吡非尼酮作为预防和治疗炎症性肠病肠纤维化药物的用途的制作方法

1.本发明属于生物医学中炎症性肠病治疗技术领域，具体涉及广谱抗炎、抗氧化及抗纤维化新药吡非尼酮在预防和治疗炎症性肠病(包括溃疡性结肠炎和克隆恩氏病)及其所致肠纤维化方面的应用。


背景技术：

2.炎症性肠病(inflammatoryboweldisease，ibd)一般认为是遗传易感者在一定环境因素影响下肠粘膜免疫功能紊乱所致的慢性肠道炎症，主要包括克罗恩病(crohn’s disease，cd)和溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis，uc)。是一种原因尚未完全明确的结肠非特异性炎症性疾病，长期以来在欧美等西方国家高发。但是随着饮食等生活习惯的西化亚洲地区ibd发病率由20世纪末的0.6/10万迅速升至2013年的4.44/10万,近年来仍有快速上升的趋势，目前已经成为消化系统的常见疾病。ibd的发病机制目前尚未完全明确，众多的研究结果提示免疫、感染、血管病变以及神经内分泌等因素均可能参与疾病的发生及发展。但各类因素最终的结果是促发了结肠粘膜广泛的炎症反应，诸多的炎症调节因子表达异常，引发肠道粘膜的炎症病理改变并最终形成肠纤维化导致结肠组织结构及功能丧失的不可逆改变。迄今为止，ibd的发病及病理生理过程仍然未能明确提出最为关键和主要的机制。已经发现有一些细胞分子信号途径在疾病的发生、进展和后最终预后中具有重要作用。尽管目前国内外已经有相当多有关ibd分子机制的研究，也提出了许多相关分子和信号转导途径，但由于疾病本身的复杂性，这些研究结果距离阐明其分子机制仍十分遥远。仍然有重要的甚至是决定性的分子及其信号转导途径未被揭示。目前针对这些已知的ibd相关的分子已经研发了一些靶向治疗药物，诸如针对tnf-α的单抗英夫利昔、阿达木单抗，针对il-12/23的乌司奴单抗等，这些药物在临床应用中已经显示出来远强于以往化学药物的疗效。但由于这些抗体类药物作用靶点单一、免疫抑制作用较明显、并无明显抑制组织纤维化进展的作用且使用不便，因而发展新的多靶点并具有抗纤维化作用的口服药物具有重要意义，成为新的疾病治疗药物研究热点。
3.吡非尼酮由日本盐野义于2008年上市，已获得美国食品药品监督管理局批准用于特发性肺纤维化(ipf)的治疗。吡非尼酮是一种抗纤维化、抗炎和抗氧化化合物，它抑制tgf-β和自由基氧(ross)的产生，并降低il-1、il-6、il-8、il-12和tnf-α等细胞因子水平。一些临床前研究和临床试验表明，吡非尼酮对治疗ipf和肾纤维化有效。吡非尼酮治疗ipf的第一项临床、多中心、随机、双盲试验—在6分钟运动试验期间，通过脉搏血氧饱和度测定法[spo2]对基线最低血氧饱和度变化进行测定。结果提示主要终点无显著疗效。高剂量治疗(1800毫克/天)在9个月时对vc下降(次要终点)有积极作用。随后的一项多中心、随机、双盲iii期临床试验对275名ipf患者进行了研究，这些患者随机分为吡非尼酮1800mg/天、吡非尼酮1200mg/天或安慰剂组，为期52周，结果显示，与安慰剂组相比，两个吡非尼酮组的fvc下降速度明显减慢，无进展生存率明显提高。最后，ascend试验观察了555名来自美国、欧洲和澳大利亚的患者，他们被随机分配接受2403mg/天的吡非尼酮或安慰剂治疗52周。治
