一种TPPP3抑制剂及其应用的制作方法

一种tppp3抑制剂及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药制备技术领域，特别是涉及一种tppp3抑制剂及其应用。


背景技术：

2.超敏反应性疾病是由先天性和适应性免疫反应以及上皮细胞联合介导的一系列疾病，免疫系统在维持健康和保护人体免受微生物入侵方面起着至关重要的作用。然而，同一个系统会导致过度的免疫和炎症反应，从而产生称为超敏反应的不良后果。超敏是对过敏原的过度反应的免疫反应，分为四大类型：i型、ii型、iii型和iv型。i、ii和iii型反应是抗体作用的结果，而iv型反应涉及t细胞淋巴细胞和细胞介导的免疫反应。简而言之，超敏反应是一个总称，而“过敏(anaphylaxis)”这一术语主要定义在由免疫球蛋白e(immunoglobuline,ige)介导的i型超敏反应这一范围内。
3.i型超敏性疾病发病率逐年增加，给社会经济带来很大负担。包括污染、气候变化、生物多样性减少、城市化、生活方式和饮食习惯的改变在内的一些因素被认为是导致其病例大幅增加的原因。然而，目前对于该疾病的治疗仍停留在症状控制层面上，尚没有确切的治愈方法，想要根治十分困难。i型超敏反应是由于接触抗原而发生的。对抗原的反应发生在两个阶段：致敏阶段和效应阶段。在致敏阶段，抗原呈递细胞(apc)向t细胞传递过敏原(或抗原)。t细胞发出信号，刺激b细胞产生ige——一种与肥大细胞和嗜碱细胞上的fc受体结合的抗体。随后，游离抗原结合的ige抗体在肥大细胞上发生交联，最终导致肥大细胞脱颗粒和组胺(ha)、蛋白水解酶和其他介质(即前列腺素、细胞因子、白三烯、血小板活化因子、巨噬细胞炎症蛋白、类胰蛋白酶等)的释放。结果会导致血管通透性增加，外周血管扩张，平滑肌收缩，个体可能会出现瘙痒和局部哮喘反应或全身性超敏反应。在整个这一过程中，肥大细胞显示出了关键性的作用。
4.肥大细胞是i型超敏反应的主要应答细胞，由ige/fcεri信号触发引起的肥大细胞脱颗粒释放过敏介质是该疾病发生的关键环节，该过程需要细胞骨架重组和膜融合机制之间的精细信号协调，实现脂质双层混合，从而导致炎症介质的释放。近年来，尽管人们对肥大细胞fcεri下游的近端信号已有较多研究，但其对颗粒分泌的调节和微管转运机制仍不清楚。
5.微管蛋白聚合促进蛋白3(tppp3)是tppp家族的一员，可诱导微管蛋白聚合和微管成束，属于微管相关蛋白(microtubule associatedprotein,maps)。vincze等人首次报道称，tppp3是tppp家族的一员，可以附着在微管上并导致微管产生捆绑活性。目前已知其家族包含3个成员，首先被发现的tppp/p25和另外两个与其有60％同源性的tppp2/p18和tppp3/p20。目前关于tppp1的研究较多，集中在与神经系统有关疾病，如神经退行性疾病和多系统萎缩等；目前涉及对tppp3和tppp2的研究相对较少。
6.tppp3具有促进微管蛋白聚合和组装的能力，参与胞内物质运输外，还可参与肿瘤、运动神经元病变、肌肉骨骼发育、胚胎发育等多种生理功能，在不同遗传背景以及不同生理条件下，tppp3表现出不同的生物学功能。迄今为止，未发现tppp3调控i型超敏反应的
相关研究。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种tppp3抑制剂及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明在动物模型体内给药抑制tppp3表达水平的indibulin，以此分析tppp3在i型超敏反应中的调控作用及可能的作用机制，为揭示i型超敏反应发病机制及深入研究tppp3在i型超敏反应中作用提供实验基础与科学依据。
8.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
9.本发明提供一种微管蛋白聚合促进蛋白3的抑制剂在制备治疗i型超敏反应药物中的应用。
10.进一步地，所述抑制剂包括吲地布啉。
