一种利用虾壳制备壳聚糖的方法

1.本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种利用虾壳制备壳聚糖的方法。


背景技术：

2.壳聚糖又名甲壳胺、脱乙酰甲壳素，它是白色无定型、半透明、略有珍珠光泽的固体，因原料和制备方法不同，分子量也从数十万到数百万不等。其不溶于水和碱溶液，可溶于稀的盐酸、硝酸等无机酸和大多数有机酸。它是生物界中大量存在的唯一的碱性多糖，由于其含有大量的游离氨基，分子带正电荷，且分子内存在c-3和c-6羟基基团与c-2氨基等基团，易于对其进行各种化学修饰，使反应活性大大增加。
3.因此，由于壳聚糖具有独特的理化性质和生物活性功能，易于被人体吸收。其不仅具有减肥调脂、美容护肤的功效，还可以升高血液ph值，增强免疫活性细胞质量和数量，抑制肿瘤血管内皮细胞的生长；活化修复干细胞，强化肝脏功能；促使胰岛素分泌，防治高血压；促进肠道有益菌得繁殖，吸附排除体内重金属等作用。
4.壳聚糖是甲壳素n-脱乙酰基的产物，一般而言，n-脱乙酰基脱去55％以上的就可称之为壳聚糖。一般是通过对甲壳素进行脱乙酰基制备壳聚糖。
5.目前，利用虾壳制备壳聚糖主要有以下三种方法：
6.1)传统的酸碱化学法，其使用高浓度的酸碱处理原料，脱除其中的矿物质、脂质、蛋白质等杂质，再经过脱色而成，导致甲壳素的结构被酸碱破坏，并产生大量的废酸废碱而污染环境。
7.2)微生物发酵方法，其制备壳聚糖时，虽然反应条件较温和，能耗低、对环境污染小等特点与保持甲壳素结构的完整，但是杂质去除效率较低，脱乙酰化程度低。
8.3)酶解法，现有酶解法制备壳聚糖时，利用酶与有机酸结合使用，可以达到脱乙酰基、脱钙与脱脂肪蛋白质的效果，同时又能够保持了甲壳素的结构，但是由于甲壳素结晶，导致脱乙酰基酶难以与底物(甲壳素)充分接触，脱乙酰度(简称dd)往往非常低。
9.以上三种方法中的脱色工艺一般均是使用化学试剂，如双氧水、次氯酸、高锰酸钾或漂白粉，均对环境产生污染。因此，目前利用虾壳制备壳聚糖的方法中，均存在相应的不足，如何去解决这些不足是本领域亟待解决的问题。


技术实现要素：

10.有鉴于此，为解决上述技术问题，本发明的目的在于提出一种利用虾壳制备壳聚糖的方法，所采用的技术方案为：
11.一种利用虾壳制备壳聚糖的方法，包括如下步骤：
12.s1.虾壳预处理，收集虾壳，洗干净，鼓风干燥箱中的温度为80℃-90℃，干燥时间为5h-6h，然后使用超声波细胞破碎机或高压均质机将虾壳超细粉碎，获得超细虾壳粉末；
13.s2.有机醇沸腾回流处理，将超细虾壳粉末置于圆底烧瓶中，使用有机醇进行沸腾冷凝回流处理，破坏甲壳素结晶区，以利于提高后续工序处理效果；
14.s3.有机醇沸腾回流处理结束后，静置15-20min，将有机醇上清液去除，虾壳粉末属于润湿状态即可,然后，加入适量的饮用水，搅拌15-20min，静置，去除上清液，如此循环多数，使用饮用水将虾壳粉末中含有的有机醇置换掉，同时，保持虾壳为润湿状态；
15.s4.使用柠檬酸调节体系的ph值＝4-4.5，然后，搅拌15-20min，加入蓝色犁头霉发酵液，在温度为25℃-60℃环境下，酶解3h-10h，脱除乙酰基；
16.s5.加入5g-10g的复合蛋白酶，在温度45℃-55℃环境下，酶解5h-6.5h，脱除脂肪蛋白质，然后，进行沸水灭酶5min；
17.s6.在脱蛋白的虾壳粉浆料中，加入1l-2l的10wt％的有机酸搅拌2h，去除钙盐，过滤，即可得到壳聚糖沉淀；
18.s7.将壳聚糖沉淀放置滤袋中，然后，放置索氏提取器中，进行有机醇沸腾回流提取去除色素，至洗脱液无色透明；
