抗PD-L1抗体及其制备和使用方法与流程

抗pd-l1抗体及其制备和使用方法
1.本技术是中国发明专利申请(申请号：2018800382750；发明名称：抗pd-l1抗体及其制备和使用方法)的分案申请。
2.相关申请的交叉引用
3.本技术要求2017年6月25日提交的美国临时专利申请no.62524553的权益，该申请全部内容通过引用明确地并入本文。
技术领域
4.本公开一般涉及抗体技术领域，更具体地涉及抗pd-l1抗体的制备和使用。


背景技术：

5.癌症是全世界的主要健康问题。仅在美国，据估计，2016年就诊断出了1,685,210例新癌症病例，并有595,690例死亡(http:/www.cancer.gov)。因此，任何可降低癌症严重性或死亡率的药剂都是理想的。
6.在免疫系统中，通过由抗原呈递细胞(apc)呈递的外源抗原肽通过t细胞受体(tcr)递送的初级信号，可以活化静息t细胞以应答抗原。除了该初级信号之外，还存在进一步影响t细胞应答的次级正、负共刺激信号。完全t细胞活化需要次级正信号(lafferty等人，ausl.j.exp.biol.med.sci.5327-42(1975))。负的次级信号可导致t细胞抑制和耐受。
7.程序性死亡1(pd-1)是cd28受体家族的成员并且在t细胞和其他细胞类型上表达。pd-1是用于将负的次级信号传输到t细胞中的路径之一。pd-l1是pd-1的细胞表面配体糖蛋白，其显示在结合pd-1时下调t细胞活化(freeman等人，j.exp.med.1921027-34(2000))。
8.癌性肿瘤可以采用多种机制来避免宿主免疫系统的检测和/或破坏。多种肿瘤使用的一种方法是通过在肿瘤细胞表面表达pd-l1来抑制免疫t细胞应答。当pd-l1在t细胞表面与其受体pd-1结合时，负的共刺激信号被送入t细胞，导致t细胞的抑制。以这种方式，肿瘤细胞能够避免t细胞介导的宿主免疫系统应答。
9.pd-l1，也称为b7-h1或cd274，是40kda的1型跨膜蛋白，其已经显示在几种人类癌症中表达并且与增加的肿瘤侵袭性和增加的死亡风险相关(thomson等人，pnas101:17174-9(2004))。认为pd-l1在癌症中的表达可通过抑制t细胞来抑制对肿瘤的免疫应答(dong等人，nat.med.8793-800(2002))。
10.虽然能够结合pd-l1并阻断负的共刺激信号抑制t细胞应答的药剂已经显示增加宿主对癌性肿瘤的免疫应答，但对癌症患者的有益反应却不同(参见reiss等人，免疫疗法(immunotherapy)6:459-75(2014))。对于开发用于癌症治疗的最有效的和肿瘤细胞特异性的抗pd-l1抗体，最佳pd-l1结合位点和相关亲和力仍然不清楚。


技术实现要素：

11.本发明尤其提供了抗pd-l1单克隆抗体、其抗原结合部分、其治疗组合物和/或编码其的核酸，以及它们在癌症和其他t细胞功能障碍病症的治疗中上调t细胞的功能以增强
细胞介导的免疫应答的用途。
12.一方面，本技术提供对人pd-l1具有结合特异性的分离的单克隆抗体(mab)或其抗原结合片段。
13.在一个实施方案中，分离的mab或抗原结合片段包含与seq id no:4、seq id no:8、seq id no:12、seq id no:16、seq id no:20、seq id no:24、seq id no:28、seq id no:32、seq id no:36、seq id no:40、seq id no:44、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:56、seq id no:60、seq id no:64、seq id no:68或seq id 72或seq id no：80具有百分比同源性的氨基酸序列。同源性百分比可以处于或高于70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或70-100％之间的任何范围的水平。
14.在一个实施方案中，分离的mab或抗原结合片段对pd-l1的结合亲和力kd不大于30nm、40nm，50nm、60nm、70nm、80nm、90nm或100nm。
15.在一个实施方案中，分离的mab或抗原结合片段可以表现出一种或多种功能特性。功能特性的实例包括与pd-l1的高亲和力结合、抑制pd-l1与pd-1的结合、增强t细胞活化、刺激抗体应答的能力和/或逆转免疫抑制细胞如t调节细胞的抑制功能的能力。在一个实施方案中，分离的mab或抗原结合片段可通过t细胞增殖、ifn-γ和/或il-2分泌或其组合增强t细胞活化。
16.分离的mab或抗原结合片段可包括人构架区。在一个实施方案中，分离的mab或抗原结合片段可包括人源化抗体、嵌合抗体或重组抗体。
17.在一个实施方案中，分离的mab可以是igg家族中的抗体。在一个实施方案中，分离的mab是igg。在一个实施方案中，分离的mab可以是双特异性抗体、三特异性抗体或多特异性抗体。在一个实施方案中，抗原结合片段可包括fv、fab、f(ab')2、scfv或scfv2片段。
18.在一个实施方案中，分离的mab或抗原结合片段可包括igg1重链，其包含与seq id no:7、seq id no:15、seq id no:23、seq id no:31、seq id no:39、seq id no:47、seq id no:55、seq id no:63、seq iid no:71或seq id no：79具有百分比同源性的氨基酸序列。在一个实施方案中，同源性百分比可以处于或高于70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或70-100％之间的任何范围的水平。