11.进一步地，所述吲地布啉通过改善肥大细胞脱颗粒的形态变化，减少细胞凋亡及降低细胞的组胺和β-氨基己糖苷酶释放量，发挥治疗i型超敏反应的作用。
12.进一步地，所述i型超敏反应包括ige介导的i型超敏反应。
13.本发明还提供一种防治i型超敏反应的药物，包含吲地布啉，以及药学上可接受的载体。
14.进一步地，所述载体包括赋形剂、乳化剂和表面活性剂中的一种或多种。
15.进一步地，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂或喷雾剂。
16.进一步地，所述药物服用方法为口服或非经肠胃形式服用。
17.本发明公开了以下技术效果：
18.本发明研究微管聚合抑制剂吲地布啉(indibulin)对超敏反应的影响，利用cck-8试剂测定indibulin对细胞作用的安全剂量，选择1nm和10nm为indibulin对脱颗粒的抑制浓度。结果表明，10nm indibulin能够显著改善脱颗粒时细胞形态的变化、抑制细胞凋亡、降低β-hex和ha的释放量。小鼠pca模型结果显示，indibulin能够显著抑制ige诱导的耳部、足趾部和背部皮肤伊文斯蓝渗出和组织肿胀等被动皮肤过敏反应。耳部组织切片经苏木精-伊红和甲苯胺蓝染色，发现indibulin能够显著抑制组织血管扩张、炎性细胞浸润以及肥大细胞的增加。
19.本发明应用前期转录组测序技术筛选到参与肥大细胞脱颗粒的新蛋白分子tppp3，并在动物模型体内给药抑制tppp3表达水平的indibulin，以此分析tppp3在i型超敏反应中的调控作用及可能的作用机制，为揭示i型超敏反应发病机制及深入研究tppp3在i型超敏反应中作用提供实验基础与科学依据。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
21.图1为indibulin对rbl-2h3细胞增殖活性的影响；(a)：不同浓度indibulin下的rbl-2h3细胞增殖活性；(b)：indibulin对rbl-2h3细胞的半数抑制浓度；
22.图2为中性红染色下indibulin对rbl-2h3细胞脱颗粒形态的影响(bar＝100μm)；
23.图3为indibulin对ige诱导rbl-2h3细胞释放β-hex的影响(n＝3)；
24.图4为indibulin对ige诱导rbl-2h3细胞释放ha的影响(n＝3)；
25.图5为indibulin对ige诱导rbl-2h3细胞凋亡的影响(n＝3)；(bar＝100μm)；
26.图6为indibulin对ige诱导rbl-2h3细胞凋亡率统计(n＝3)；
27.图7为indibulin对ige介导的小鼠耳部pca反应的治疗作用(n＝8)；(a)耳部pca代表性图像；(b)耳部肿胀度；(c)耳部evans blue渗出含量；
28.图8为indibulin对ige介导的小鼠背部皮肤pca反应的治疗作用(n＝8)；(a)背部皮肤pca代表性图像；(b)背部皮肤肿胀度；(c)背部皮肤evans blue渗出含量；
29.图9为indibulin对ige介导的小鼠足趾部pca反应的治疗作用(n＝8)；(a)足趾部pca代表性图像；(b)足趾部肿胀度；(c)足趾部evans blue渗出含量；
30.图10为小鼠耳部切片甲苯胺蓝染色结果(bar＝100μm)；
31.图11为小鼠耳部he染色结果(bar＝100μm)。
具体实施方式
32.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
33.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
34.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
35.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
36.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