19.s8.色素去除后，将有机醇滤干，并放置于80℃干燥，即可得到产品壳聚糖。
20.进一步地，s1中，所述超细虾壳粉末的粒径小于500um。
21.进一步地，s1中，所述超细虾壳粉末的粒径小于250um。
22.进一步地，s2中，所述有机醇为甲醇或乙醇，优选乙醇。
23.进一步地，s6中，所述有机酸为柠檬酸、甲酸、乙酸或乙二酸，优选柠檬酸或乙酸；
24.进一步地，s4中，所述蓝色犁头霉发酵液加入量按照每克虾壳的量，加入50-250u，优选100u。
25.进一步地，s4中，加入蓝色犁头霉发酵液，在温度为40℃-50℃环境下，酶解6.5h，脱除乙酰基。
26.进一步地，s5中，所述复合蛋白酶为胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶中任何两种或两种以上。
27.进一步地，s5中，所述复合蛋白酶为胰蛋白酶与碱性蛋白酶组成的复合酶，两者比例为1：0.5-1：5，优选1：1。
28.进一步地，s5中，所述复合酶加入量为底物的0.5wt％-3wt％，优选1wt％；其酶解温度为25-75℃，优选55-65℃，进一步优选60℃；酶解时间为2-10h，优选6h；体系ph值为7.5-10，优选8.5。
29.本发明的有益效果在于：
30.本发明通过对虾壳进行超细粉碎，然后利用有机醇沸腾回流，破坏甲壳素结晶，再使用水将有机醇置换，使相关作用酶与底物得到充分接触，提高了酶解法工艺过程中的脱乙酰基、脱钙无机盐与脱蛋白质效果，并通过使用沸腾冷凝回流的有机醇洗脱色，制备高品质的壳聚糖。乙醇使用后，可以蒸馏回收，不会因为脱色而带来环境污染，达到绿色生产的效果。
具体实施方式
31.下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明，但这些举例性实施方式的用途和目的仅用来举例本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。
32.实施例1
33.本实施例中利用虾壳制备壳聚糖的方法，包括如下步骤：
34.s1.收集500g虾壳，用饮用水冲洗虾壳后，干燥，然后，使用高压均质机粉碎30min，获得粒径200um以下的虾壳粉末；
35.s2.将以上虾壳粉末放置于4l圆底烧瓶中，加入2l95％食用乙醇，并加热至沸腾冷凝回流处理5h。有机醇沸腾回流处理结束后，静置20min，将有机醇上清液去除，虾壳粉末属于润湿状态即可；
36.s3.加入2.5l饮用水，搅拌10min，静置20min，抽掉上清液。如此循环3遍；
37.s4.加入2l饮用水，然后，使用柠檬酸将体系的ph值调至4-4.5。加入蓝色犁头霉发酵液150u/g，在45℃条件下，对虾壳粉浆料进行酶解6.5h。加入5g的复合蛋白酶(胰蛋白酶：碱性蛋白酶＝1：1)，在50℃条件下，酶解6.5h；
38.s5.酶解完成后，将体系煮沸5min，灭菌，过滤，得到湿态沉淀。加入10wt％柠檬酸2l，并升温至60℃，搅拌2h，除去虾壳中的钙盐。过滤，即可得到壳聚糖粗品；
39.s6.将壳聚糖粗品装入滤袋中，并置于索氏提取器中，使用95％食用乙醇，沸腾回流抽提约6h，将色素去除；
40.s7.将乙醇滤干，并放置于80℃烘箱中，烘干，即可得到61.05g壳聚糖成品；
41.经检测，制得的壳聚糖样品含水量为4.01％，脱蛋白率95.35％。测定工艺中的脱钙率：91.33％，脱乙酰度87.85％，重均分子量为1150kda。
42.实施例2
43.本实施例中利用虾壳制备壳聚糖的方法，包括如下步骤：