疗组fvc绝对下降显著减少，fvc下降的患者≥10％，显示了更好的无进展生存率。capacity和ascend试验表明，一年后全因死亡率和ipf相关死亡率均显著降低。最近的临床前研究关注吡非尼酮对肾纤维化的影响。rao等人研究表明，吡非尼酮可抑制糖尿病肾病(dn)小鼠肾脏的系膜基质扩张，降低i型和iv型胶原水平以及纤维连接蛋白基因表达。他们认为，作用机制可能是通过抑制eif4e的磷酸化，从而阻止纤维化蛋白的mrna加工和表达。使用5/6肾切除大鼠模型，sharma等人发现吡非尼酮抑制m1和m2巨噬细胞浸润。在uuo大鼠和培养的hk-2细胞中，吡非尼酮通过降低α-sma、i型和iii型胶原、s100a4、纤维连接蛋白的表达并增加e-钙粘蛋白的表达，以及抑制tgf-β1诱导的erk1/2、p38和jnk磷酸化上调，显著减弱tgf-β1诱导的emt和ecm合成。临床前研究表明吡非尼酮对肾纤维化有显著治疗作用。迄今为止唯一的人类试验是对77例dn患者进行的随机对照试验。试验表明，在吡非尼酮治疗1年后，egfr范围为20ml/min/1.73m2至75ml/min/1.73m2，治疗组患者的egfr平均增加+8.5ml/min/1.73m2，而安慰剂组的egfr平均减少2.2ml/min/1.73m2。目前尚需要更多的基础实验和临床试验来评估吡非尼酮是否可用于临床治疗纤维化肾病。从疾病发生及病理生理角度讲特发性肺纤维化、肾纤维化的疾病过程与炎症性肠病具有高度的相似性，均为从原因未完全明确的组织非特异性炎症反应逐步发生炎症浸润-组织破坏-修复-增生-纤维化的过程。在临床实验及应用中吡非尼酮与其它治疗炎症性肠病的药物不同，具有从广谱抗炎、抗氧化到抗纤维化的抑制疾病全病理生理过程作用。这一点对于炎症性肠病尤其是并发肠壁纤维化程度很高的克隆恩氏病尤其重要。可改善目前的治疗炎症性肠病药物抗氧化和抗纤维化不足的情况。
[0004]
综上所述，吡非尼酮是2008年新近批准的抗炎、抗氧化、抗纤维化药物，目前对该药疾病治疗谱的研究尚不充分，由于其多靶点的作用机制可能提示它是一个具有多种非特异性炎症及纤维化疾病的治疗药物，但目前采用吡非尼酮作为治疗ibd及其相关肠纤维化的研究工作还未见报道。


技术实现要素：

[0005]
为了克服现有技术中所存在的不足，本发明提供的一种新型广谱抗炎、抗氧化及抗纤维化药物吡非尼酮作为治疗炎症性肠病(包括溃疡性结肠炎和克隆恩氏病)及其所致肠纤维化的新用途，对于开发治疗炎症性肠病及其所致肠壁纤维化疗效更强且毒副作用更低的药物具有重要价值。
[0006]
本发明的目的是提供一种新型广谱抗炎、抗氧化及抗纤维化药物吡非尼酮作为预防和治疗炎症性肠病及其所致肠壁纤维化的新用途。
[0007]
第一方面，本发明提供了吡非尼酮主要作用靶分子纤维细胞生长因子(bfgf)、转化生长因子-β(tgf-β)在炎症性肠病肠纤维化结肠组织及正常结肠组织中表达情况的检测应用，并提示其表达情况在炎症性肠病结肠组织显著高于正常结肠组织，具有一定的临床应用意义。
[0008]
第二方面，本发明提供以c57小鼠采取右旋葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate,dss)化学诱导法构建炎症性肠病肠纤维化动物模型。
[0009]
第三方面，本发明提供了在c57小鼠炎症性肠病肠纤维化动物模型检测病变结肠组织吡非尼酮主要作用靶分子bfgf、tgf-β的表达情况并与空白对照动物比较。提示这两个
分子在病变组织中表达显著增高。
[0010]
