反式虾青素减轻结膜炎及抑制HMGB1/TLR4炎症通路的发现及其用途的制作方法

反式虾青素减轻结膜炎及抑制hmgb1/tlr4炎症通路的发现及其用途
技术领域
1.本发明公开了反式虾青素减轻实验性过敏性结膜炎及抑制hmgb1/tlr4炎症通路的发现及其用途，属于医药技术领域。


背景技术：

2.过敏性结膜炎(allergic conjunctivitis，ac)是一种常见的过敏性眼部疾病，多发于儿童与青少年人群中，临床表现为眼部瘙痒、肿胀、发红、流泪和畏光等症状，通常与鼻炎、哮喘和其他过敏性疾病的发作密切相关；近年来，由于空气污染和气候变暖，ac的发病率逐年增高，这严重影响了患者的生活质量；ac主要与免疫球蛋白e(immunoglobulin e，ige)介导的i型过敏反应和t淋巴细胞介导的iv型超敏反应有关，但具体介导的其病理生理过程尚未明确；
3.高迁移率族蛋白b1(hmgb1)是损伤相关分子模式，在外界信号刺激下可释放到细胞外参与多种免疫应答，从而促进炎症反应，因而被称为“警报素”；toll样受体4(tlr4)是重要的模式识别受体，能识别病原相关分子模式，触发细胞信号的级联反应，调节免疫反应；相关研究表明，hmgb1在多种眼表疾病的泪液中被发现，如结膜炎、眼睑炎和干眼病等，另外在炎症反应中hmgb1不仅作为tlr4的配体激活tlr4信号通路，同时还可能是tlr4信号通路的下游分子，二者相互调控，形成hmgb1和tlr4信号通路的正反馈环，导致炎症反应的不断放大和加强；hmgb1/tlr4信号通路在许多炎症中扮演重要的角色，外界感染可诱导tlr4的过度表达，激活myd88/nf-κb途径，活化的nf-κb能促进hmgb1的高表达和释放，分泌到胞外的hmgb1又作为tlr4的配体，能激活tlr4/myd88/nf-κb通路，形成正反馈回路循环，放大炎症应答，使过敏性结膜炎症不断恶化，抑制hmgb1或tlr4都能在一定程度上极大地缓解结膜炎症；许多药物以hmgb1/tlr4信号通路为靶点，在疾病治疗中发挥重要的作用；
4.虾青素(astaxanthin，asx)是一种天然叶黄素类胡萝卜素，人体不能自然合成，主要从雨生红球藻和海鲜中提取获得；虾青素分子含有长的共轭不饱和双键结构，这使得光、热和氧化物易于破坏其结构；然而，这种结构也使虾青素具有很强的抗氧化性能，尤其是虾青素的游离状态可以大量淬灭活性氧；一系列体外和体内细胞和动物实验表明，虾青素会增加局部抗氧化剂，灭活和清除氧自由基，并抑制与年龄相关的氧化应激标志物的上升，如p53、p21和p16；虾青素因其抗炎抗癌作用而受到广泛关注，其主要活性成分为反式虾青素，相关研究表明，反式虾青素的干预可抑制干眼病相关眼角上皮的促炎应激反应，可能与其减低hmgb1的表达并抑制了由高渗引起的tnf-α，il-6表达的增加有关；此外，广泛的研究表明，反式虾青素可下调机体和细胞内炎症因素的表达，如il-1β、il-6和tnf-α，减少氧化应激损伤并抑制炎症反应，其抗氧化和抗炎作用与剂量相关。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种反式虾青素减轻实验性过敏性结膜炎及抑制hmgb1/
tlr4炎症通路的发现及其用途；
6.本发明提供了一种反式虾青素微囊粉(微囊粉中反式虾青素含量2％，淀粉和植物油惰性辅料含量98％)，其能够在实验性过敏性结膜炎中减轻结膜炎症反应，并能够抑制hmgb1/tlr4炎症信号通路；
7.本发明提供了一种反式虾青素微囊粉(微囊粉中反式虾青素含量2％，淀粉和植物油惰性辅料含量98％)，其能够降低hmgb1、tlr4、myd88、nf-κb mrna及蛋白的表达；
8.本发明提供了一种反式虾青素微囊粉(微囊粉中反式虾青素含量2％，淀粉和植物油惰性辅料含量98％)，其能够降低实验性过敏性结膜炎大鼠血清内促炎因子il-1β、tnf-α的表达；
9.本发明提供了一种反式虾青素微囊粉(微囊粉中反式虾青素含量2％，淀粉和植物油惰性辅料含量98％)，其能够提高实验性过敏性结膜炎大鼠血清内抑炎因子il-4、il-10的表达；
