的ch1结构域具有与天然人igg2、igg3或igg4亚类抗体的ch1结构域相同的序列。4.如权利要求1-2任一项所述的igg抗体，其中所述igg抗体的ch1结构域的序列与具有s142c突变的天然人igg1抗体的ch1结构域的序列相同。5.如权利要求1-4任一项所述的igg抗体，其中每条所述重链还包含天然人igg1、igg2、igg3或igg4亚类抗体的位于所述铰链区下游并与所述铰链区连接的ch2-ch3结构域，其中所述ch2-ch3任选地包括一个或多个突变。6.如权利要求1-5任一项所述的igg抗体，其中所述铰链区包含的氨基酸序列选自由以下组成的组：(a)ckthtcppcp(seq id no:1)；(b)dktchtcppcp(seq id no:2)；(c)erkscvecppcp(seq id no:3)；(d)epkscdkthtcppcp(seq id no:4)；(e)epksdckthtcppcp(seq id no:5)；(f)epksdkcthtcppcp(seq id no:6)；(g)epksdckthtvecppcp(seq id no:7)；(h)epksdcktvecppcp(seq id no:8)；(i)epksdkcthtvecppcp(seq id no:9)；(j)eppkscdkthtvecppcp(seq id no:10)；(k)eppksdckthtvecppcp(seq id no:11)；(l)epppkscdkthtvecppcp(seq id no:12)；(m)eppppkscdkthtvecppcp(seq id no:13)；和(n)eppksdcktktvecppcp(seq id no:28)。7.如权利要求1-6任一项所述的igg抗体，其中所述铰链区包含的氨基酸序列为eppksdcktktvecppcp(seq id no:28)。8.如权利要求1-6任一项所述的igg抗体，其中夹在两条重链的x1和x2之间的半胱氨酸残基之间形成二硫键。9.如权利要求1-8任一项所述的igg抗体，其中所述igg抗体还包含fab结构域，所述fab结构域与抗原特异性结合，所述抗原选自由以下组成的组：egfr、her2、her3、bcma、b7h3、cea、ceacam6、claudin 18.2、c-met、叶酸受体、cd3、cd19、cd20、cd22、cd25、cd27l、cd30、
cd33、cd37、cd48、cd56、cd70、cd73、cd74、cd79b、cd98、cd138、cd309(vegfr2)、胶原iv、内皮素受体etb、enpp3、纤维连接蛋白额外结构域b、gcc、gpnmb、liv-1(zip6)、muc1、muc16、间皮素、napi2b、粘连蛋白4、p-钙粘蛋白、骨膜蛋白、psma、sc-16(抗-fyn3)、slc44a4、sltrk6、steap1、肌腱蛋白c、组织因子、trop2和5t4(tpbg)。10.一种分离的igg抗体，所述igg抗体包含以下之一：(a)两条相同的重链，每条重链包含如seq id no:14所示的氨基酸序列；和两条轻链，每条轻链包含如seq id no:23所示的氨基酸序列；(b)两条相同的重链，每条重链包含如seq id no:15所示的氨基酸序列；和两条轻链，每条轻链包含如seq id no:23所示的氨基酸序列；(c)两条相同的重链，每条重链包含如seq id no:16所示的氨基酸序列；和两条轻链，每条轻链包含如seq id no:23所示的氨基酸序列；(d)两条相同的重链，每条重链包含如seq id no:17所示的氨基酸序列；和两条轻链，每条轻链包含如seq id no:23所示的氨基酸序列；(e)两条相同的重链，每条重链包含如seq id no:18所示的氨基酸序列；和两条轻链，每条轻链包含如seq id no:24所示的氨基酸序列；(f)两条相同的重链，每条重链包含如seq id no:19所示的氨基酸序列；和两条轻链，每条轻链包含如seq id no:25所示的氨基酸序列；(g)两条相同的重链，每条重链包含如seq id no:20所示的氨基酸序列；和两条轻链，每条轻链包含如seq id no:26所示的氨基酸序列；(h)两条相同的重链，每条重链包含如seq id no:21所示的氨基酸序列；和两条轻链，每条轻链包含如seq id no:25所示的氨基酸序列；(i)两条相同的重链，每条都包含如seq id no:22所示的氨基酸序列；和两条轻链，每条轻链包含如seq id no:27所示的氨基酸序列；(j)两条相同的重链，每条重链包含如seq id no:29所示的氨基酸序列；和两条轻链，每条轻链包含如seq id no:31所示的氨基酸序列；和(k)两条相同的重链，每条重链包含如seq id no:30所示的氨基酸序列；和两条轻链，每条轻链包含如seq id no:32所示的氨基酸序列。11.一种抗体偶联药物(adc)或其药学上可接受的盐，其包含：如权利要求1-10中任一项所述的igg抗体通过化学连接子与细胞毒性药物偶联。12.如权利要求9所述的adc或其药学上可接受的盐，其中所述细胞毒性药物选自由以下组成的组：单甲基奥瑞他汀e(mmae)、单甲基奥瑞他汀f(mmaf)、奥瑞他汀e、奥瑞他汀f、美登素dm1和dm4、美登素醇、山德霉素、吡咯并苯并二氮杂卓、吡咯并苯并二氮杂卓二聚体、蒽环类、卡奇霉素、多拉司他汀10、多卡霉素、多柔比星、泰兰斯他汀a、钩霉素、鹅膏菌素、蓖麻毒素、白喉毒素、艾立布林、