19.在一个实施方案中，分离的mab或抗原结合片段可包括κ轻链，其包含与seq id no:3、seq id no:11、seq id no:19、seq id no:27、seq id no:35、seq id no:43、seq id no:51、seq id no:59、seq id no:67和seq id no：75具有百分比同源性的氨基酸序列。在一个实施方案中，同源性百分比可以处于或高于70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或70-100％之间的任何范围的水平。
20.在一个实施方案中，分离的mab或抗原结合片段可包括可变轻链，其包含与seq id no:4、seq id no:12、seq id no:20、seq id no:28、seq id no:36、seq id no:44、seq id no:52、seq id no:60、seq id no:68或seq id no：76具有百分比同源性的氨基酸序列。在一个实施方案中，同源性百分比可以处于或高于70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或70-100％之间的任何范围的水平。
21.在一个实施方案中，分离的mab或抗原结合片段可包括可变轻链，其包含与seq id no:8、seq id no:16、seq id no:24、seq id no:32、seq id no:40、seq id no:48、seq id no:56、seq id no:64和id no：72或seq id no：80具有百分比同源性的氨基酸序列。在一个
实施方案中，同源性百分比可以处于或高于70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或70-100％之间的任何范围的水平。
22.本技术还提供了编码分离的mab或其公开的抗原结合片段的分离的核酸。在一个实施方案中，核酸编码与igg1重链seq id no：7、seq id no：15、seq id no：23、seq id no：31、seq id no：39、seq id no：47、seq id no：55、seq id no：63、seq id no：71或seq id no：79具有百分比同源性的氨基酸序列。在一个实施方案中，核酸编码与κ轻链seq id no：3、seq id no：11、seq id no：19、seq id no：27、seq id no：35、seq id no：43、seq id no：51、seq id no：59、seq id no：67或seq id no：75具有百分比同源性的氨基酸序列。在一个在实施方案中，核酸编码与可变轻链seq id no：4、seq id no：12、seq id no：20、seq id no：28、seq id no：36、seq id no：44、seq id no：52、seq id no：60、seq id no:68或seq id no：76具有百分比同源性的氨基酸序列。在一个实施方案中，核酸编码与可变重链seq id no：8、seq id no：16、seq id no：24、seq id no：32、seq id no：40、seq id no：48、seq id no：56、seq id no：64、seq id no：72或seq id no：80具有百分比同源性的氨基酸序列。在一个实施方案中，同源性百分比可以处于或高于70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或70-100％之间的任何范围的水平。
23.本技术还提供了含有一种或多种本文公开的核酸序列的表达载体。在一些实施方案中，核酸序列编码本文公开的肽或蛋白质。
24.在一个实施方案中，本文所述的表达载体可存在于细胞中并可表达。在一个实施方案中，所述细胞是宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。在另一方面，本技术提供了制备所公开的抗体或其抗原结合片段的方法。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：提供了含有可在宿主细胞中表达的表达载体的宿主细胞，该表达载体包含本文公开的核酸序列；以通过表达上述核酸序列产生抗体。
25.本技术还提供了包含抗pd-l1抗体或其片段的免疫缀合物。在一个实施方案中，免疫缀合物包含通过接头与抗pdl1 mab或其抗原结合片段连接的药物单元或显像剂。
26.接头可以是可切割的或不可切割的。在一个实施方案中，接头是化学接头。在一个实施方案中，接头包含共价键，例如酯键、醚键、胺键、酰胺键、二硫键、酰亚胺键、砜键、磷酸键(phosphate bond)、磷酸酯键(phosphorus ester bond)、肽键、腙键或其组合。在一个实施方案中，接头包含疏水性聚(乙二醇)接头。在一个实施方案中，接头包含肽键。
27.在一个实施方案中，免疫缀合物中的药物单元可以是化疗剂、生长抑制剂、卡利奇霉素类药物单元、抗有丝分裂剂、毒素、放射性同位素、治疗剂或其组合。在一个实施方案中，药物单元包含卡利奇霉素、奥佐米星(ozogamicin)、单甲基澳瑞他汀e、美坦新(emtansine)、其衍生物或组合。
28.在一个实施方案中，药物单元选自细胞毒性剂、免疫调节剂、显像剂或其组合。在一个实施方案中，细胞毒性剂选自生长抑制剂或来自一类微管蛋白结合剂、dna嵌入剂、dna烷化剂、酶抑制剂、免疫调节剂、抗代谢剂、放射性同位素或其组合的化疗剂。在一个实施方案中，细胞毒性剂选自卡利奇霉素、奥佐米星、单甲基澳瑞他汀e、美坦新(emtans ine)、其衍生物或组合。在一个实施方案中，免疫调节剂激活或抑制免疫细胞、t细胞、nk细胞、b细胞、巨噬细胞或树突细胞。
29.在一个实施方案中，成像剂可以是放射性核素、荧光剂、量子点或其组合。