10.本发明的发明人通过实验发现：反式虾青素微囊粉(微囊粉中反式虾青素含量2％，淀粉和植物油惰性辅料含量98％)能够减轻实验性过敏性结膜炎，并且抑制hmgb1/tlr4炎症通路，表现为降低hmgb1、tlr4、myd88、nf-κb mrna及蛋白的表达，从而降低通路下游促炎因子il-1β和tnf-α的表达，并提高抑炎因子il-4和il-10的表达；故证实反式虾青素可能通过抑制hmgb1/tlr4炎症通路从而减轻实验性过敏性结膜炎大鼠的结膜炎症反应，表现为眼结膜红肿充血缓解，流泪、分泌物均减少，为反式虾青素用于临床上补充缓解结膜炎提供新思路，具有广阔的应用前景；
11.以上实验均设置空白微囊粉作为对照，实验发现，在动物实验中，空白微囊粉(成分组成：藻油、淀粉、阿拉伯胶、麦芽糊精、植物油)对实验性过敏性结膜炎大鼠的结膜炎症反应和炎症通路均无影响，因此排除其干扰。
附图说明
12.图1为ac-组、ac+组、ac+mcs组和ac+asx-mcs组大鼠眼结膜炎症评分比较结果图；
13.图2为real-time pcr法中hmgb1、tlr4、myd88和β-actin引物特异性鉴定结果图；
14.图3为real-time pcr法检测ac-组、ac+组、ac+mcs组和ac+asx-mcs组大鼠眼结膜组织内hmgb1、tlr4、myd88mrna表达情况结果图；
15.图4为western blot法检测ac-组、ac+组、ac+mcs组和ac+asx-mcs组大鼠眼结膜组织内hmgb1、tlr4、myd88、nf-κb蛋白表达情况结果图；
16.图5为elisa法检测ac-组、ac+组、ac+mcs组和ac+asx-mcs组大鼠血清内促炎因子il-1β、tnf-α水平变化结果图；
17.图6为elisa法检测ac-组、ac+组、ac+mcs组和ac+asx-mcs组大鼠血清内抑炎因子il-4、il-10水平变化结果图。
具体实施方式
18.下面结合附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围；
19.1.实验动物及分组
20.40只sd大鼠(雄性大鼠，质量为200～250g，购自福建省福州市吴氏试验动物研究中心，试验动物使用许可证号为scxk(闽)2016-0002)用于这项研究；将40只sd大鼠随机分为以下4组：对照组(ac-组)、模型组(ac+组)、空白微囊粉组(ac+mcs组)和反式虾青素微囊粉组(ac+asx-mcs组)，每组10只；
21.2.实验性过敏性结膜炎大鼠模型建立
22.40只sd大鼠适应性饲养1周后，采用卵清蛋白致敏法(ova致敏法)与眼部多次激发的方法建立sd大鼠ac模型：第1天对大鼠进行皮下注射含100ug ova和5mg佐剂al(oh)3的pbs溶液200ul初步致敏；第7天对大鼠进行腹腔注射含100ug ova的pbs溶液200ul；第8～13天，对大鼠进行点眼含80ug/ul ova的生理盐水溶液以加强致敏；第14天和第16天，分别用含150ug/ul、0.15mg/ul ova的pbs溶液点眼以进行致敏原攻击；第17天，以腹腔注射含100ug ova的pbs溶液200ul；第18天和第20天，用含0.15mg/ul ova的pbs溶液点眼进行致敏原攻击；第17-26天，各组连续给药10d；第27天，再用含0.15mg/ul ova的pbs溶液点眼，再次进行致敏原攻击，20min后观察大鼠眼部体征并记录；
23.除对照组外，其余3组建立ac模型，在给药期间，对照组和模型组给予生理盐水，ac+mcs组和ac+asx-mcs组按0.1mg
·
kg-1
·
d-1
的剂量分别给予空白mcs组和asx-mcs灌胃，连续10d；
24.3.模型大鼠眼部体征观察及评估
25.大鼠ova末次致敏后，双盲法通过台式裂隙灯显微镜观察其眼部体征，包括：结膜水肿、充血，眼睑充血、水肿，分泌物产生，根据magone等的评分标准进行评分，3种指标评分分别记为0～4分，相加得出评分，最低为0分，最高为12分，以此判断大鼠眼部症状严重程度；
26.4.real-time pcr检测hmgb1/tlr4炎症通路关键因子hmgb1、tlr4、myd88 mrna表达情况
27.取大鼠眼结膜组织加入lysis buffer试剂，于匀浆器中充分研磨，按照试剂盒说明书提取眼结膜组织总rna，用微量分光光度计测定od260/280，得到rna浓度和纯度，将总rna通过逆转录操作合成cdna，再以cdna为模板，采用real-time pcr法检测目的基因mrna表达水平，以β-actin为内参基因，扩增体系：cdna 1ul、上游/下游引物各0.5ul、sybr qpcr master mix ii 10ul、加无酶水补足至20ul；扩增条件为第一阶段：95℃ 30s 1个循环；第二阶段：95℃ 5s 40个循环；第三阶段：60℃ 30s 1个循环；引物具体序列如下：hmgb1上游引物：5