44.s1.收集500g虾壳，用饮用水冲洗虾壳后，干燥，然后，使用高压均质机粉碎30min，获得粒径100um以下的虾壳粉末；
45.s2.将以上虾壳粉末放置于4l圆底烧瓶中，加入2l95％食用乙醇，并加热至沸腾冷凝回流处理8h。有机醇沸腾回流处理结束后，静置20min，将有机醇上清液去除，虾壳粉末属于润湿状态即可；
46.s3.加入2.5l饮用水，搅拌10min，静置20min，抽掉上清液。如此循环3遍；
47.s4.加入2l饮用水，然后，使用柠檬酸将体系的ph值调至4-4.5。加入蓝色犁头霉发酵液150u/g，在45℃条件下，对虾壳粉浆料进行酶解6.5h。加入5g的复合蛋白酶(胰蛋白酶：碱性蛋白酶＝1：2)，在50℃条件下，酶解6.5h；
48.s5.酶解完成后，将体系煮沸5min，灭菌，过滤，得到湿态沉淀。加入10wt％柠檬酸2l，并升温至60℃，搅拌2h，除去虾壳中的钙盐。过滤，即可得到壳聚糖粗品；
49.s6.将壳聚糖粗品装入滤袋中，并置于索氏提取器中，使用95％食用乙醇，沸腾回流抽提约6h，将色素去除；
50.s7.将乙醇滤干，并放置于80℃烘箱中，烘干，即可得到60.65g壳聚糖成品。
51.经检测，制得的壳聚糖样品含水量为4.18％，脱蛋白率97.36％。测定工艺中的脱钙率：93.03％，脱乙酰度89.06％，重均分子量为1090kda。
52.实施例3
53.本实施例中利用虾壳制备壳聚糖的方法，包括如下步骤：
54.s1.收集500g虾壳，用饮用水冲洗虾壳后，干燥，然后，使用高压均质机粉碎30min，获得粒径100um以下的虾壳粉末；
55.s2.将以上虾壳粉末放置于4l圆底烧瓶中，加入2l95％食用乙醇，并加热至沸腾冷凝回流处理8h。有机醇沸腾回流处理结束后，静置20min，将有机醇上清液去除，虾壳粉末属于润湿状态即可；
56.s3.加入2.5l饮用水，搅拌10min，静置20min，抽掉上清液。如此循环3遍；
57.s4.加入2l饮用水，然后，使用柠檬酸将体系的ph值调至4-4.5。加入蓝色犁头霉发酵液150u/g，在45℃条件下，对虾壳粉浆料进行酶解6.5h。加入5g的复合蛋白酶(胰蛋白酶：碱性蛋白酶＝1：1)，在50℃条件下，酶解6.5h；
58.s5.酶解完成后，将体系煮沸5min，灭菌，过滤，得到湿态沉淀。加入10wt％柠檬酸2l，并升温至60℃，搅拌2h，除去虾壳中的钙盐。过滤，即可得到壳聚糖粗品；
59.s6.将壳聚糖粗品装入滤袋中，并置于索氏提取器中，使用95％食用乙醇，沸腾回流抽提约6h，将色素去除；
60.s7.将乙醇滤干，并放置于80℃烘箱中，烘干，即可得到60.55g壳聚糖成品。
61.经检测，制得的壳聚糖样品含水量为4.11％，脱蛋白率96.35％。测定工艺中的脱钙率：93.33％，脱乙酰度89.86％，重均分子量为1100kda。
62.实施例4
63.本实施例中利用虾壳制备壳聚糖的方法，包括如下步骤：
64.s1.收集500g虾壳，用饮用水冲洗虾壳后，干燥，然后，使用高压均质机粉碎30min，获得粒径100um以下的虾壳粉末。
65.s2.将以上虾壳粉末放置于4l圆底烧瓶中，加入2l95％食用乙醇，并加热至沸腾冷凝回流处理8h。有机醇沸腾回流处理结束后，静置20min，将有机醇上清液去除，虾壳粉末属于润湿状态即可；
66.s3.加入2.5l饮用水，搅拌10min，静置20min，抽掉上清液。如此循环3遍；
67.s4.加入2l饮用水，然后，使用柠檬酸将体系的ph值调至4-4.5。加入蓝色犁头霉发酵液150u/g，在55℃条件下，对虾壳粉浆料进行酶解6.5h。加入5g的复合蛋白酶(胰蛋白酶：碱性蛋白酶＝1：1)，在55℃条件下，酶解6.5h；