30.本技术还提供了药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物可包括本文公开的分离的mab或抗原结合片段和药学上可接受的载体。在一个实施方案中，药物组合物包括本文公开的免疫缀合物和药学上可接受的载体。
31.在一个实施方案中，药物组合物可以进一步包括放射性同位素、放射性核素、毒素、治疗剂、化疗剂或其组合。在一个实施方案中，药物组合物可以包括药物单元，特异性结合人pd-l1的分离的mab或抗原结合片段以及药学上可接受的载体。
32.可用于本技术的药物单元的实例可以包括但不限于卡培他滨、顺铂、环磷酰胺、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿霉素、环磷酰胺、氮芥、长春新碱、丙卡巴肼、泼尼松龙、博来霉素、长春碱、达卡巴嗪、依托泊苷、表柔比星、培美曲塞、叶酸、吉西他滨、奥沙利铂、伊立替康、托泊替康、喜树碱、多西他赛、紫杉醇、氟维司群、他莫昔芬、来曲唑、依西美坦、阿那曲唑、氨鲁米特、睾内酯、伏氯唑、法罗唑、福美司坦、法倔唑、来曲唑、埃罗替尼、拉法替尼、达沙替尼、吉非替尼、奥希替尼、凡德他尼、阿法替尼、伊马替尼、帕唑帕尼(pazopanib)、拉帕替尼、舒尼替尼、尼洛替尼、索拉非尼、nab-紫杉醇、依维莫司、替西罗莫司、达帕菲尼、维莫非尼、曲美替尼、叶酸-去乙酰长春碱单酰肼缀合物(vintafolide)、阿帕替尼、克里唑替尼、哌福辛(periforsine)、奥拉帕利、硼替佐米、托法替尼、卡利奇霉素、奥佐米星、单甲基澳瑞他汀e、美坦新(emtansine)、其衍生物或组合。
33.在另一方面，本技术提供了使用本文公开的抗pd-l1抗体和抗原结合片段治疗癌症的方法。在一个实施方案中，该方法包括向受试者施用有效量的本文公开的分离的mab或抗原结合片段的步骤。在一些实施方案中，癌症具有表达pd-l1的细胞。
34.在一个实施方案中，所述方法包括将有效量的单克隆抗体、其抗原结合片段和本文公开的免疫缀合物直接注射到肿瘤部位。
35.在一个实施方案中，该方法包括向受试者施用有效量的本文公开的分离的mab或抗原结合片段，和共同施用有效量的治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂可以是抗体、化疗剂、酶或其组合。治疗剂的实例包括但不限于卡培他滨、顺铂、曲妥珠单抗、氟维司群、他莫昔芬、来曲唑、依西美坦、阿那曲唑、氨鲁米特、睾内酯、伏罗唑、福美坦、法倔唑、来曲唑、埃罗替尼、拉法替尼、达沙替尼、吉非替尼、伊马替尼、帕唑帕尼(pazopanib)、拉帕替尼、舒尼替尼、尼洛替尼、索拉非尼、nab-紫杉醇、其衍生物或组合。
36.可以使用公开的抗pd-l1抗体或抗原结合片段治疗多种癌症。可以治疗的癌症的实例包括但不限于乳腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、头颈癌、黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、食管癌、鼻咽癌、肛门癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、宫颈癌或脑癌。
37.在一些实施方案中，接受治疗的受试者是人。在一个实施方案中，提供了包含有效浓度的特异性结合人pd-l1的分离的mab或抗原结合片段的溶液，其中该溶液是受试者的血浆。
附图说明
38.结合附图，根据以下描述和所附权利要求书，本发明的前述和其他特征将变得更加完全显而易见。
39.应当理解，这些附图仅示出了根据本发明布置的几个实施方案，因此，本公开不被认为是对其范围的限制，本公开将通过使用附图以另外的特性和细节来描述，其中：
40.图1显示了对来自b细胞培养板的上清液进行的pd-l1结合elisa的示例。阴影孔表示鉴定为抗pd-l1抗体阳性的孔。
41.图2是抗体上清液阻断pd-l1与pd-1之间结合的能力的生物层干涉测量分析的示例。黑色迹线使用阻断抗体上清液，而灰色迹线使用非阻断抗体上清液
42.图3显示了抗体ab1-ab5阻断pd-l1与pd-1之间结合能力的生物膜层干涉分析。显示从pd-l1结合开始，接着显示基线，接着显示pd-l1结合。阴性对照是抗pd-l1抗体，其可以结合pd-l1但不阻断pd-l1与pd-1之间的缔合。
43.图4是与pd-l1结合的两种抗pd-l1抗体的结合动力学数据的示例。数据显示对于各种浓度的pd-l1，先是缔合5分钟，随后解离15分钟。
44.图5显示了与肺癌细胞系a441结合的示例抗体。
具体实施方式
45.在以下详细描述中，参考了构成本文一部分的附图。在附图中，除非上下文另有说明，否则类似的符号通常标识类似的成分。在详细描述、附图和权利要求中描述的说明性实施方案并不意味着是限制性的。可利用其他实施方案，且可作出其他改变，而不背离本文所呈现的主题的精神或范围。将容易理解的是，如在此总体描述的并且在附图中示出的本公开的这些方面可以被安排、替代、组合、分开、并且被设计成多种不同的构型，所有这些在此明确地预期。
46.本公开尤其提供了分离的抗体、制备此类抗体、双特异性或多特异性分子、由此类抗体或抗原结合片段组成的抗体-药物缀合物和/或免疫缀合物、含有此类抗体、双特异性或多特异性分子、抗体-药物缀合物和/或免疫缀合物的药物组合物的方法、制备公开的抗体、抗原结合片段和组合物的方法，以及使用上述物质治疗癌症的方法。
47.在一方面，本公开提供了结合人pd-l1的的分离单克隆抗体及其抗原结合片段。抗体及其抗原结合片段表现出一种或多种期望的功能特性，例如与pd-l1的高亲和力结合、抑制pd-l1与pd-1结合的能力、增强t细胞活化包括增殖、ifn-γ和/或il-2分泌的能力、刺激抗体应答的能力和/或逆转免疫抑制细胞如t调节细胞的抑制功能的能力。在一个在实施方案中，抗体及其抗原结合片段可以来源于特定的重链和轻链氨基酸序列和/或结构特征，例如由特定氨基酸序列组成的互补决定区(cdr)。