’‑
ggagatcctaagaagccgaga-3’；下游引物5
’‑
catggtcttccacctctctga-3’；tlr4上游引物：5
’‑
aggactgggtaaggaatgagc-3’；下游引物5
’‑
atcacctttcggcttttatgg-3’；myd88上游引物：5
’‑
aagaaagagttccccagcatc-3’；下游引物5
’‑
gcgagtccagaaccaagattt-3’；β-actin上游引物：5
’‑
tgacgtggacatccgcaaag-3’；下游引物5
’‑
ctggaaggtggacagcgagg-3’；以提取的眼结膜基因组dna为模板，以大鼠β-actin为内参，采用real-time pcr(2-δδct
法)检测大鼠结膜组织内关键因子hmgb1、tlr4、myd88 mrna相对表达量；
28.5.western blot检测hmgb1/tlr4炎症通路hmgb1、tlr4、myd88、nf-kb蛋白表达情况
29.从-80℃冰箱中取出眼结膜组织，迅速称重，并将其剪碎放入含蛋白裂解液(含psfm和磷酸化酶抑制剂)的预冷匀浆管中，充分匀浆后静置30min，12000r/m、4℃离心
20min，所得上清即眼结膜组织总蛋白，将其分装于灭菌eppendorf离心管中，冻存于-80℃冰箱，避免反复冻融(以上所有操作均于冰上以降低蛋白的降解)；采用bca法进行蛋白定量；制备10％sds-page凝胶，取等量蛋白加入蛋白泳道，恒定电压80v，时间30min，待样品压缩成一条直线后，调成恒定电压100v，时间1h30min，观察电泳条带，待溴酚蓝跑到底部时停止电泳；恒定电流为200ma，时间2h，将蛋白转印至pvdf膜；用5％脱脂奶粉在室温下封闭1h；进行一抗孵育，4℃隔夜孵育。次日，弃去原液，洗膜后加入对应稀释后的二抗，37℃孵育1h，再次洗膜后，ecl发光液显影，凝胶成像系统拍照，image j软件分析蛋白条带灰度值，以β-actin作为内参蛋白，以目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值的比值作为目的蛋白相对表达水平；
30.6.elisa检测血清细胞因子
31.各组大鼠采取眼眶取血，全血样本4℃过夜后，1000
×
g离心20min，收集上清，使用特异性elisa试剂盒检测各组大鼠血清中细胞因子il-1β、tnf-α和il-4、il-10含量，实验步骤严格按照试剂盒说明书进行；
32.7.统计学方法
33.采用graphpad prism 9.4.1统计软件进行分析，利用image j软件进行western blot条带灰度分析，实验数据均以(x
±
s表示，运用单因素方差分析进行多样本间的均数比较，以p＜0.05为差异具有统计学意义)；
34.实施例一
35.实验目的：通过观察大鼠眼结膜炎症程度来说明反式虾青素可减轻实验性过敏性结膜炎大鼠眼结膜组织的炎症反应；
36.实验设计：双盲法通过台式裂隙灯显微镜观察其眼部体征，包括：结膜水肿、充血，眼睑充血、水肿，分泌物产生，根据magone等的评分标准进行评分，3种指标评分分别记为0～4分，相加得出评分，最低为0分，最高为12分，以此判断大鼠眼部症状严重程度。结果如图1所示；
37.结果分析：ac+asx-mcs组的大鼠较ac+组、ac+mcs组眼结膜组织炎症程度明显降低。表现为结膜红肿充血缓解，流泪、分泌物均减少；
38.结果说明：反式虾青素可减轻实验性过敏性结膜炎大鼠眼结膜组织的炎症程度；
39.实施例二
40.实验目的：通过real-time pcr技术检测大鼠眼结膜组织中hmgb1、tlr4、myd88 mrna的表达，检测反式虾青素对实验性过敏性结膜炎大鼠眼结膜组织hmgb1/tlr4炎症通路表达的影响；
41.实验设计：提取各组大鼠眼结膜组织rna，反转录成cdna，通过real-time pcr技术检测眼结膜组织中hmgb1、tlr4、myd88 mrna的表达，设计引物序列，并验证引物特异性；根据扩增曲线结果ct值，计算2-δδct
