山楂籽中总黄酮的提取、分离、纯化方法

1.本发明属于提取工艺技术领域，涉及山楂籽中总黄酮的提取、分离、纯化方法。


背景技术：

2.山楂，俗名山里红、红果、棠棣、绿梨、酸楂，蔷薇科山楂属，是中国特有的药果兼用树种，其抗衰老作用位居群果之首。
3.山楂果可生吃或作果脯果糕，干制后可入药，具有降血脂、血压、强心、抗心律不齐等作用，同时也是健脾开胃、消食化滞、活血化痰的良药，对胸膈脾满、疝气、血淤、闭经等症有很好的疗效。山楂籽约占山楂总重的1/3，其所含成分与果肉差不多，同样具有显著降低血清中的胆固醇、抗氧化等功能。
4.在我国，每年山楂的使用量达数亿吨，其中数千万吨的山楂籽因得不到有效利用而当做废料丢弃，随着国家对资源节约、环境保护的日益重视，如何加强山楂籽的开发利用，变废为宝，发挥更好的经济效益和社会效益，是值得研究的课题。
5.到目前为止，已从山楂籽中分离、鉴定出271个成分，包括木脂素类、简单苯丙素类、黄酮类、挥发性组分和其他类成分。山楂籽提取物及其成分具有抗氧化活性、调节血脂功能，抗菌、抗肿瘤活性，抗炎和神经保护作用，此外，还具有促胃肠动力功能，抗心律失常和镇痛作用等。
6.山楂籽中具有含量丰富的黄酮类物质，对心血管系统具有明显且良好的治疗和保健功能。从山楂籽中提取黄酮类化合物，并将其应用在天然药物、食品添加剂或其他领域，能够充分提高山楂的利用率和经济价值。
7.近年来，对山楂籽黄酮提取工艺研究较多。“正交试验优选山楂籽中总黄酮的提取工艺，祝世发等，四川中医，2007年第25卷第5期”中通过正交试验优选山楂最佳提取工艺为采用10倍量、50％乙醇提取2次，每次0.5h。“超声波提取山楂籽总黄酮工艺优化及动力学研究，张巧明等，食品科技吗2020年第45卷第07期”中将超声波提取山楂籽总黄酮工艺条件优化为：超声温度45℃、乙醇浓度70％、超声时间90min，料液比为20:1(ml/g)，在该试验条件下，山楂籽总黄酮平均得率为7.26％。
8.传统的黄酮提取方法主要为采用甲醇、乙醇等有机溶剂提取，其对提取设备要求不高，适合大量生产，因此是目前企业首选的黄酮提取方法，但其溶剂用量大，提取效率不高。诸如超临界萃取、超声波辅助提取等现代提取技术，提取效率高、溶剂用量少，节省了人力物力，但其对设备要求高，且部分提取技术对设备参数要求精细，常应用于小型科研试验中，无法应用于工业生产。


技术实现要素：

9.本发明的主要目的在于提供一种山楂籽中总黄酮的提取、分离、纯化方法，采用该方法制备的总黄酮含量高，有效成分损失少。
10.为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
11.一种山楂籽中总黄酮的提取、分离、纯化方法，含有以下步骤：
12.步骤a，提取过程，山楂籽粉碎，加入复合酶，调节ph至4-6，在40-50℃温度下酶解1-3小时，调节ph至5-8，在50-70℃温度下继续酶解1-3小时，酶解后去除挥发性成分；加入乙醇，调节乙醇体积分数为50-80％，回流提取1-3小时，提取液备用；
13.步骤b，调节提取液ph为4-6，中加入壳聚糖-海藻酸钠复合物，低温静置，除去沉淀物，浓缩，大孔树脂吸附；吸附后的大孔树脂依次采用纯化水、体积分数为50-80％的乙醇溶液进行洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，得粗品，备用；
14.步骤c，步骤b所得粗品，进行凝胶柱层析，甲醇洗脱，收集红色色带，浓缩，干燥，即得。
15.进一步的，步骤a中，复合酶含有木质素酶、木聚糖酶、纤维素酶、β-葡糖苷酶，使用比例为1:0.5-1.5:2-6:1-4；进一步优选的，使用比例为1:0.8-1:2.5-4:2-3。
16.所述复合酶的使用量为山楂籽重量的0.05-0.2％；进一步优选的，所述的复合酶的使用量为山楂籽重量的0.1-0.15％。