37.本发明前期通过转录组测序筛选i型超敏反应相关基因。对ige/fcεri通路激活后的rbl-2h3细胞进行转录组测序，获得的差异基因。通过go分析、kegg富集分析和ppi互作网络构建，发现细胞骨架相关基因在差异基因中得到了显著富集。通过差异倍数筛选并结合文献资料，最终选择显著上调的tppp3基因作为研究目标，分析tppp3基因表达与i型超敏反应的关联，具体研究如下：
38.实施例1抑制tppp3的微管抑制剂indibulin对i型超敏反应的影响
39.1材料与方法
40.1.1实验试剂及仪器
41.实验动物：spf级6-7周龄雌性昆明小鼠购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，许可证号scxk(京)2019-0010。
42.主要实验试剂：cck-8试剂盒，购自生工生物工程有限公司；indibulin，购自上海陶术生物科技有限公司；甲酰胺，购自生工生物工程有限公司；地塞米松，购自美仑生物技术有限公司；伊文斯蓝，购自生工生物工程有限公司。
43.1.2实验方法
44.1.2.1indibulin对rbl-2h3细胞增殖活性的影响
45.rbl-2h3细胞按1
×
104个/孔接种于96孔板。设置空白组：不接种细胞仅dmem；对照组：接种细胞、不给药；indibulin药物组(实验组)：接种细胞，给药(用dmem稀释indibulin终浓度分别为0.1、0.5、1、5、10、25、50nm)。每个样品设置5个复孔。24h后弃旧培养基，pbs洗3次，每孔加100μl含不同浓度indibulin的dmem。第二天，在每孔加入cck-8试剂10μl，培养箱孵育1h，用酶标仪在450nm处测定每孔的吸光度值。半数最大抑制浓度(ic
50
)值由graphpadprism软件计算。
[0046][0047]
1.2.2indibulin对rbl-2h3细胞脱颗粒时形态的影响
[0048]
将rbl-2h3细胞(8
×
104个/孔)铺于24孔板。分组为正常组(control)、模型组(model)和药物处理组(indibulin1nm、indibulin10nm、dexamethasone(地塞米松)10μm)。培养24h后，弃旧培养基，pbs洗涤3次，除control组外，各组均用含0.4μg/mldnp-ige的dmem致敏过夜，control组添加等量dmem。12h后弃液，用pbs洗涤细胞2次，药物组分别加入高、低浓度的indibulin以及10μm地塞米松(dexa，阳性药物)，预孵育60min。弃液，pbs洗涤3次，之后除control组外，各组加入含0.4μg/mldnp-bsa的pipes缓冲液，37℃激发60min，冰浴10min终止反应。每孔加中性红染液，室温孵育10min，随后用蒸馏水冲洗2遍每次2min，置显微镜下观察拍照。
[0049]
1.2.3indibulin对ige诱导rbl-2h3细胞释放β-hex的影响
[0050]
细胞分组及处理同1.2.2所述。激发完成后，冰浴10min终止反应后，收集各组上清，12000rpm，4℃离心5min。选取control组细胞用0.5％tritonx-100冰上裂解10min，作为总酶孔。每组取50μl上清液与50μl 1mm显色液在37℃下孵育1h，然后每孔加入200μl 0.1mol/l终止液终止反应，酶标仪下测量405nm处的吸光度。
[0051][0052]
1.2.4indibulin对ige诱导rbl-2h3细胞释放ha的影响
[0053]
细胞分组及处理同1.2.2所述，激发完成后，冰浴10min终止反应后，收集各组上清，12000rpm，4℃离心5min，按组胺elisa检测试剂盒说明操作。
[0054]
1.2.5indibulin对ige诱导rbl-2h3细胞凋亡的影响
[0055]
细胞分组及处理同1.2.2所述，激发完成后，冰浴10min终止反应后。按照ao/eb染
色试剂盒说明书操作，在荧光显微镜下观察，随机拍摄5个视野细胞图像，使用image j软件定量分析不同颜色细胞数量，应用如下公式分析并计算细胞凋亡率。
[0056][0057]
1.2.6indibulin对小鼠被动皮肤过敏反应的影响
[0058]