48.术语“抗体”以最广泛的意义使用，具体包括单一单克隆抗体(包括激动剂和拮抗剂抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、以及抗体片段(例如fab、f(ab')2和fv)，只要它们表现出所需的生物活性。在一些实施方案中，抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、双特异性抗体或双效抗体，以及人源化抗体及其活性片段。与已知抗原结合的分子的活性片段的实例包括fab、f(ab')2、scfv和fv片段，以及fab免疫球蛋白表达文库的产物和任何上述抗体和片段的表位结合片段。在一些实施方案中，抗体可以包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有对抗原具有免疫结合特异性的结合位点的分子。免疫球蛋白可以是任何类型(igg、igm、igd、ige、iga和igy)或类别(igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或免疫球蛋白分子的亚类。在一个实施方案中，抗体可以是完整抗体和衍生自该完整抗体的任何抗原结合片段。典型的抗体是指典型地包含两条重(h)链和两条轻链(l)的异四聚体蛋白链。每条重链由重链可变区(缩写为vh)和重链恒定区
组成。每条轻链由轻链可变区(缩写为vl)和轻链恒定区组成。vh和vl区可进一步细分为超变互补决定区(cdr)的结构域，和称为构架区(fr)的更为保守的区域。每个可变区(vh或vl)通常由三个cdr和四个fr组成，按以下顺序排列：从氨基末端到羧基末端的fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。在轻链和重链的可变区内存在与抗原相互作用的结合区。
49.本文所用的术语单克隆抗体是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即包含该群体的单个抗体是相同的，除了可能以少量存在的天然存在的突变。单克隆抗体是针对单个抗原位点高度特异性的。
50.此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇(表位)。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们由杂交瘤培养物制备，不被其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不应被解释为需要通过任何特定方法生产抗体。例如，根据本公开内容使用的单克隆抗体可以通过首先由kohler&milstein,nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组dna方法制备(参见，例如，美国专利no.4,816,567)。
51.在一些实施方案中，单克隆抗体可包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及这些抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它们表现出所需的生物活性(美国专利no.4,816,567；和morrison等人，proc.natl.acad.sci.usa,81:6851-6855)。
52.单克隆抗体可以使用各种方法产生，包括小鼠杂交瘤或噬菌体展示(参见siegel.transfus.clin.biol.9:15-22(2002)综述)或直接来自原代b细胞的抗体的分子克隆(参见tiller.新型生物技术(new biotechnol).28:453-7(2011))。在本公开中，通过用人pd-l1蛋白和在细胞表面瞬时表达人pd-l1的细胞免疫兔产生抗体。已知兔子可产生高亲和力、多样性和特异性的抗体(weber等人，exp.mol.med.49:e305)。体外培养来自免疫动物的b细胞并筛选产生抗pd-l1抗体。使用重组dna技术分离抗体可变基因，重组表达所得抗体，并进一步筛选所需特征，例如抑制pd-l1与pd-1结合的能力，与非人灵长类pd-l1结合的能力和增强人t细胞活化的能力。这种抗体发现的一般方法类似于seeber等人描述的方法，plos one.9:e86184(2014)。
53.术语“抗原或表位结合部分或片段”是指能够结合抗原(在这种情况下是pd-l1)的抗体片段。这些片段可以具有完整抗体的抗原结合功能和其他功能。结合片段的实例包括但不限于单链fv片段(scfv)或fab片段，其中单链fv片段由通过合成接头连接的单多肽链中的抗体的单臂的vl和vh结构域组成，fab片段是由vl、恒定轻链(cl)、vh和恒定重链1(ch1)结构域组成的单价片段。抗体片段可以是甚至更小的亚片段并且可以由与单个cdr结构域一样小的结构域组成，特别是来自vl和/或vh结构域的cdr3区(例如参见beiboer等人，j.mol.biol.296:833-49(2000))。使用本领域技术人员已知的常规方法产生抗体片段。可以使用与完整抗体相同的技术筛选抗体片段的效用。
[0054]“抗原或表位结合片段”可以通过多种本领域已知的技术衍生自本公开的抗体。例如，可以用酶如胃蛋白酶裂解纯化的单克隆抗体，并进行hplc凝胶过滤。然后可收集含有fab片段的适当级分并通过膜过滤等进行浓缩。关于分离抗体活性片段的一般技术的进一
步描述，参见例如khaw,b.a.等人，j.nucl.med.23:1011-1019(1982)；rousseaux等人，酶学方法(methods enzymology)，121:663-69，学术出版社(academic press)，1986。
[0055]
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“fab”片段，每个片段具有单个抗原结合位点，和残余“fc”片段，其名称反映了其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原的f(ab')2片段。