17.步骤b中，壳聚糖-海藻酸钠复合物中，壳聚糖、海藻酸钠的比例为2-7:3-10；进一步优选的，壳聚糖、海藻酸钠的使用比例为3-5:4-7。
18.所述的壳聚糖-海藻酸钠复合物的使用量为10-20g/l；进一步优选为13-16g/l。
19.步骤b中，大孔树脂为hpd-600大孔树脂；步骤c中，葡聚糖凝胶柱为sepharose 6b琼脂糖凝胶。
20.具体的，上述方法含有以下步骤：
21.步骤a，提取过程，山楂籽粉碎，加入复合酶，调节ph至4.5-5.5，在40-50℃温度下酶解1-3小时，调节ph至6-7.5，在50-70℃温度下继续酶解1-3小时，酶解后采用蒸馏方式，去除挥发性成分；加入乙醇，调节乙醇体积分数为60-70％，回流提取1-3小时，提取液备用；
22.步骤b，调节提取液ph为4-6，中加入壳聚糖-海藻酸钠复合物，低温静置，除去沉淀物，浓缩，hpd-600大孔树脂吸附；吸附后的大孔树脂依次采用纯化水、体积分数为60-70％的乙醇溶液进行洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，得粗品，备用；
23.步骤c，步骤b所得粗品，进行sepharose 6b琼脂糖凝胶层析，甲醇洗脱，收集红色色带，浓缩，干燥，即得。
24.本发明具有以下有益效果：
25.1.本发明研究过程中发现，山楂籽中的挥发性成分对黄酮的提取有较大的影响，因此采用先去除山楂籽中挥发油等挥发性成分后，再进行提取，可明显提高黄酮提取物的提取率。
26.2.在去除山楂籽中挥发性成分时，采用了先进行酶解的方式，在不同的ph及温度下，复合酶充分发挥了酶解的作用，极大的提高了山楂籽中挥发性成分的去除作用，有利于黄酮提取物的提取。
27.3.在分离阶段，先采用壳聚糖-海藻酸钠复合物去除提取物中的杂质，更有利于大孔树脂对黄酮成分的吸附，提高黄酮提取物中总黄酮的含量。
具体实施例
28.下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而
不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本技术权利要求所保护的范围。
29.实施例1
30.步骤a，提取过程，取山楂籽1kg粉碎，加4l去离子水，加入1.2g复合酶(木质素酶：木聚糖酶：纤维素酶：β-葡糖苷酶＝1:1:3:2.5)，调节ph至5.3，在45℃温度下酶解2小时，调节ph至7，在60℃温度下继续酶解2小时，酶解后进行水蒸气蒸馏，去除挥发油等挥发性成分；然后加入乙醇，调节乙醇体积分数为65％，回流提取2小时，提取液备用；
31.步骤b，分离过程，调节提取液ph为5，中加入60g壳聚糖-海藻酸钠复合物(壳聚糖：海藻酸钠＝3.5:5.5)，低温静置，除去沉淀物，浓缩，hpd-600大孔树脂吸附；吸附后的大孔树脂依次采用纯化水、体积分数为65％的乙醇溶液进行洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，得粗品，备用；
32.步骤c，纯化过程，步骤b所得粗品，进行sepharose 6b琼脂糖凝胶层析，甲醇洗脱，收集红色色带，浓缩，干燥，即得黄酮提取物。
33.实施例2
34.步骤a，提取过程，取山楂籽1kg粉碎，加4l去离子水，加入1g复合酶(木质素酶：木聚糖酶：纤维素酶：β-葡糖苷酶＝1:1.5:6:1)，调节ph至4，在45℃温度下酶解2小时，调节ph至5，在60℃温度下继续酶解2小时，酶解后采用蒸馏方式，去除挥发性成分；加入乙醇，调节乙醇体积分数为60％，回流提取1小时，提取液备用；