68.s5.酶解完成后，将体系煮沸5min，灭菌，过滤，得到湿态沉淀。加入10wt％柠檬酸2l，并升温至60℃，搅拌2h，除去虾壳中的钙盐。过滤，即可得到壳聚糖粗品。
69.s6.将壳聚糖粗品装入滤袋中，并置于索氏提取器中，使用95％食用乙醇，沸腾回流抽提约6h，将色素去除。
70.s7.将乙醇滤干，并放置于80℃烘箱中，烘干，即可得到61.05g壳聚糖成品。
71.经检测，制得的壳聚糖样品含水量为4.45％，脱蛋白率95.35％。测定工艺中的脱钙率：92.93％，脱乙酰度90.86％，重均分子量为1098kda。
72.对比例1
73.本对比例中利用虾壳制备壳聚糖的方法，包括如下步骤：
74.s1.收集500g虾壳，用饮用水冲洗虾壳后，干燥。
75.s2.将以上虾壳放置于4l圆底烧瓶中，加入2l95％食用乙醇，并加热至沸腾冷凝回流处理5h。有机醇沸腾回流处理结束后，静置20min，将有机醇上清液去除，虾壳粉末属于润湿状态即可。
76.s3.加入2.5l饮用水，搅拌10min，静置20min，抽掉上清液。如此循环3遍。
77.s4.加入2l饮用水，然后，使用柠檬酸将体系的ph值调至4-4.5。加入蓝色犁头霉发酵液150u/g，在45℃条件下，对虾壳粉浆料进行酶解6.5h。加入5g的复合蛋白酶(胰蛋白酶：碱性蛋白酶＝1：1)，在50℃条件下，酶解6.5h。
78.s5.酶解完成后，将体系煮沸5min，灭菌，过滤，得到湿态沉淀。加入10wt％柠檬酸2l，并升温至60℃，搅拌2h，除去虾壳中的钙盐。过滤，即可得到壳聚糖粗品。
79.s6.将壳聚糖粗品装入滤袋中，并置于索氏提取器中，使用95％食用乙醇，沸腾回流抽提约6h，将色素去除。
80.s7.将乙醇滤干，并放置于80℃烘箱中，烘干，即可得到63.05g壳聚糖成品。
81.经检测，制得的壳聚糖样品含水量为4.01％，脱蛋白率45.15％。测定工艺中的脱钙率：71.33％，脱乙酰度25.85％，重均分子量为1160kda。
82.对比例2
83.本对比例中利用虾壳制备壳聚糖的方法，包括如下步骤：
84.s1.收集500g虾壳，用饮用水冲洗虾壳后，干燥，然后，使用高压均质机粉碎30min，获得粒径200um以下的虾壳粉末。
85.s2.加入2.5l饮用水，搅拌10min，静置20min，抽掉上清液。如此循环3遍。
86.s3.加入2l饮用水，然后，使用柠檬酸将体系的ph值调至4-4.5。加入蓝色犁头霉发酵液150u/g，在45℃条件下，对虾壳粉浆料进行酶解6.5h。加入5g的复合蛋白酶(胰蛋白酶：碱性蛋白酶＝1：1)，在50℃条件下，酶解6.5h。
87.s4.酶解完成后，将体系煮沸5min，灭菌，过滤，得到湿态沉淀。加入10wt％柠檬酸2l，并升温至60℃，搅拌2h，除去虾壳中的钙盐。过滤，即可得到壳聚糖粗品。
88.s5.将壳聚糖粗品装入滤袋中，并置于索氏提取器中，使用95％食用乙醇，沸腾回流抽提约6h，将色素去除。
89.s6.将乙醇滤干，并放置于80℃烘箱中，烘干，即可得到61.15g壳聚糖成品。
90.经检测，制得的壳聚糖样品含水量为4.61％，脱蛋白率65.38％。测定工艺中的脱钙率：81.13％，脱乙酰度27.88％，重均分子量为1145kda。