[0056]
fab片段还可以含有轻链恒定区和重链第一恒定区(ch1)。fab'片段与fab片段的不同之处在于在重链ch1结构域的羧基末端添加了一些残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。fab'-sh在本文中是指其中恒定区的半胱氨酸残基带有游离巯基的fab'。f(ab')2抗体片段最初是成对的fab'片段，它们之间具有铰链半胱氨酸。另外，抗体片段的化学偶联也是已知的。
[0057]“fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密非共价结合的一个重链和一个轻链可变区的二聚体组成。在这种构型中，每个可变区的三个cdr相互作用以限定vh-vl二聚体表面上的抗原结合位点。总起来说,六个cdr赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包含对抗原特异的三个cdr的fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于整个结合位点。
[0058]
根据其恒定域的氨基酸序列，可以将来自任何脊椎动物的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”分为两种明显不同的类型之一，称为κ和λ。
[0059]
根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可分为不同的类别。免疫球蛋白有五大类别：iga、igd、ige、igg和igm，其中一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如igg-1、igg-2、igg-3和igg-4；iga-1和iga-2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。
[0060]“人源化抗体”是指一类工程化抗体，其cdr衍生自非人供体免疫球蛋白，分子的其余免疫球蛋白衍生部分衍生自一种(或多种)人免疫球蛋白。此外，可以改变框架支持残基以保持结合亲和力。获得“人源化抗体”的方法是本领域技术人员熟知的。(参见例如queen等人，proc.natl acad sci usa,86:10029-10032(1989),hodgson等人，bio/technology,9:421(1991))。在一个实施方案中，“人源化抗体”可以通过基因工程方法获得，该基因工程方法能够在大型动物例如兔子中产生亲和力成熟的类人多克隆抗体(参见，例如，美国专利no.7,129,084)。
[0061]
如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”是可互换的，并且定义为意指由通过肽键连接的氨基酸组成的生物分子。
[0062]
除非上下文不适当，本文使用的术语“一个(a、an)”和“该(the)”定义为意指一个或多个并且包括复数。
[0063]“分离的”是指不含至少一些其天然存在的组分的生物分子。当用于描述本文公开的各种多肽时，“分离的”是指已经从其表达的细胞或细胞培养物中鉴定和分离和/或回收的多肽。通常，通过至少一个纯化步骤制备分离的多肽。“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。
[0064]“重组”是指使用重组核酸技术在外源宿主细胞中产生抗体。
[0065]
术语“抗原”是指可以在生物体，特别是动物，更特别是包括人在内的哺乳动物中诱导免疫应答的实体或其片段。该术语包括免疫原及其负责抗原性或抗原决定簇的区域。
[0066]
同样如本文所用，术语“免疫原性”是指引发或增强针对免疫原性剂的抗体、t细胞或其他反应性免疫细胞的产生并有助于人或动物中的免疫应答的物质。当个体针对本公开的施用的免疫原性组合物产生足够的抗体、t细胞和其他反应性免疫细胞以缓和或减轻待治疗的病症时，发生免疫应答。
[0067]“特异性结合(specific binding、specifically binds to”或“特异性针对(specific for)”特定抗原或表位是指与非特异性相互作用显著不同的结合。特异性结合可以例如通过测定与对照分子的结合相比的分子的结合来测量，所述对照分子通常是具有不含结合活性的类似结构的分子。例如，特异性结合可以通过与类似于靶标的对照分子竞争来确定。
[0068]
对特定抗原或表位的特异性结合可以例如通过抗体对抗原或表位具有至少约10-4
m、至少约10-5
m、至少约10-6
m、至少约10-7
m、至少约10-8
m、至少约10-9
m、或者至少约10-10
m、至少约10-11
m、至少约10-12
m或更高kd来体现，其中kd是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。通常，与对照分子相比，特异性结合抗原的抗体对于抗原或表位会具有20、50、100、500、1000、5,000、10,000或更多倍的kd。
[0069]
此外，对于特定抗原或表位的特异性结合可以例如通过抗体对抗原或表位的ka或ka来体现，所述抗体对于抗原或表位的ka或ka相对于对照至少大20、50、100、500、1000、5,000、10,000或更多倍。其中ka或ka是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率。
[0070]
两个序列之间的“同源性”通过序列同一性确定。如果相互比较的两个序列长度不同，则序列同一性优选涉及与较长序列的核苷酸残基相同的较短序列的核苷酸残基的百分比。可以使用计算机程序常规地确定序列同一性。在给定序列与本公开的上述序列之间的比较中出现的偏差可以由例如添加、缺失、取代、插入或重组引起。