35.步骤b，分离过程，调节提取液ph为5，中加入64g壳聚糖-海藻酸钠复合物(壳聚糖：海藻酸钠＝1:10)，低温静置，除去沉淀物，浓缩，hpd-600大孔树脂吸附；吸附后的大孔树脂依次采用纯化水、体积分数为80％的乙醇溶液进行洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，得粗品，备用；
36.步骤c，纯化过程，步骤b所得粗品，进行sepharose 6b琼脂糖凝胶层析，甲醇洗脱，收集红色色带，浓缩，干燥，即得黄酮提取物。
37.实施例3
38.步骤a，提取过程，取山楂籽1kg粉碎，加4l去离子水，加入1.5g复合酶(木质素酶：木聚糖酶：纤维素酶：β-葡糖苷酶＝1:0.5:2:4)，调节ph至6，在45℃温度下酶解2小时，调节ph至8，在60℃温度下继续酶解2小时，酶解后采用蒸馏方式，去除挥发性成分；加入乙醇，调节乙醇体积分数为70％，回流提取3小时，提取液备用；
39.步骤b，分离过程，调节提取液ph为5，中加入52g壳聚糖-海藻酸钠复合物(壳聚糖：海藻酸钠＝7:3)，低温静置，除去沉淀物，浓缩，hpd-600大孔树脂吸附；吸附后的大孔树脂依次采用纯化水、体积分数为50％的乙醇溶液进行洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，得粗品，备用；
40.步骤c，纯化过程，步骤b所得粗品，进行sepharose 6b琼脂糖凝胶层析，甲醇洗脱，收集红色色带，浓缩，干燥，即得黄酮提取物。
41.实施例4
42.步骤a，提取过程，取山楂籽1kg粉碎，加4l去离子水，加入2g复合酶(木质素酶：木聚糖酶：纤维素酶：β-葡糖苷酶＝1:1.2:4:3)，调节ph至5.3，在45℃温度下酶解2小时，调节ph至7，在60℃温度下继续酶解2小时，酶解后采用蒸馏方式，去除挥发性成分；加入乙醇，调
节乙醇体积分数为50％，回流提取2小时，提取液备用；
43.步骤b，分离过程，调节提取液ph为5，中加入40g壳聚糖-海藻酸钠复合物(壳聚糖：海藻酸钠＝3.5:5.5)，低温静置，除去沉淀物，浓缩，hpd-600大孔树脂吸附；吸附后的大孔树脂依次采用纯化水、体积分数为65％的乙醇溶液进行洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，得粗品，备用；
44.步骤c，纯化过程，步骤b所得粗品，进行sepharose 6b琼脂糖凝胶层析，甲醇洗脱，收集红色色带，浓缩，干燥，即得黄酮提取物。
45.实施例5
46.步骤a，提取过程，取山楂籽1kg粉碎，加4l去离子水，加入0.5g复合酶(木质素酶：木聚糖酶：纤维素酶：β-葡糖苷酶＝1:1:3:2.5)，调节ph至5.5，在50℃温度下酶解3小时，调节ph至7.5，在70℃温度下继续酶解3小时，酶解后采用蒸馏方式，去除挥发性成分；加入乙醇，调节乙醇体积分数为80％，回流提取2小时，提取液备用；
47.步骤b，分离过程，调节提取液ph为6，中加入80g壳聚糖-海藻酸钠复合物(壳聚糖：海藻酸钠＝3.5:5.5)，低温静置，除去沉淀物，浓缩，hpd-600大孔树脂吸附；吸附后的大孔树脂依次采用纯化水、体积分数为70％的乙醇溶液进行洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，得粗品，备用；
48.步骤c，纯化过程，步骤b所得粗品，进行sepharose 6b琼脂糖凝胶层析，甲醇洗脱，收集红色色带，浓缩，干燥，即得黄酮提取物。
49.实施例6
50.步骤a，提取过程，取山楂籽1kg粉碎，加4l去离子水，加入1.2g复合酶(木质素酶：木聚糖酶：纤维素酶：β-葡糖苷酶＝1:0.8:2.2:2)，调节ph至5.3，在45℃温度下酶解2小时，调节ph至7，在60℃温度下继续酶解2小时，酶解后采用蒸馏方式，去除挥发性成分；加入乙醇，调节乙醇体积分数为65％，回流提取2小时，提取液备用；