1.2.6.1实验动物分组
[0059]
昆明小鼠40只，随机分成5组：indibulin低中高浓度组：2mg/kg、5mg/kg和10mg/kg；地塞米松(dexa，阳性药物)组10mg/kg、正常组(control)、模型组(model)，每组8只。
[0060]
1.2.6.2实验动物致敏
[0061]
用戊巴比妥钠麻醉小鼠，除control组外，其余组别在小鼠右耳皮内、背部皮内、右足趾部皮内分别注射0.5μg dnp-ige，control组小鼠在相应部位注射等体积生理盐水。
[0062]
1.2.6.3实验动物给药
[0063]
24h后，根据小鼠的体重，给dexa组和indibulin组的小鼠腹腔注射200μl相应的药物剂量，而其余各组则腹腔注射等体积的生理盐水。
[0064]
1.2.6.4实验动物的激发
[0065]
给药30min后，除control组外，小鼠尾静脉注射由0.5mg的dnp-bsa和1％的伊文思蓝(evansblue)配制成的激发剂200μl，激发30min后颈椎脱臼致死。
[0066]
拍照记录小鼠耳部和足趾部的渗出情况和肿胀度，将每只小鼠耳朵在相同位置剪下，使其大小一样，用游标卡尺测量记录肿胀度，后放入700μl甲酰胺中，63℃水浴浸泡过夜，以提取evansblue染料，每个样品中取等量耳部提取液，加入96孔板并在620nm处测量吸光度值。
[0067]
取小鼠背部皮肤，拍照记录皮肤内的evansblue渗出情况，并测量蓝斑直径。在同一位置取相同大小的蓝斑皮肤，后放入700μl甲酰胺中，63℃水浴浸泡过夜，以提取evansblue染料，每个样品取等量背部皮肤提取液，加入96孔板并在620nm处测量吸光度值。
[0068]
在小鼠踝关节同一位置剪下足趾，拍照记录后用天平称重，烘干足趾，并在同一位置取相同重量的足趾，后放入700μl甲酰胺中，63℃水浴浸泡过夜，以提取evansblue染料，每个样品取等量足部皮肤提取液，加入96孔板并在620nm处测量吸光度值。
[0069][0070][0071]
1.2.7小鼠耳部组织学分析
[0072]
将小鼠耳朵剪下，使用切片机切5μm厚石蜡切片，65℃烤片4.5h。依次将切片放入二甲苯中脱蜡，放入无水乙醇、95％酒精、90％酒精、80％酒精、70％酒精、蒸馏水中水化。切片用苏木素染细胞核3-8min，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，流水冲洗，0.6％氨水返蓝，自来水冲洗。伊红染细胞质1-3min，再次酒精脱水封片，中性树胶封片。光学显微镜拍照。
[0073]
将组织切片使用0.5％甲苯胺蓝试剂对进行染色，染色30min，流水冲洗5min，光学显微镜拍照。
[0074]
1.2.8统计学分析
[0075]
实验数据结果用平均值
±
sd表示。使用graphpadprism7.00单因素方差分析(one-wayanova)进行两两比较。统计显着性设置为**p《0.05，***p《0.01。
[0076]
1.3实验结果
[0077]
1.3.1indibulin对rbl-2h3细胞增殖活性的影响
[0078]
如图1所示，indibulin作用rbl-2h3细胞24h，在0～10nm浓度时，各实验组细胞活力均可达到90％以上；当浓度为50nm以上时，明显抑制细胞增殖，且抑制作用随浓度的增加而增强，indibulin对rbl-2h3细胞的半数抑制浓度(ic
50
)为42.07nm。根据检测结果，后续实验选择indibulin浓度为1、10nm作为高、低浓度组。
[0079]
1.3.2indibulin对rbl-2h3细胞脱颗粒时形态的影响
[0080]
中性红染色后在显微镜下可以看出(图2)，正常组细胞的形态大致呈梭形或纺锤形，形态完整，生长状态良好，细胞着色较深。模型组与indibulin1nm组多数细胞开始肿胀变圆，着色变浅，个别细胞膜破裂，出现空泡。而在10nm indibulin组和地塞米松组中，细胞肿胀程度减轻，细胞状态接近于正常组细胞。
[0081]
1.3.3indibulin对ige诱导rbl-2h3细胞释放β-hex的影响