第四方面，本发明提供了在炎症性肠病肠纤维化模型动物中给予吡非尼酮干预治疗可显著抑制动物结肠组织炎症水平及纤维化相关因子水平，降低炎症反应，尤其可显著抑制肠壁纤维化作用。提示该药物在炎症性肠病肠纤维化治疗中具有重要的潜力。
[0011]
本发明首次证实吡非尼酮通过口服方式进入炎症性肠病肠纤维化模型动物体内可以抑制动物结肠病变炎症反应并抑制肠壁纤维化进而改善预后。与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0012]
①
本发明提出了吡非尼酮治疗及预防炎症性肠病及其所致肠纤维化的全新用途，以往的ibd包括溃疡性结肠炎和克隆恩氏病治疗均以氨基水杨酸类药物-糖皮质激素-免疫抑制剂-单抗为主的生物制剂进行升阶梯治疗，以抗炎症反应为主，此类药物的作用机制均集中在对于组织炎症的抑制，对于中性粒细胞、淋巴细胞及炎症因子等的抑制。但其对于组织氧化过程及肠病反复修复和纤维化治疗不足，对于尤其以克隆恩氏病为代表的肠纤维化病变无法有效缓解，常需手术治疗而造成功能丧失。另外糖皮质激素、免疫抑制剂和单抗生物制剂药物治疗往往具有明显的免疫抑制的副作用，使得使用范围受限并易导致严重感染和肿瘤的发生率上升。而本发明原创研究即以广谱炎症及纤维化因子抑制剂吡非尼酮治疗炎症性肠病肠纤维化具有加强抗纤维化同时抗炎、抗氧化并无明显免疫抑制副作用的优势。
[0013]
②
本发明采用了吡非尼酮口服给药的途径，可有效提高治疗的依从性，减少注射的不良反应，而目前其他治疗炎症性肠病的单抗类生物制剂均为注射给药，且治疗过程复杂导致依从性差，并不利于持续保持血药浓度稳定。口服给药的途径充分改善了患者感受、治疗效率、有效改善血药浓度的稳定性。
[0014]
③
本发明采用的吡非尼酮口服制剂为可化学合成药物，较之生物制剂生产更加容易便捷，治疗成本较低，性价比较高，可提高患者的可接受性。
附图说明
[0015]
图1：吡非尼酮的化学分子式为c
12h11
no，分子结构如图。
[0016]
图2：tgf-β在炎症性肠病结肠组织中qpcr扩增曲线和溶解曲线图。结果表明，tgf-β在炎症性肠病结肠组织中表达水平上升。
[0017]
图3：bfgf在炎症性肠病结肠组织中westernblot结果，结果表明，bfgf在炎症性肠病结肠组织中表达水平上升。p为病变结肠组织，o为正常结肠组织。
[0018]
图4：tgf-β在炎症性肠病肠纤维化模型动物结肠组织中的免疫组化结果。结果表明，与空白对照动物相比，tgf-β在炎症性肠病模型动物结肠组织中的表达水平显著上升。
[0019]
图5:tgf-β和bfgf在炎症性肠肠纤维化模型动物结肠组织中表达情况的westernblot结果，结果表明，与空白对照动物相比，tgf-β和bfgf在炎症性肠病模型动物结肠组织中的表达水平显著上升。d为建模组结肠组织，o为空白组结肠组织。
[0020]
图6：各实验组干预治疗后动物结肠组织he染色图。a：空白对照组；b组：柳氮磺胺吡啶治疗组；c组：强的松治疗组；d组:吡非尼酮治疗组。结果显示：d组炎反应水平与c、b组相似，但结肠组织纤维化水平显著低于其它各组。
[0021]
图7：各实验组干预治疗后动物血清各类炎症及纤维化细胞因子水平图。a：空白对
照组；b组：柳氮磺胺吡啶治疗组；c组：强的松治疗组；d组:吡非尼酮治疗组。结果显示：a、c、b组tgf-β相似而d组显著降低，但结肠组织炎症细胞因子水平b、c、d三组均显著异于对照组。
具体实施方式
[0022]