51.步骤b，分离过程，调节提取液ph为5，中加入60g壳聚糖-海藻酸钠复合物(壳聚糖：海藻酸钠＝3:7)，低温静置，除去沉淀物，浓缩，hpd-600大孔树脂吸附；吸附后的大孔树脂依次采用纯化水、体积分数为65％的乙醇溶液进行洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，得粗品，备用；
52.步骤c，纯化过程，步骤b所得粗品，进行sepharose 6b琼脂糖凝胶层析，甲醇洗脱，收集红色色带，浓缩，干燥，即得黄酮提取物。
53.实施例7
54.步骤a，提取过程，取山楂籽1kg粉碎，加4l去离子水，加入1.2g复合酶(木质素酶：木聚糖酶：纤维素酶：β-葡糖苷酶＝1:1.2:4:3)，调节ph至5.5，在50℃温度下酶解3小时，调节ph至7.5，在70℃温度下继续酶解3小时，酶解后采用蒸馏方式，去除挥发性成分；加入乙醇，调节乙醇体积分数为65％，回流提取2小时，提取液备用；
55.步骤b，分离过程，调节提取液ph为6，中加入60g壳聚糖-海藻酸钠复合物(壳聚糖：海藻酸钠＝5:4)，低温静置，除去沉淀物，浓缩，hpd-600大孔树脂吸附；吸附后的大孔树脂依次采用纯化水、体积分数为70％的乙醇溶液进行洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，得粗品，备用；
56.步骤c，纯化过程，步骤b所得粗品，进行sepharose 6b琼脂糖凝胶层析，甲醇洗脱，
收集红色色带，浓缩，干燥，即得黄酮提取物。
57.实施例8
58.步骤a，提取过程，取山楂籽1kg粉碎，加4l去离子水，加入1.2g复合酶(木质素酶：木聚糖酶：纤维素酶：β-葡糖苷酶＝1:0.8:2.5:2)，调节ph至4.5，在40℃温度下酶解1小时，调节ph至6，在50℃温度下继续酶解1小时，酶解后采用蒸馏方式，去除挥发性成分；加入乙醇，调节乙醇体积分数为65％，回流提取2小时，提取液备用；
59.步骤b，分离过程，调节提取液ph为4，中加入60g壳聚糖-海藻酸钠复合物(壳聚糖：海藻酸钠＝3:7)，低温静置，除去沉淀物，浓缩，hpd-600大孔树脂吸附；吸附后的大孔树脂依次采用纯化水、体积分数为60％的乙醇溶液进行洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，得粗品，备用；
60.步骤c，纯化过程，步骤b所得粗品，进行sepharose 6b琼脂糖凝胶层析，甲醇洗脱，收集红色色带，浓缩，干燥，即得黄酮提取物。
61.对比实施例1
62.步骤a，提取过程，取山楂籽1kg粉碎，加4l去离子水，水蒸气蒸馏，去除挥发油等挥发性成分；然后加入乙醇，调节乙醇体积分数为65％，回流提取2小时，提取液备用；
63.步骤b，分离过程，调节提取液ph为5，中加入60g壳聚糖-海藻酸钠复合物(壳聚糖：海藻酸钠＝3.5:5.5)，低温静置，除去沉淀物，浓缩，hpd-600大孔树脂吸附；吸附后的大孔树脂依次采用纯化水、体积分数为65％的乙醇溶液进行洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，得粗品，备用；
64.步骤c，纯化过程，步骤b所得粗品，进行sepharose 6b琼脂糖凝胶层析，甲醇洗脱，收集红色色带，浓缩，干燥，即得黄酮提取物。
65.对比实施例2
66.步骤a，提取过程，取山楂籽1kg粉碎，加4l体积分数为65％的乙醇溶液，回流提取2小时，提取液备用；
67.步骤b，分离过程，调节提取液ph为5，中加入60g壳聚糖-海藻酸钠复合物(壳聚糖：海藻酸钠＝3.5:5.5)，低温静置，除去沉淀物，浓缩，hpd-600大孔树脂吸附；吸附后的大孔树脂依次采用纯化水、体积分数为65％的乙醇溶液进行洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，得粗品，备用；