[0082]
indibulin影响细胞释放β-hex的结果如图3所示，正常组细胞β-hex释放率为9.29％，indibulin作用后1nm组和10nm组的释放率分别为36.91％和25.26％，其中10nm组与模型组40.18％的释放率有显著性差异。但与地塞米松组的释放率13.22％有一定差异。
[0083]
1.3.4indibulin对ige诱导rbl-2h3细胞释放ha的影响
[0084]
indibulin影响细胞释放ha的结果如图4所示，同样正常组细胞ha释放量为13.81ng/ml，indibulin作用后1nm组和10nm组的释放率分别为19.81ng/ml和16.45ng/ml，其中10nm组与模型组40.18ng/ml的释放率有显著性差异且较为接近地塞米松组的释放率15.80ng/ml。
[0085]
1.3.5indibulin对ige诱导rbl-2h3细胞凋亡的影响
[0086]
细胞经ao/eb染色后在显微镜下观察细胞形态，并对细胞进行计数，(图5、图6)，发现正常组细胞的形态正常且凋亡率极低为2.54％。模型组细胞形态肿胀破裂明显，凋亡率为35.02％。而在1nm和10nm indibulin的存在下，细胞肿胀程度有明显的减轻凋亡率分别为33.21％和17.09％。地塞米松组中，细胞状态接近于正常组细胞，凋亡率为8.98％。其中10nm indibulin组的凋亡率与模型组具有显著性差异(p《0.01)。
[0087]
1.3.6indibulin对小鼠被动皮肤过敏反应的影响
[0088]
1.3.6.1indibulin对小鼠耳部pca反应的影响
[0089]
如图7，模型组中小鼠耳部能够观察到蓝斑直径和肿胀度明显增加，indibulin给药组的小鼠耳部蓝斑直径和肿胀度有所降低。耳肿胀测量结果表明，模型组耳肿胀度为74.36％，显著高于正常组6.06％。腹腔注射indibulin后，小鼠耳肿胀度下降至69.44％、55.56％、42.42％，显著低于模型组。与耳肿胀结果一致，indibulin抑制了小鼠耳部因超敏反应而增加的evansblue渗出量。在indibulin高剂量(10mg/kg)渗出的染料量显著减少。evansblue的渗出量随indibulin的浓度升高而降低，呈现剂量依赖性。
[0090]
1.3.6.2indibulin对小鼠皮肤pca反应的影响
[0091]
如图所示，图8中模型组中小鼠皮肤能够观察到蓝斑直径明显增加，indibulin给药组的小鼠皮肤蓝斑直径有所降低。皮肤蓝斑直径测量结果表明，模型组蓝斑直径为4.2cm，显著高于正常组0cm。腹腔注射indibulin后，小鼠蓝斑直径下降至3.9cm、3.33cm、2.1cm，显著低于模型组。与蓝斑直径结果一致，indibulin抑制了小鼠皮肤因超敏反应而增加的evansblue渗出量。在indibulin高剂量(10mg/kg)渗出的染料量显著减少，且evansblue的渗出量随indibulin的浓度升高而降低，呈现剂量依赖性。
[0092]
1.3.6.3indibulin对小鼠足趾部pca反应的影响
[0093]
如图9所示，模型组中小鼠足趾部能够观察到蓝斑直径和肿胀度明显增加，indibulin给药组的小鼠足趾部蓝斑直径和肿胀度有所降低。足趾肿胀测量结果表明，模型组足趾肿胀度为65.17％，显著高于正常组2.98％。腹腔注射indibulin后，小鼠足趾肿胀度下降至63.22％、39.05％、16.08％，显著低于模型组。与足趾肿胀结果一致，indibulin抑制了小鼠足趾部因超敏反应而增加的evansblue渗出量。在indibulin高剂量(10mg/kg)渗出的染料量显著减少。evansblue的渗出量随indibulin的浓度升高而降低。
[0094]
1.3.7耳部病理染色
[0095]
如图10所示，模型组中小鼠耳部切片应用甲苯胺蓝染色后能够观察到血管扩张，耳廓明显增厚，皮下组织疏松水肿，在放大图中呈深蓝紫色卵圆形的肥大细胞有显著增加，indibulin给药组的小鼠耳部的皮下组织的水肿和肥大细胞数量呈剂量依赖性降低。
[0096]