[0071]
在另一方面，本技术提供药物组合物。可以根据本领域普通技术人员已知的标准方法得到根据本公开的药物组合物的制剂。根据本公开的抗体可以使用已知技术以生理上可接受的制剂形式制备，并且其可以包含药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。例如，根据本公开的本文所述抗体可包括任何功能等效抗体或其功能部分，特别地，包括任何功能等效抗体或其功能部分的单克隆抗体与药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂组合以形成治疗组合物。合适的药物载体、稀释剂和/或赋形剂是本领域熟知的，包括例如磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳剂如油/水乳液、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。
[0072]
在另一方面，本技术提供了使用本文公开的mab、其抗原结合片段和组合物治疗受试者的方法。在一个实施方案中，该方法用于抑制肿瘤细胞的生长。在一些实施方案中，本技术提供了使用抗体刺激保护性自身免疫应答、修饰免疫应答或刺激抗原特异性免疫应答的方法。在一些实施方案中，该方法包括使用抗体刺激保护性自身免疫应答、修饰免疫应答或刺激抗原特异性免疫应答的步骤。在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用所公开的组合物以治疗癌症。
[0073]
本公开的组合物可以以固体、液体或气雾剂的形式以合适的药学有效剂量施用于受试者。固体组合物的实例包括丸剂、乳膏和可植入的剂量单位。丸剂可以口服施用。治疗乳膏可以局部施用。可植入的剂量单位可以局部施用，例如在肿瘤部位施用，或者可以植入用于治疗组合物的系统释放，例如皮下施用。液体组合物的实例包括适于肌内、皮下、静脉内、动脉内注射的制剂，以及用于局部和眼内施用的制剂。气溶胶制剂的实例包括用于向肺
部施用的吸入剂制剂。
[0074]
组合物可以通过标准施用途径施用。通常，组合物可以通过局部、口服、直肠、鼻、皮内、腹膜内或肠胃外(例如静脉内、皮下或肌内)途径施用。在一个实施方案中，施用可以是肠胃外施用，例如静脉内施用。用于肠胃外施用的制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水溶剂包括但不限于丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射有机酯如油酸乙酯。水性溶剂可选自以下组成的组：水、醇/水溶液、包括盐水和缓冲介质的乳液或悬浮液。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸化林格氏液或不挥发性油。静脉内载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏葡萄糖的那些)等。还可以存在防腐剂，例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。
[0075]
在一个实施方案中，可以将组合物掺入诸如生物可降解聚合物等缓释基质中，将聚合物植入需要递送的部位附近，例如肿瘤部位。该方法可包括施用单剂量、以预定时间间隔施用重复剂量以及持续施用预定的时间。
[0076]
本文所用的缓释基质是由通常可通过酶促或酸/碱水解或通过溶解降解的聚合物材料制成的基质。一旦插入体内，基质被酶和体液作用。理想的缓释基质选自生物相容性材料，例如脂质体、聚丙交酯(聚丙交酯酸)、聚乙交酯(乙醇酸的聚合物)、聚丙交酯-乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)、聚酸酐、聚(原酸)酯、多肽、透明质酸、胶原蛋白、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸(如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸)、多核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和硅酮。优选的生物可降解基质是聚丙交酯、聚乙交酯或聚丙交酯-乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)其中之一的基质。优选的生物可降解基质是聚丙交酯、聚乙交酯或聚丙交酯-乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)其中之一的基质。
[0077]
本领域普通技术人员众所周知，组合物的剂量将取决于各种因素，例如所治疗的病症、所使用的特定组合物以及其他临床因素，例如患者的体重、大小、性别和一般健康状况、体表面积、待施用的特定化合物或组合物、同时施用的其他药物和施用途径。
[0078]
术语“治疗有效量”是指当施用于人或动物时引起足以在所述人或动物中产生治疗效果的应答的抗体的量。有效量易于由本领域普通技术人员按照常规方法确定。
[0079]
根据预期用途，其他生物活性剂可以存在于本公开的药物组合物中。在一个实施方案中，组合物可以与包含生物活性物质或化合物的其他组合物组合施用。
[0080]
生物活性物质或化合物的实例包括但不限于抗氧化应激的化合物、抗凋亡化合物、金属螯合剂、dna修复抑制剂例如哌仑西平和代谢物3-氨基-1-丙烷磺酸(3aps)和1,3-丙烷二磺酸盐(1,3pds)、分泌酶活化剂、β和γ分泌酶抑制剂、tau蛋白、神经递质、β片破坏剂、抗炎分子、“非典型抗精神病药”例如氯氮平、齐拉西酮、利培酮、阿立哌唑或奥氮平、或胆碱酯酶抑制剂(chei)例如他克林、利凡斯的明、多奈哌齐和/或加兰他敏以及其他药物和营养补充剂如维生素b12、半胱氨酸、乙酰胆碱的前体、卵磷脂、胆碱、银杏、乙酰基-l-肉碱、艾地苯醌、丙烯基可可碱或黄嘌呤衍生物，以及根据本公开的抗体，并且任选地，药学上可接受的载体和/或稀释剂和/或赋形剂以及用于治疗疾病的说明书。