68.步骤c，分离过程，步骤b所得粗品，进行sepharose 6b琼脂糖凝胶层析，甲醇洗脱，收集红色色带，浓缩，干燥，即得黄酮提取物。
69.对比实施例3
70.步骤a，提取过程，取山楂籽1kg粉碎，加4l去离子水，加入1.2g复合酶(木质素酶：木聚糖酶：纤维素酶：β-葡糖苷酶＝1:1:3:2.5)，调节ph至5.3，在45℃温度下酶解2小时，调节ph至7，在60℃温度下继续酶解2小时，酶解后进行水蒸气蒸馏，去除挥发油等挥发性成分；然后加入乙醇，调节乙醇体积分数为65％，回流提取2小时，提取液备用；
71.步骤b，分离过程，提取液浓缩，hpd-600大孔树脂吸附；吸附后的大孔树脂依次采用纯化水、体积分数为65％的乙醇溶液进行洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，得粗品，备用；
72.步骤c，纯化过程，步骤b所得粗品，进行sepharose 6b琼脂糖凝胶层析，甲醇洗脱，
收集红色色带，浓缩，干燥，即得黄酮提取物。
73.对比实施例4
74.步骤a，提取过程，取山楂籽1kg粉碎，加4l去离子水，加入2g复合酶(木质素酶：木聚糖酶：纤维素酶：β-葡糖苷酶＝1:2:1:5)，调节ph至7，在30℃温度下酶解2小时，调节ph至4.5，在40℃温度下继续酶解2小时，酶解后进行水蒸气蒸馏，去除挥发油等挥发性成分；然后加入乙醇，调节乙醇体积分数为65％，回流提取2小时，提取液备用；
75.步骤b，分离过程，调节提取液ph为7，中加入80g壳聚糖-海藻酸钠复合物(壳聚糖：海藻酸钠＝3.5:5.5)，低温静置，除去沉淀物，浓缩，hpd-600大孔树脂吸附；吸附后的大孔树脂依次采用纯化水、体积分数为45％的乙醇溶液进行洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，得粗品，备用；
76.步骤c，纯化过程，步骤b所得粗品，进行sepharose 6b琼脂糖凝胶层析，甲醇洗脱，收集红色色带，浓缩，干燥，即得黄酮提取物。
77.对比实施例5
78.步骤a，提取过程，取山楂籽1kg粉碎，加4l去离子水，加入1.2g复合酶(木质素酶：木聚糖酶：纤维素酶：β-葡糖苷酶＝1:1:3:2.5)，调节ph至5.3，在45℃温度下酶解2小时，调节ph至7，在60℃温度下继续酶解2小时，酶解后进行水蒸气蒸馏，去除挥发油等挥发性成分；然后加入乙醇，调节乙醇体积分数为65％，回流提取2小时，提取液备用；
79.步骤b，分离过程，调节提取液ph为5，中加入60g壳聚糖-海藻酸钠复合物(壳聚糖：海藻酸钠＝3.5:5.5)，低温静置，除去沉淀物，浓缩，d-101大孔树脂吸附；吸附后的大孔树脂依次采用纯化水、体积分数为65％的乙醇溶液进行洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，得粗品，备用；
80.步骤c，纯化过程，步骤b所得粗品，进行sephadex g-25葡聚糖凝胶层析，甲醇洗脱，收集红色色带，浓缩，干燥，即得黄酮提取物。
81.对比实施例6
82.步骤a，提取过程，取山楂籽1kg粉碎，加4l去离子水，加入1.2g复合酶(果胶酶：淀粉酶：纤维素酶：菠萝蛋白＝1:1:3:2.5)，调节ph至5.3，在45℃温度下酶解2小时，调节ph至7，在60℃温度下继续酶解2小时，酶解后进行水蒸气蒸馏，去除挥发油等挥发性成分；然后加入乙醇，调节乙醇体积分数为65％，回流提取2小时，提取液备用；