131
i、白细胞介素、肿瘤坏死因子、趋化因子、伊立替康(sn38)、依喜替康、依喜替康衍生物和纳米颗粒。13.如权利要求11-12任一项所述的adc或其药学上可接受的盐，其中所述化学连接子包含的部分选自由以下组成的组：6-马来酰亚胺基己酰基(mc)、马来酰亚胺丙酰基(mp)、缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(ala-phe)、对氨基苄氧羰基(pab)、6-马来酰亚胺基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基(mc-val-cit-pab)、mal-peg
n-val-cit-pab
(n＝1-20)、phe-lys(fmoc)-pab、aloc-d-ala-phe-lys(aloc)-pab-pnp、boc-phe-(alloc)lys-pab-pnp和3-(吡啶-2-基二硫基)丙酸全氟苯基酯。14.如权利要求11-13中任一项所述的adc或其药学上可接受的盐，其中所述抗体的两条重链分别包含如seq id no:21所示的氨基酸序列，所述抗体的两条轻链分别包含如seq id no:25所示的氨基酸序列，并且其中所述细胞毒性药物是艾立布林或mmae。15.如权利要求11-13中任一项所述的adc或其药学上可接受的盐，其中所述抗体的两条重链分别包含如seq id no:19所示的氨基酸序列，所述抗体的两条轻链分别包含如seq id no:25所示的氨基酸序列，并且其中所述细胞毒性药物是艾立布林或mmae。16.如权利要求11-13中任一项所述的adc或其药学上可接受的盐，其中所述抗体的两条重链分别包含如seq id no:20所示的氨基酸序列，所述抗体的两条轻链分别包含如seq id no:26所示的氨基酸序列，并且其中所述细胞毒性药物是艾立布林或mmae。17.如权利要求11-13中任一项所述的adc或其药学上可接受的盐，其中所述抗体的两条重链分别包含如seq id no:29所示的氨基酸序列，所述抗体的两条轻链分别包含如seq id no:31所示的氨基酸序列，并且其中所述细胞毒性药物是艾立布林或mmae。18.如权利要求11-13中任一项所述的adc或其药学上可接受的盐，其中所述抗体的两条重链分别包含如seq id no:30所示的氨基酸序列，所述抗体的两条轻链分别包含如seq id no:32所示的氨基酸序列，并且其中所述细胞毒性药物是艾立布林或mmae。19.如权利要求11-18中任一项所述的adc或其药学上可接受的盐的制剂，其中至少80％的adc是通过抗体重链上的半胱氨酸与化学连接子偶联。20.如权利要求11-19中任一项所述的adc或其药学上可接受的盐的制剂，其中药物抗体比(dar)为2的adc分子占adc分子总量的60％以上。21.一种抗体偶联药物(adc)或其药学上可接受的盐，其包含以下反应的产物：如权利要求1-10中任一项所述的igg抗体，所述igg抗体经历了至少部分还原，使得所述抗体的铰链区中对应半胱氨酸之间的至少一些h-h二硫键被还原为游离的巯基；和连接到细胞毒性药物分子的包含末端硫醇反应基团的化学连接子。22.一种生产dar2的抗体偶联药物(adc)或其药学上可接受的盐的方法，所述方法包含：还原夹在如权利要求1-10中任一项所述的igg抗体的铰链区中的两条重链上的x1和x2之间的每个半胱氨酸残基之间的h-h二硫键，以获得游离的巯基；和使含有末端硫醇反应基团的化学连接子反应，从而使抗体的两条重链分别通过化学连接子偶联一个细胞毒性药物分子。

技术总结
本发明提供了一种分离的IgG抗体，其包含两条完全相同的重链，每条重链含有铰链区，所述铰链区的氨基酸序列在天然IgG铰链区的CPPCP序列中两个半胱氨酸的上游含有一个附加的半胱氨酸，以及根据IMGT编号规则在第142位含有一个半胱氨酸的CH1结构域。本发明还提供了基于具有该结构的抗体的ADC。了基于具有该结构的抗体的ADC。


技术研发人员：夏冰 周宇虹 魏紫萍 杨剑锋
受保护的技术使用者：百力司康生物医药（杭州）有限公司
技术研发日：2021.11.19
技术公布日：2023/8/5