[0081]
药物组合物可进一步包含蛋白质载体，例如血清白蛋白或免疫球蛋白，特别是人源的。蛋白质药物活性物质可以每剂1ng至10mg的量存在。
[0082]
在一些实施方案中，施用方案可以在根据本公开的抗体的0.1μg至10mg的范围内，特别地在1.0μg至1.0mg的范围内，并且更特别地在1.0μg至100μg的范围内，落入这些范围
内的所有单个数值也是本公开的一部分。如果通过连续输注进行施用，则更合适的剂量可以在0.01μg至10mg单位/千克体重/小时的范围内，并且落入这些范围内的所有单个数值也是本公开的一部分。
[0083]
通过参考以下包括在此的具体实施方案的详细描述，可以更容易地理解本公开。尽管已经参考本发明的某些实施例的具体细节描述了本发明，但是并不意味着这些细节应当被认为是对本发明范围的限制。在本公开中引用或提及的所有参考文献均通过引用整体结合到本文中。
[0084]
实施例
[0085]
实施例1：抗pd-l1抗体的产生
[0086]
通过免疫新西兰白兔开发抗人pd-l1的单克隆抗体。最初的免疫用100μg以1：1v/v与完全弗氏佐剂混合的重组人pd-l1胞外域通过皮下注射进行。随后在第3、6、9和10周用50μg抗原在不完全弗氏佐剂中进行加强免疫。除了抗原之外，在第6、9和10周，也用1
×
106hek-293细胞对动物加强免疫，该细胞被瞬时转染以表达全长人pd-l1。
[0087]
在第9和12周，通过elisa测试来自动物的血清的抗pd-l1滴度。96孔板在4℃下用山羊抗兔igg抗体(jackson immunoresearch)被动吸附过夜。将包被的孔洗涤并用1％牛奶在室温下封闭1小时，然后与人pd-l1胞外结构域人fc结构域融合蛋白在室温下温育1小时。洗涤后，将未稀释的血清加入孔中，并以1:10的比例在平板上连续稀释，每次共7孔。在室温下温育1小时后，洗涤平板，然后与山羊抗人igg fc特异性辣根过氧化物酶缀合的抗体(jackson immunoresearch)温育。洗涤平板，然后与ultra tmb底物(fi sher scientific)在室温下温育30分钟。通过吸光度板读数器在450nm波长下检测孔中的信号以产生滴定曲线。
[0088]
将抗pd-l1滴度与使用免疫前从同一只动物获得的血清进行的elisa进行比较。
[0089]
选择具有显著抗pd-l1滴度的兔子用于收获和产生单克隆抗体。
[0090]
在初次免疫后第13周，从来自抗pd-l1阳性兔子的脾和淋巴结收集b细胞。将b细胞在96孔板中培养一周，使其分化为浆细胞并分泌抗体。通过如上所述的elisa筛选这些浆细胞培养物的上清液中是否存在pd-l1特异性抗体，如图1所示。
[0091]
使用磁性捕获方法从阳性孔中分离分泌抗pd-l1抗体的b细胞。简言之，链霉亲和素磁珠(thermofisher scientific)用生物素缀合的人pd-l1胞外结构域蛋白包被。包被的珠与来自抗pd-l1阳性孔的细胞温育。使用磁体洗涤珠细胞复合物以除去任何非特异性细胞，并将珠细胞复合物直接加入到含有rt-pcr主混合物的管中。
[0092]
使用简并引物通过多重rt-pcr扩增轻链和重链可变区序列，该简并引物设计为与兔igg和兔κ序列的前导序列和恒定区退火。使用含有限制性位点的嵌套引物分别对轻链和重链进行第二次pcr。将来自可变重链pcr的扩增子克隆到含有人igg1的表达载体中。将轻链扩增子克隆到含有人igk的表达载体中。测序并分析所得克隆。
[0093]
将从各孔产生的重链和轻链表达质粒瞬时共转染以产生兔/人嵌合抗体。通过离心澄清所得含有重组抗体的上清液。
[0094]
在fortebio octt red 96仪器上使用生物层干涉测量法分析证实重组抗体上清液含有抗pd-l1抗体。使用抗人fc生物传感器(pall fortebio)捕获上清液中的抗体。通过将生物传感器置于含有重组人pd-l1胞外域蛋白的孔中，通过实时干涉测量法观察与pd-l1
的缔合。在将生物传感器转移到含有10x动力学缓冲液(pallfortebio)的孔中之后测量解离。制造商提供的软件用于分析干涉测量数据。
[0095]
抗体阻断pd-1和pd-l1之间生化结合的能力通过在fortebio octle red 96仪器上的生物层干涉测量分析进行。链霉亲和素生物传感器(pall fortebio)用于固定生物素缀合的人pd-l1胞外结构域。然后将生物传感器置于含有重组抗体上清液的孔中。
[0096]
然后将生物传感器转移到含有人pd-1胞外结构域蛋白的孔中。pd-1缔合的阳性结合信号表明抗体无法阻断pd-l1与pd-1的缔合，而当将生物传感器转移到pd-1孔时，阻断抗体不产生阳性结合信号。当转移到含有pd-1的孔中时，含有能够结合pd-l1但不能阻断随后pd-1结合的已知抗体的对照抗体上清液产生阳性结合信号。使用制造商提供的软件实时监控数据。图2示出了示例性的总体数据。在该测定中测试抗pd-l1抗体ab1-ab5，结果示于图3。
[0097]
制备抗pd-l1抗体ab1-ab5的人源化形式，并按照其原始命名通过附加的“hu”表示。例如，ab1hu是抗体ab1的人源化形式。
[0098]
实施例2：抗pd-l1抗体的结合亲和力
[0099]