83.步骤b，分离过程，调节提取液乙醇体积分数为80％静置过夜，除去沉淀物，浓缩，hpd-600大孔树脂吸附；吸附后的大孔树脂依次采用纯化水、体积分数为65％的乙醇溶液进行洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，得粗品，备用；
84.步骤c，纯化过程，步骤b所得粗品，进行sepharose 6b琼脂糖凝胶层析，甲醇洗脱，收集红色色带，浓缩，干燥，即得黄酮提取物。
85.对比实施例7
86.步骤a，提取过程，取山楂籽1kg粉碎，加4l去离子水，水蒸气蒸馏，去除挥发油等挥发性成分；冷却后，加入1.2g复合酶(木质素酶：木聚糖酶：纤维素酶：β-葡糖苷酶＝1:1:3:2.5)，调节ph至5.3，在45℃温度下酶解2小时，调节ph至7，在60℃温度下继续酶解2小时，酶解后加热灭活；冷却后加入乙醇，调节乙醇体积分数为65％，回流提取2小时，提取液备用；
87.步骤b，分离过程，调节提取液ph为5，中加入60g壳聚糖-海藻酸钠复合物(壳聚糖：
海藻酸钠＝3.5:5.5)，低温静置，除去沉淀物，浓缩，hpd-600大孔树脂吸附；吸附后的大孔树脂依次采用纯化水、体积分数为65％的乙醇溶液进行洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，得粗品，备用；
88.步骤c，纯化过程，步骤b所得粗品，进行sepharose 6b琼脂糖凝胶层析，甲醇洗脱，收集红色色带，浓缩，干燥，即得黄酮提取物。
89.指标测试
90.一、挥发油提取率
91.分别测定实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、对比实施例1、对比实施例4、对比实施例6步骤a中挥发油的提取率，结果见表1。
92.挥发油提取率(％)＝提取的山楂籽挥发油质量(g)/山楂籽原料质量(g)
×
100％
93.表1各实施例挥发油提取率
[0094][0095][0096]
对比实施例1中，山楂籽未进行酶解，其挥发油的提取率仅4.16％，远远低于各实施例；对比实施例2中酶的使用比例超出本发明保护范围，其挥发油的提取率仅为6.28％，高于对比实施例1，但较各实施例明显偏低；对比实施例6中的复合酶与各实施例均不相同，采用该复合酶进行酶解后，挥发油的提取率为5.34，提取效果虽优于对比实施例1，但较其他实施例，明显较差；可见，采用本发明复合酶进行酶解后，去除挥发油的效果更佳。
[0097]
二、黄酮提取率
[0098]
以芦丁为参照品，分别测定实施例1-6、对比实施例1-6中所得黄酮提取物中黄酮的纯度。
[0099]
精确称量芦丁标准品2.00mg，60％乙醇溶解后定容至50ml，摇匀后作为标准品溶液使用。精确移取芦丁标准品溶液0.0、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0ml，分别置于10ml容量瓶中，加60％乙醇溶液补充至5ml，加入5％亚硝酸钠0.4ml，放置5min后加入10％硝酸铝溶液，放置5min，再加入4％氢氧化钠溶液4ml，蒸馏水定容至刻度，摇匀，放置15min后，在510nm条件下测定吸光度，得标准曲线。
[0100]
取实施例1-6、对比实施例1-6所得黄酮提取物，测定总黄酮含量，结果如下表2所示。
[0101]
表2各实施例中黄酮的提取量
[0102][0103][0104]
对比实施例2中，在提取过程未去除挥发油性成分，其最终的黄酮提取物的得率最低，仅7.31％，在经过分离、纯化后，黄酮提取物中的总黄酮含量较高，可见山楂籽中挥发性成分对黄酮的提取物有较大的影响；对比实施例1中，提取阶段山楂籽未进行酶解，直接采用水蒸气蒸馏方式去除挥发性成分、对比实施例4中复合酶的使用比例超出本发明保护范围、对比实施例6中复合酶与本发明明显不同、对比实施例7中采用先去除挥发性成分、后进行酶解的方式提取，其黄酮提取物的得率均较低，可见酶解过程对山楂籽中挥发性成分的去除有着重要的作用，将山楂籽进行酶解后，可在一定程度上改变山楂籽中的结构，更有利于挥发性成分的提取与去除；对比实施例3中未采用壳聚糖-海藻酸钠复合物进行絮凝去杂，其黄酮提取物率率偏高，但其中总黄酮含量偏低，杂质较多；对比实施例5中使用的大孔树脂与凝胶柱与本发明不同，其黄酮提取物得率较低，且黄酮提取物中的总黄酮含量较低。