以下结合实施例及附图对本发明的具体实施进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件操作。
[0023]
本发明中口服吡非尼酮胶囊为日本原研药物，纯度为99％。分子式如图1。
[0024]
实施例1：吡非尼酮主要作用靶分子tgf-β和bfgf在炎症性肠病肠纤维化结肠组织及正常结肠组织中表达情况的检测
[0025]
通过免疫组化法、qpcr法及western bloting法检测tgf-β和bfgf在炎症性肠病(合并肠壁纤维化)结肠组织及正常结肠组织中表达情况。免疫组化法：福尔马林溶液固定的组织块按照常规切片制片处理，照免疫试剂盒说明书进行免疫组化检测(sp法)tgf-β和bfgf表达。tgf-β和bfgf蛋白阳性均主要为粘膜细胞胞质棕色颗粒，采用免疫组化阳性细胞计数法分析，在40倍光镜下随机选择10个不重叠视野,计数阳性着色细胞数,每个组织选3张切片,每组10个样本全部计数,而后求出每张切片平均阳性细胞数进行组间比较。检测在10例人炎症性肠病(合并肠壁纤维化，uc7例，cd3例)组织和10例正常肠粘膜组织的免疫组化表达。与正常对照组比较，炎症性肠病结肠组织tgf-β和bfgf表达明显升高(p《0.05)。qpcr检测：取病变结肠组织与正常对照均150mg左右，使用异硫氰酸胍一步法提取总rna(code：d9108，takara大连宝生物有限公司)，所提取总rna液经紫外分光光度计测定a260/a280值，计算rna的纯度。使用primescript tmrt reagent kit(code：drr037a，takara大连宝生物有限公司)反转录合成cdna，所有操作均严格按照说明书进行，将所得6μl产物常规qpcr法检测，扩增标本以β肌动蛋白(β-actin)作为内参对照，计算检测结果以正常标本作为对照。qpcr扩增引物由北京塞百盛基因技术有限公司合成。
[0026]
1、建立以下qrt-pcr反应体系：
[0027]
rna template6ul2
×
master mix12.5ul50
×
sybr green i solution0.5ulrnase inhibitor0.5ulprimer f'(stock：10um)0.5ulprimer r'(stock：10um)0.5uldepc-treated h2oto 25ul
[0028]
2、每个样品，扩目的基因和内参，各3个重复
[0029]
3、pcr protocol：
[0030][0031][0032]
与正常对照组比较，炎症性肠病肠纤维化结肠组织tgf-β和bfgf mrna表达显著升高(p《0.05)(图2)。western-blot检测：常规提取组织总蛋白，bradford法测定蛋白质含量。常规制备10％分离胶和5％积层胶，按每孔50μg的蛋白量加样，样品加等体积的5
×
蛋白上样缓冲液，上样前将样品在沸水中加热10min，进行sds-page电泳。电泳后进行转膜，将分离蛋白质转移至pvdf膜上。pvdf膜于5％脱脂奶粉tbs中室温孵育2小时封闭非特异性抗原。而后加1:1000pbs稀释的一抗4℃孵育过夜。用tbs液洗膜3次，每次10min，滴加二抗工作液室温下孵育2h，再tbs洗膜3次，每次10min。随后滤纸吸干残液，完成显色及显影定影。western-blot检测以β-actin为内参对照，用图像分析软件ipp6.0对图像进行灰度分析，结果以目的条带与内参条带灰度的比值表示,而后求各组平均值进行组间比较。western-blot检测结果显示与正常对照组比较，炎症性肠病结肠组织tgf-β和bfgf蛋白质表达显著升高(p《0.05)(图3)。因此，上述检测结果提示吡非尼酮的靶点分子tgf-β和bfgf在炎症性肠病结肠组织表达显著上调。此类分子可能在炎症性肠病发生、发展及转归中起重要的作用，针对它们的干预可能起到相应的治疗作用。