通过在fortebio octbe red 96仪器上的生物层干涉分析测定选择的抗pd-l1抗体ab1-ab5和ab1hu-ab5hu的结合动力学。首先，使用hek-293瞬时转染的抗体上清液通过蛋白a层析生产纯化的抗体。通过将纯化的抗体固定到抗人fc生物传感器上来进行该测定。然后在各种浓度的pd-l1下观察到pd-l1与生物传感器的结合和解离。具体地，将8个抗人fc生物传感器置于含有相同纯化抗体的孔中5分钟。将生物传感器在动力学缓冲液(pall fortebio)中平衡1分钟以建立基线。通过将生物传感器置于含有各种浓度的人pd-l1胞外域的孔中5分钟来观察pd-l1的缔合。在将生物传感器转移到动力学缓冲液中并监测干涉信号15分钟后测量解离。测定的所有步骤均在30℃下以1000rpm振荡进行。使用制造商提供的软件测定结合和解离速率(kon和koff)以及平衡结合常数kd，并使用包括几种测试浓度的1：1结合整体拟合模型进行拟合。动力学研究的结果示于表1中，代表性数据示于图4中。
[0100]
表1
[0101][0102][0103]
实施例3：与细胞表面表达的pd-l1结合的抗体
[0104]
人肺癌细胞系h441在室温下用fvs520活性染料(bd biosciences，1:2000稀释)标记15分钟。然后将标记的细胞在facs缓冲液(2％fbs的pbs溶液)中稀释，加入到v形底96孔板(每孔50,000个细胞)中，并与0-100nm抗hupdl1或阴性对照同种型匹配或阳性对照同种型匹配的对照抗体在冰上温育30分钟。洗涤细胞以除去过量的一抗，然后用alex fluor647缀合的山羊抗人fc二抗(jackson immunoresearch，1:1600稀释)标记。将细胞在冰上孵育20分钟，然后用facs缓冲液洗涤，然后在配备有cytek ams平板装载系统的facscalibur流式细胞仪上采集。图5显示了在门控活细胞后，af647通道上的中位荧光强度(median fluorescence intensity)(mfi)。误差条代表重复样品的sem。
[0105]
虽然已经参照本发明的实施方案具体示出和描述了本公开，但是本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在形式和细节上进行前述和其他改变。本公开中引用或提及的所有参考文献在此全文引入作为参考。

技术特征：
1.一种对人pd-l1具有结合特异性的分离的单克隆抗体(mab)或其抗原结合片段，其中所述分离的mab或抗原结合片段包含可变轻链氨基酸序列和可变重链氨基酸序列，其中所述可变轻链氨基酸序列包含如下互补决定区序列：qasqsisshln、kastlas和qqgyswgnvdnv，所述可变重链氨基酸序列包含如下互补决定区序列：gydmc、ciaagsagitydanwakg和safsfdyamdl。2.根据权利要求1所述的分离的mab或抗原结合片段，其包含seq id no:4所示的嵌合轻链可变轻链氨基酸序列和seq id no:8所示的嵌合重链可变重链氨基酸序列，或包含seq id no:12所示的人源化轻链可变轻链氨基酸序列和seq id no:16所示的人源化重链可变重链氨基酸序列，或包含与上述轻链可变轻链氨基酸序列之一具有同一性不小于98％的轻链可变轻链氨基酸序列和与上述重链可变重链氨基酸序列之一具有同一性不小于98％的重链可变重链氨基酸序列。3.根据权利要求2所述的分离的mab或抗原结合片段，其包含seq id no:3所示的嵌合轻链全长氨基酸和seq id no:7所示的嵌合重链全长氨基酸序列，或包含seq id no:11所示的人源化轻链全长氨基酸序列和seq id no:15所示的人源化重链全长氨基酸序列，或包含与上述轻链全长氨基酸序列之一具有同一性不小于98％的轻链全长氨基酸序列和与上述重链全长氨基酸序列之一具有同一性不小于98％的重链全长氨基酸序列。4.根据权利要求1所述的分离的mab或抗原结合片段，其对人pd-l1具有kd不大于70nm的结合亲和力。5.根据权利要求1所述的分离的mab或抗原结合片段，其中所述分离的mab包括人源化抗体、嵌合抗体或重组抗体。6.根据权利要求1所述的分离的mab或抗原结合片段，其中所述抗体包括igg。7.根据权利要求1所述的分离的mab或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含fv、fab、f(ab')2、scfv或scfv2片段。8.根据权利要求1所述的分离的mab或其抗原结合片段，其中所述抗体包括双特异性抗体、三特异性抗体或多特异性抗体。9.一种分离的核酸，其编码根据权利要求1-8任一项所述的分离的mab或抗原结合片段。10.一种包含权利要求9所述的分离的核酸的表达载体。11.一种包含权利要求9所述的核酸的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞。12.一种产生抗体的方法，其包括培养根据权利要求11所述的宿主细胞以产生抗体。13.一种药物组合物，其包含估计权利要求1-8任一项所述的分离的mab或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。14.根据权利要求13所述的药物组合物，其还包含化疗剂、生长抑制剂、卡利奇霉素类药物单元、抗有丝分裂剂、毒素、放射性同位素、抗雌激素剂、受体酪氨酸激酶抑制剂、激酶抑制剂、细胞周期抑制剂、dna、rna或蛋白质合成抑制剂、ras抑制剂、抗体、化疗剂、酶，或其组合。15.权利要求1-8任一项所述的分离的mab或其抗原结合片段在制备治疗患有癌症的受试者的药物中的用途，其中所述癌症包括表达pd-l1的细胞。
16.根据权利要求15所述的用途，其中所述药物进一步包括治疗剂，其中所述治疗剂包括抗体、化疗剂、酶或其组合。17.根据权利要求15所述的用途，其中所述受试者是人。

技术总结
本申请提供了抗PD-L1单克隆抗体、其抗原结合部分、其治疗组合物和/或编码其的核酸，以及它们在治疗癌症和其他T细胞功能障碍中上调T细胞功能以增强细胞介导的免疫应答的用途。T细胞功能以增强细胞介导的免疫应答的用途。T细胞功能以增强细胞介导的免疫应答的用途。


技术研发人员：布莱恩
受保护的技术使用者：成都百利多特生物药业有限责任公司
技术研发日：2018.06.22
技术公布日：2023/8/5