技术特征：
1.一种山楂籽中总黄酮的提取、分离、纯化方法，含有以下步骤：步骤a，提取过程，山楂籽粉碎，加入复合酶，调节ph至4-6，在40-50℃温度下酶解1-3小时，调节ph至5-8，在50-70℃温度下继续酶解1-3小时，酶解后去除挥发性成分；加入乙醇，调节乙醇体积分数为50-80％，回流提取1-3小时，提取液备用；步骤b，调节提取液ph为4-6，加入壳聚糖-海藻酸钠复合物，低温静置，除去沉淀物，浓缩，大孔树脂吸附；吸附后的大孔树脂依次采用纯化水、体积分数为50-80％的乙醇溶液进行洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，得粗品，备用；步骤c，步骤b所得粗品，进行凝胶柱层析，甲醇洗脱，收集红色色带，浓缩，干燥，即得。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤a中复合酶含有木质素酶、木聚糖酶、纤维素酶、β-葡糖苷酶；所述的木质素酶、木聚糖酶、纤维素酶、β-葡糖苷酶使用比例为1:0.5-1.5:2-6:1-4。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的木质素酶、木聚糖酶、纤维素酶、β-葡糖苷酶使用比例为1:0.8-1:2.5-4:2-3。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤a中复合酶的使用量为山楂籽重量的0.05-0.2％。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的复合酶的使用量为山楂籽重量的0.1-0.15％。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤b中壳聚糖-海藻酸钠复合物中，壳聚糖、海藻酸钠的比例为2-7:3-10。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的壳聚糖、海藻酸钠的使用比例为3-5:4-7。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的壳聚糖-海藻酸钠复合物的使用量为10-20g/l。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的壳聚糖-海藻酸钠复合物的使用量为13-16g/l。10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤b中大孔树脂为hpd-600大孔树脂；步骤c中葡聚糖凝胶柱为sepharose6b琼脂糖凝胶。

技术总结
本发明公开了一种山楂籽中总黄酮的提取、分离、纯化方法，属于天然产物提取、分离、纯化技术领域。本发明所述的方法包含酶解、去除挥发性成分、去杂、大孔树脂吸附、成分洗脱、凝胶柱纯化等步骤。利用本发明所述方法对山楂籽中总黄酮进行提取、分离、纯化，黄酮提取物的得率在10％以上，黄酮提取物中总黄酮含量在93％以上。上。


技术研发人员：刘雪平 张永涛 赵莉 崔晓梅 刘凌霄 顾召帅 李静 唐洪杰 王靖 黄莉
受保护的技术使用者：浙江大学山东（临沂）现代农业研究院
技术研发日：2023.06.27
技术公布日：2023/8/5