91.上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种利用虾壳制备壳聚糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：s1.虾壳预处理，收集虾壳，洗干净，鼓风干燥箱中的温度为80℃—90℃，干燥时间为5h-6h，然后使用超声波细胞破碎机或高压均质机将虾壳超细粉碎，获得超细虾壳粉末；s2.有机醇沸腾回流处理，将超细虾壳粉末置于圆底烧瓶中，使用有机醇进行沸腾冷凝回流处理，破坏甲壳素结晶区，以利于提高后续工序的处理效果；s3.有机醇沸腾回流处理结束后，静置15-20min，将有机醇上清液去除，虾壳粉末属于润湿状态即可,然后，加入适量的饮用水，搅拌15-20min，静置，去除上清液，如此循环多数，使用饮用水将虾壳粉末中含有的有机醇置换掉，同时，保持虾壳为润湿状态；s4.使用柠檬酸调节体系的ph值＝4-4.5，然后，搅拌15-20min，加入蓝色犁头霉发酵液，在温度为25℃-60℃环境下，酶解3h-10h，脱除乙酰基；s5.加入5g-10g的复合蛋白酶，在温度45℃-55℃环境下，酶解5h-6.5h，脱除脂肪蛋白质，然后，进行沸水灭酶5min；s6.在脱蛋白的虾壳粉浆料中，加入1l-2l的10wt％的有机酸搅拌2h，去除钙盐，过滤，即可得到壳聚糖沉淀；s7.将壳聚糖沉淀放置滤袋中，然后，放置索氏提取器中，进行有机醇沸腾回流提取去除色素，至洗脱液无色透明；s8.色素去除后，将有机醇滤干，并放置于80℃干燥，即可得到产品壳聚糖。2.根据权利要求1所述的利用虾壳制备壳聚糖的方法，其特征在于，s1中，所述超细虾壳粉末的粒径小于500um。3.根据权利要求2所述的利用虾壳制备壳聚糖的方法，其特征在于，s1中，所述超细虾壳粉末的粒径小于250um。4.根据权利要求1所述的利用虾壳制备壳聚糖的方法，其特征在于，s2中，所述有机醇为甲醇或乙醇，优选乙醇。5.根据权利要求1所述的利用虾壳制备壳聚糖的方法，其特征在于，s6中，所述有机酸为柠檬酸、甲酸、乙酸或乙二酸，优选柠檬酸或乙酸。6.根据权利要求1所述的利用虾壳制备壳聚糖的方法，其特征在于，s4中，所述蓝色犁头霉发酵液加入量按照每克虾壳的量，加入50-250u，优选100u。7.根据权利要求1所述的利用虾壳制备壳聚糖的方法，其特征在于，s4中，加入蓝色犁头霉发酵液，在温度为40℃-50℃环境下，酶解6.5h，脱除乙酰基。8.根据权利要求1所述的利用虾壳制备壳聚糖的方法，其特征在于，s5中，所述复合蛋白酶为胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶中任何两种或两种以上。9.根据权利要求8所述的利用虾壳制备壳聚糖的方法，其特征在于，s5中，所述复合蛋白酶为胰蛋白酶与碱性蛋白酶组成的复合酶，两者比例为1：0.5-1：5，优选1：1。10.根据权利要求8或9所述的利用虾壳制备壳聚糖的方法，其特征在于，s5中，所述复合酶加入量为底物的0.5wt％-3wt％，优选1wt％；其酶解温度为25-75℃，优选55-65℃，进一步优选60℃；酶解时间为2～10h，优选6h；体系ph值为7.5-10，优选8.5。

技术总结
本发明公开了一种利用虾壳制备壳聚糖的方法，通过对虾壳进行超细粉碎，然后，利用有机醇沸腾回流，破坏甲壳素结晶，再使用水将有机醇置换，使相关作用酶与底物得到充分接触，提高了酶解法工艺过程中的脱乙酰基、脱钙无机盐与脱蛋白质效果，并通过使用沸腾冷凝回流的有机醇洗脱色，制备高品质的壳聚糖。乙醇使用后，可以蒸馏回收，不会因为脱色而带来环境污染，达到绿色生产的效果。达到绿色生产的效果。


技术研发人员：黄幼菊 周长忍 王显赫 张鑫鑫 黄仕彬 杨东 冯哲
受保护的技术使用者：珠海科技学院
技术研发日：2023.05.31
技术公布日：2023/8/5