[0033]
实施例2：dss化学诱导法构建c57小鼠炎症性肠病肠纤维化动物模型
[0034]
选取c57bl/6野生型小鼠(体重20～25g，8～12周)雌性。动物实验于中国人民解放军总医院第八医学中心动物实验室进行，实验条件：温度(22～25)℃，相对湿度40％～70％rh，相对空气压力10～20pa，空气交换频率10～15次/小时，备有中央空调和空气过滤机械设备，动物笼具、饮水、垫料等均经高压蒸汽消毒，每笼3只鼠，饲以spf级专用颗粒饲料，自由饮水。dss诱导建立小鼠炎症性肠病肠纤维化的模型，组别按照下一步治疗实验同步进行，每组12只小鼠，分别给予相应药物。空白对照组给予饮用蒸馏水，其余建模干预组给予间断饮用2％dss水，共四周。饮用dss的时间段为：第1～5天、第8～12天、第15～19天、第22～26天，第27、28天及其余时间饮用蒸馏水。结果同药物干预实验一并描述。
[0035]
实施例3：炎症性肠病肠纤维化动物模型病变结肠组织吡非尼酮靶点tgf-β和bfgf的表达情况检测
[0036]
采用免疫组织化学法、rt-pcr和western-blot分别检测dss炎症性肠病肠纤维化建模组和空白对照组结肠组织tgf-β和bfgfmrna和蛋白质水平的表达。免疫组化法与实施例1相同，福尔马林溶液固定的组织块按照常规切片制片处理，照免疫试剂盒说明书进行免疫组化检测(sp法)tgf-β和bfgf表达，结果可见tgf-β和bfgf阳性为棕黄色染色颗粒均匀分布于结肠上皮细胞、部分间质细胞胞浆中(图4)。rt-pcr检测，取空白及模型鼠结肠组织
150mg左右，使用异硫氰酸胍一步法提取总rna，所提取总rna液经紫外分光光度计测定a260/a280值，计算rna的纯度。使用primescript tmrt reagent kit反转录合成cdna，所有操作均严格按照说明书进行，将所得25μl产物冻存于-20℃冰箱以备进行pcr。采用常规pcr法检测，扩增标本以β-actin作为内参对照，计算检测结果以空白组标本作为对照。pcr扩增引物由北京塞百盛基因技术有限公司合成。扩增片段为409bp。以dna marker(dl2000)作为标准分子量标记，以相应的内参电泳条带作为参照，结果以两者之吸光度的比值表示,而后求各组平均值进行组间比较。western-blot实验具体步骤同实施例1。检测结果显示建模组tgf-β和bfgfmrna和蛋白质水平均显著高于空白对照组(图5)。
[0037]
实施例4：炎症性肠病肠纤维化模型动物中给予吡非尼酮干预治疗
[0038]