，利用graphpad prism 9.4.1统计软件进行分析做图；结果如图2、3所示；
42.结果分析：ac+asx-mcs组的大鼠较ac+组、ac+mcs组眼结膜组织中hmgb1、tlr4、myd88 mrna的表达都降低；
43.结果说明：反式虾青素减轻实验性过敏性结膜炎大鼠眼结膜的炎症反应，可能与抑制hmgb1/tlr4/myd88信号通路的表达相关；
44.实施例三
45.实验目的：通过western blot技术检测大鼠眼结膜组织中hmgb1、tlr4、mydg8、nf-kb蛋白的表达。检测反式虾青素对实验性过敏性结膜炎大鼠眼结膜组织hmgb1/tlr4炎症通路表达的影响；
46.实验设计：提取各组大鼠眼结膜组织蛋白，通过western blot技术检测眼结膜组织中hmgb1、tlr4、myd88、nf-kb蛋白的表达，根据印迹条带图利用image j分析条带灰度值，利用graphpad prism 9.4.1统计软件进行分析做图；结果如图4所示；
47.结果分析：ac+asx-mc组大鼠较ac+组和ac+mcs组眼结膜组织中hmgb1、tlr4、myd88、nf-kb蛋白的表达都降低。
48.结果说明：反式虾青素减轻实验性过敏性结膜炎大鼠眼结膜的炎症反应，可能与抑制hmgb1/tlr4/myd88信号通路的表达相关；
49.实施例四
50.实验目的：通过elisa技术检测大鼠血清中促炎因子il-1β、tnf-α含量；
51.实验设计：血清处理后，通过elisa技术检测大鼠血清中促炎因子il-1β、tnf-α含量；结果如图5所示；
52.结果分析：ac+asx-mcs组的大鼠较ac+组、ac+mcs组血清中促炎因子il-1β、tnf-α的表达降低；
53.结果说明：反式虾青素可以抑制hmgb1/tlr4炎症信号通路，从而有效缓解实验性过敏性结膜炎；
54.实施例五
55.实验目的：通过elisa技术检测大鼠血清中抑炎因子il-4、il-10含量；
56.实验设计：血清处理后，通过elisa技术检测大鼠血清中抑炎因子il-4、il-10含量；结果如图6所示；
57.结果分析：ac+asx-mcs组的大鼠较ac+组、ac+mcs组血清中抑炎因子il-4、il-10的表达增高；
58.结果说明：反式虾青素可以抑制hmgb1/tlr4炎症信号通路，从而有效缓解实验性过敏性结膜炎；
59.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种反式虾青素减轻结膜炎及抑制hmgb1/tlr4炎症通路的发现及其用途，其特征在于：该反式虾青素为含有2％反式虾青素、98％的淀粉和植物油惰性辅料的微囊粉，其能够减轻实验性过敏性结膜炎症反映，并抑制hmgb1/tlr4炎症通路。2.如权利要求1所述的一种反式虾青素减轻结膜炎及抑制hmgb1/tlr4炎症通路的发现及其用途，其特征在于：该反式虾青素能够降低实验性过敏性结膜炎中hmgb1、tlr4、myd88、nf-κb mrna及蛋白的表达。3.如权利要求1所述的一种反式虾青素减轻结膜炎及抑制hmgb1/tlr4炎症通路的发现及其用途，其特征在于：该反式虾青素能够降低实验性过敏性结膜炎大鼠血清内促炎因子il-1β、tnf-α的表达。4.如权利要求1所述的一种反式虾青素减轻结膜炎及抑制hmgb1/tlr4炎症通路的发现及其用途，其特征在于：该反式虾青素能够提高实验性过敏性结膜炎大鼠血清内抑炎因子il-4、il-10的表达。

技术总结
本发明公开了一种反式虾青素减轻结膜炎及抑制HMGB1/TLR4炎症通路的发现及其用途；提供了一种反式虾青素微囊粉，可减轻实验性过敏性结膜炎大鼠模型的眼结膜炎症反应，使眼结膜红肿充血缓解，流泪、分泌物减少；通过对眼结膜组织HMGB1/TLR4炎症通路中关键因子及相关蛋白表达情况的检测，发现其在实验性过敏性结膜炎大鼠模型中能够抑制HMGB1/TLR4炎症信号通路，降低HMGB1、TLR4、MyD88、NF-κB mRNA及蛋白的表达，降低通路下游促炎因子IL-1β和TNF-α的表达，并提高抑炎因子IL-4和IL-10的表达。10的表达。10的表达。


技术研发人员：王立强 洪宏 文亚飞
受保护的技术使用者：王立强
技术研发日：2023.06.05
技术公布日：2023/8/5