如图11所示，模型组中小鼠耳部切片应用苏木精&伊红染色(hematoxylinandeosin,h&e)后同样能够观察到血管扩张，耳廓明显增厚，皮下组织疏松水肿，伴有炎性细胞浸润，indibulin给药组的小鼠耳部的皮下组织的水肿和炎性浸润度呈剂量依赖性降低。
[0097]
1.4结果分析
[0098]
微管的聚合和解聚容易受到药物影响。紫杉醇是一种天然产物，其衍生物通过稳定微管来诱导微管聚合，而诺考达唑、秋水仙碱、长春花碱和长春新碱则会破坏微管的稳定性。利用诺考达唑和紫杉醇的处理肥大细胞，能够抑制fcεri介导的脱颗粒和分泌颗粒向质膜的转移，证明了微管蛋白动力学在肥大细胞脱颗粒中的作用。用于治疗肥大细胞驱动的疾病的缩醛磷脂衍生物——米替福新(miltefosine)，被描述为通过抑制二酰甘油(dag)调节的常规蛋白激酶c(cpkc)亚型来抑制激活的肥大细胞中微管突起的形成。本研究选择的indibulin(吲地布啉，d-24851,zio301)n-(pyridin-4-yl)-[1-(4-chlorbenzyl)-indol-3-yl]-glyoxyl-amide，是由德国asta公司通过细胞筛选出的小分子化合物，其作用机制与长春新碱相似，但结合位点不同，可能作用在微管的一个新位点而产生抑制微管聚合的作用。目前已被发现对多种癌细胞系具有有效的活性，包括结肠癌、卵巢癌、宫颈癌、脑癌和胰腺癌细胞系，它在对紫杉醇、长春新碱或多柔比星耐药的多药耐药细胞系中也保持其疗效，且indibulin具有口服应用的特殊优势。发现在大鼠(植入了yoshidaah13肉瘤细胞以形成肿瘤)中口服indibulin2周诱导了肿瘤的完全缓解。此外，治疗剂量的indibulin没有产生血液学毒性，并且被很好地接受。在人类患者中，口服indibulin的血浆浓度在给药后约4h达到峰值，并在约96h内保持在定量下限以上，表明其良好的生物利用度，已经发现口服施用的indibulin在人类患者中具有良好的耐受性。indibulin最大优势是其相对较低的神经
毒性，通过对大鼠进行协调试验和测量外周神经元传导速度等检测神经毒性程度的常用指标进行检测，发现indibulin比长春新碱和紫杉醇表现出较低的神经毒性，在抗肿瘤有效剂量下未产生严重影响大鼠的行为表现。
[0099]
indibulin的抗肿瘤活性被认为主要与其对微管的作用有关。indibulin已被证明解聚微管并抑制细胞周期在g2/m期的进展。有人认为它在除了已知微管解聚剂的位点之外的位点结合微管蛋白。因此，本研究将indibulin作为抑制微管蛋白聚合促进蛋白3表达水平的制剂。
[0100]
为了研究微管聚合对于ige介导的超敏反应的影响，本发明选择了能影响微管聚合的indibulin作为研究对象。由于有研究已经证实抑制tppp3可以抑制细胞周期的g2/m期，影响微管的聚合，为了达到相同的效果，我们选择了同样可以抑制细胞周期的g2/m期，影响微管的聚合但无神经毒性的抗癌药物indibulin。阳性对照药物的选择了对多种过敏性疾病非常有效的药物糖皮质激素地塞米松，地塞米松不仅作用于淋巴细胞，还作用于嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和其他类型的炎症细胞，并能抑制细胞的效应功能，如化学介质的释放，从而减轻过敏性疾病部位的过敏性炎症。对于肥大细胞而言，地塞米松的作用包括减少组织肥大细胞的数量以及抑制ige和抗原诱导的反应，例如白三烯释放和细胞因子的产生。本实验发现，rbl-2h3细胞在50nm indibulin作用24h后对细胞的增殖产生显著的抑制。其ic
50
为42.07nm。于是在体外实验中选择1nm和10nm作为高低作用浓度。表明10nm indibulin可以显著抑制rbl-2h3细胞致敏激发后的形态学变化，减少细胞β-hex和ha的释放量，表明其对于肥大细胞脱颗粒的治疗作用。
[0101]