按照实施例2中的方法建模同步进行治疗实验。具体分组情况如下：除未建模空白对照组外实验小鼠随机分为4组各12只，均按dss建模方法处理同时按下述药物给予干预：a正常喂养蒸馏水作为空白对照组，b组喂食人类治疗剂量相应的柳氮磺胺吡啶，c组喂食人类治疗剂量相应的强的松，d组喂食10mg/kg/次的吡非尼酮。各组定时喂养，药物每日两次。于实验第10日及第30日各组分别随机选取3只动物采血检测相关指标及炎症因子水平。实验第2、3、4周统计各组小鼠疾病活动指数(disease activity index，dai)评分，35日后比较各组处死小鼠取结肠组织病理检测评估结肠病变改变情况。统计并比较各组小鼠的结肠长度/重量比值、he染色结肠组织纤维化评分、结肠组织病理评分、masson胶原染色评分、检测炎症及纤维化相关细胞因子γ-干扰素(fin-γ)、白细胞介素-2(il-2)、白细胞介素-10(il-10)、肿瘤坏死因子(tnf-α)、转化生长因子(tgf-β)。结果吡非尼酮治疗组、柳氮磺胺吡啶组、强的松组小鼠dai显著优于空白对照组(p《0.05)，吡非尼酮组结肠长度/重量比值、结肠组织纤维化、masson胶原染色评分显著低于其它各组(p《0.05)(图6)。吡非尼酮组tgf-β水平显著低于其他各组(p《0.05)，吡非尼酮组、柳氮磺胺吡啶组、强的松组的tnf-α、ifn-γ、il-2水平显著低于空白对照组(p《0.05)，il-10水平则显著高于空白对照组(p《0.05)(图7)。实验结果提示吡非尼酮在体内条件下对炎症性肠病的结肠组织炎症反应抑制作用与柳氮磺胺吡啶及强的松相似但抑制肠纤维化作用明显强于前两者。鉴于吡非尼酮为已经是批准进入临床的成熟药物应尽快展开针对炎症性肠病及合并肠纤维化的相关临床实验，可能改善ibd患者尤其是合并肠纤维化的cd患者的预后。

技术特征：
1.吡非尼酮或其药学上可接受的盐、脂、溶剂合物在预防和治疗炎症性肠病(包括溃疡性结肠炎和克隆恩氏病)及其所致肠纤维化中的应用。2.吡非尼酮在治疗炎症性肠病及其所致肠纤维化中的基本使用方法，包括有效剂量。3.根据权利要求1所述的应用，其特征是：吡非尼酮化学名为5-甲基-1-苯基-2-(1h)吡啶酮，分子式为c
12
h
11
no。为抑制炎症性肠病结肠组织炎症反应及其所致肠壁纤维化反应的主要活性成分。4.根据权利要求2所述，其特征是：使用方法为口服制剂吡非尼酮胶囊，纯度为99％，服用方法为10mg/kg/次，2次/日，给药间隔大约为12小时。5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于吡非尼酮对于炎症性肠病及肠纤维化组织具有广谱抗促炎细胞因子作用，尤其对纤维细胞生长因子(bfgf)、转化生长因子-β(tgf-β)和各类促炎白介素均有抑制作用，从而调节其相关的分子信号转导，降低炎症反应达到抗炎、抗氧化、抗纤维化改善组织状态的目的。6.根据权利要求1所述，其特征在于对于溃疡性结肠炎和克隆恩氏病及二者所致的肠纤维化疾病各类分型及各个分期预防和治疗中的应用。

技术总结
本发明涉及新型抗纤维化药物吡非尼酮的临床新用途。所述公开的新用途是吡非尼酮在预防和治疗炎症性肠病和其所致的肠纤维化的应用。首先根据吡非尼酮的药物作用机制，证实该纤维细胞生长因子和转化生长因子-β两种分子较正常结肠粘膜组织过表达。右旋葡聚糖硫酸钠诱导建立鼠IBD合并肠纤维化模型，分别予吡非尼酮灌胃，设立对照组，每日2次，连续28d。实验结束统计并比较各组小鼠的结肠炎症及纤维化指标。结果吡非尼酮组组织纤维化评分显著低于其它各组。吡非尼酮组炎症相关细胞因子显著低于对照组。实验研究发现吡非尼酮在对炎症性肠病肠纤维化的结肠组织抗炎、抗纤维化作用较强，是一种对于炎症性肠病及合并肠纤维化患者具有显著治疗潜力的药物。具有显著治疗潜力的药物。具有显著治疗潜力的药物。


技术研发人员：张林 侯艳红
受保护的技术使用者：侯艳红
技术研发日：2022.01.30
技术公布日：2023/8/8