被动皮肤过敏反应(pca)一直是免疫药理学研究中最重要和最有用的方法之一，该动物模型一般使用生成的蓝斑区域的维度，如肿胀度和面积，作为评估小鼠pca的指标。本实验发现，由于发蓝区域扩散，仅仅测量尺寸不能全面准确反映反应的强度。因此，我们分别从蓝斑大小，肿胀程度和对与渗出染料的提取和定量技术来全面的评估小鼠的pca程度，更准确的确定药物的作用效果。通过小鼠的pca实验可以发现，腹腔注射10mg/kg indibulin可以降低被动皮肤过敏反应的小鼠耳部，足趾和背部组织evansblue的渗出度，缓解组织肿胀度，表明微管聚合抑制剂indibulin对ige介导的超敏反应具有显著治疗效果。he和甲苯胺蓝染色的结果表明，indibulin能够减轻过敏反应导致的耳部的皮下组织的水肿和炎性浸润。
[0102]
综合以上，本发明研究微管聚合抑制剂吲地布啉(indibulin)对超敏反应的影响，利用cck-8试剂测定indibulin对细胞作用的安全剂量，选择1nm和10nm为indibulin对脱颗粒的抑制浓度。结果表明，10nm indibulin能够显著改善脱颗粒时细胞形态的变化、抑制细胞凋亡、降低β-hex和ha的释放量。小鼠pca模型结果显示，indibulin能够显著抑制ige诱导的耳部、足趾部和背部皮肤伊文斯蓝渗出和组织肿胀等被动皮肤过敏反应。耳部组织切片经苏木精-伊红和甲苯胺蓝染色，发现indibulin能够显著抑制组织血管扩张、炎性细胞浸润以及肥大细胞的增加。本发明应用前期转录组测序技术筛选到参与肥大细胞脱颗粒的新蛋白分子tppp3，并在体内给药抑制tppp3的indibulin在i型超敏反应中的调控作用及可能的作用机制进行了分析，为揭示i型超敏反应发病机制及深入研究tppp3在i型超敏反应中作用提供实验基础与科学依据。
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以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行
限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种微管蛋白聚合促进蛋白3的抑制剂在制备治疗i型超敏反应药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制剂包括吲地布啉。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述吲地布啉通过改善肥大细胞脱颗粒的形态变化，减少细胞凋亡及降低细胞的组胺和β-氨基己糖苷酶释放量，发挥治疗i型超敏反应的作用。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述i型超敏反应包括ige介导的i型超敏反应。5.一种防治i型超敏反应的药物，其特征在于，包含吲地布啉，以及药学上可接受的载体。6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述载体包括赋形剂、乳化剂和表面活性剂中的一种或多种。7.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂或喷雾剂。8.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述药物服用方法为口服或非经肠胃形式服用。

技术总结
本发明公开了一种TPPP3抑制剂及其应用，属于生物医药制备技术领域。本发明公开了一种微管蛋白聚合促进蛋白3的抑制剂在制备治疗I型超敏反应药物中的应用，所述抑制剂包括吲地布啉。本发明应用前期转录组测序技术筛选到参与肥大细胞脱颗粒的新蛋白分子TPPP3，并在动物模型体内给药抑制TPPP3表达水平的吲地布啉(Indibulin)，结果显示，Indibulin能够显著抑制IgE诱导的耳部、足趾部和背部皮肤伊文斯蓝渗出和组织肿胀等被动皮肤过敏反应，且能够显著抑制组织血管扩张、炎性细胞浸润以及肥大细胞的增加；本发明为揭示I型超敏反应发病机制及深入研究TPPP3在I型超敏反应中作用提供实验基础与科学依据。验基础与科学依据。验基础与科学依据。


技术研发人员：张艳芬 肖雪然 高颖 磨建荣 程华
受保护的技术使用者：保定市旭卓生物科技有限公司
技术研发日：2023.06.06
技术公布日：2023/8/5