一种1H-吲哚-2-羧酸衍生物及药物组合物与应用的制作方法

一种1h-吲哚-2-羧酸衍生物及药物组合物与应用
技术领域
1.本发明属于药物化学领域，具体地，涉及一种1h-吲哚-2-羧酸衍生物，包括该1h-吲哚-2-羧酸衍生物的药物组合物，以及该1h-吲哚-2-羧酸衍生物和药物组合物的应用。


背景技术：

2.肝细胞癌是肝癌的主要形式(90％以上)，也是最常见的恶性肿瘤之一，在我国，肝癌每年的新增发病人数和死亡人数在所有癌症中位居前列。整体来看，早、中期肝癌的治愈难度明显低于晚期，肝癌早期患者若接受肝切除或肝移植等标准治疗方法，是有一定几率根治肝癌的。此外，还有放射疗法、经导管动脉化疗栓塞和分子靶向治疗等临床治疗手段。与诸多恶性肿瘤类似，肝癌早期的症状不明显，同时肝癌细胞发展较快、容易转移，当病人察觉时往往已处于更难治疗的晚期，此时多数病人已失去了根治性治疗的机会，且接受根治性手术的患者仍有一定几率复发。因此，分子靶向治疗等非手术疗法对于救治肝癌患者有着重要意义。
3.作为高度血管化的恶性肿瘤，干预肿瘤细胞增殖和肿瘤血管增长是肝癌的一线治疗方案，如口服靶向药物索拉非尼，即第一款上市的抗肝癌靶向药物sorafenib，其主要靶点为raf和vegfr，可以同时靶向肝癌细胞和肿瘤血管。然而，长期服药患者体内的肝癌细胞会产生耐药性，这是因为肿瘤细胞在生长、侵袭转移过程中多次分裂，其子代不断发生基因或表观遗传层面的改变，而索拉非尼在对肿瘤和/或肿瘤血管产生杀伤作用的同时也筛选出了更加耐药的细胞亚群，使得靶向药物疗效降低。近几年来，乐伐替尼(2018)、卡博替尼(2019)、瑞戈非尼(2017)等多款用于肝癌一、二线治疗的小分子靶向药物接连上市，为肝癌患者提供了更多的治疗选择，但是考虑到肿瘤细胞强大的增殖能力和多药耐药性的不断发展，寻找新的肝癌作用靶标和具有更好的肝癌细胞(尤其是耐药肝癌细胞)抑制活性的靶向药物仍然具有重要意义。
4.14-3-3蛋白家族是一类在真核细胞体内广泛表达的分子量在28-33kda的酸性调控蛋白家族，其在哺乳动物中存在7种亚型(α/β，γ，σ，ε，ζ，η和θ/τ)，且不同亚型之间的氨基酸序列存在高度的一致性和保守性。14-3-3蛋白通常和靶蛋白通过蛋白-蛋白相互作用(ppis)，参与了许多信号传导通路的抑制或激活，从而改变靶细胞的亚定位、磷酸化状态或活化状态，如通过磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸的结合与细胞内蛋白相互作用，来调节多种细胞功能，参与许多重要的生命过程，包括转录翻译、细胞内信号传导、物质运输、dna损伤检查点、细胞周期进程和细胞凋亡等。14-3-3蛋白可以调节癌细胞的增殖、存活和迁移/侵袭，并作为潜在的癌症治疗靶标发挥作用，其中α/β，γ，σ，ε，ζ等亚型的研究较为充分，并且σ和ζ亚型已有小分子抑制剂报道。尽管对14-3-3η蛋白的研究相对较少，但已有研究成果表明其在肝癌形成与发展，特别是肝癌细胞耐药性产生中的重要作用。
5.首先，14-3-3η对于肿瘤发展中常见的ras/raf/mapk通路的激活有促进作用，14-3-3η可以在没有胞外信号的情况下与raf蛋白激酶结合，保持其活性构象，进而引发下游mek1/2和erk1/2等蛋白激酶的激活。14-3-3η还可以与磷酸化的erk1/2激酶形成正反馈通
路，进一步引起erk1/2的异常磷酸化，最后促进肿瘤生长和肿瘤血管的形成，这与索拉非尼对这一信号通路的抑制作用正好相反。
6.此外，14-3-3η通过激活缺氧诱导因子(hif)-1α，诱导并维持肝癌细胞的类肿瘤干细胞(csc)特性和索拉非尼耐药性。hif-1α是具有转录活性的一类核蛋白，其靶基因包括与缺氧适应、肿瘤生长相关的100多种基因，在缺氧环境下，hif-1α的激活促进了相关基因表达，引发血管生成、细胞分化、组织修复等生命活动。在肝癌治疗中，索拉非尼促进了肝癌细胞的微环境缺氧，同时发挥抗肿瘤作用，但也通过激活hif-1α诱导增强肝癌细胞的csc特性，从而导致肝癌细胞耐药性的产生。在肝癌细胞中，敲低14-3-3η的表达水平可以显著降低hif-1α的蛋白水平，而14-3-3η的过表达则增加了hif-1α的表达/核易位，分子对接的结果也发现了14-3-3η可以与hif-1α结合，其潜在的分子机制为14-3-3η通过抑制泛素化蛋白酶体的降解作用来稳定hif-1α，从而维持了csc特性。
7.14-3-3η还可以与nf-κb形成正反馈回路，维持肝癌的多药耐药性(mdr)。肿瘤细胞的活性氧簇(ros)水平相对于正常细胞有显著提升，而耐药细胞则表现出更高的ros水平，具有更好的抗氧化能力，其细胞内的活性氧存在着较高水平的动态平衡。细胞内ros水平的升高激活了nf-κb信号传导，这引起了14-3-3η的转录上调，nf-κb的激活也可以保持14-3-3η的高表达水平，从而形成了nf-κb/14-3-3η正反馈回路，14-3-3η表达水平的提高则可以降低细胞内的ros水平，以诱导/维持肝癌细胞的mdr表型。同时这一正反馈体系也可能参与调节肿瘤血管的生成和侵袭，以及介导下游的信号通路。
8.综上，14-3-3η有着成为肝癌治疗靶标的潜力，若能开发出相关的小分子抑制剂，则有望为晚期肝癌患者，特别是长期服用索拉非尼等药物的病患提供新的治疗手段。


技术实现要素：

9.为此，针对研发14-3-3η蛋白小分子抑制剂的重要意义，本发明的发明人在之前研究的基础上，通过进一步改造得到了一系列生物活性更优的14-3-3η小分子抑制剂，有助于开发全新而高效的肝癌治疗药物。
10.本发明的第一方面提供一种1h-吲哚-2-羧酸衍生物，所述1h-吲哚-2-羧酸衍生物为式(i)所示的化合物、或其药学上可接受的盐、溶剂化物、代谢产物或立体、互变异构体；
[0011][0012]
其中，
[0013]
r1选自c
1-c4的直链或支链的烷基或卤代烷基；
[0014]
r2选自羧基、含2～4个碳原子的酰胺基或含2～4个碳原子的酯基；
[0015]
a单元为芳基，所述芳基任选地被一个或多个选自羟基、c
1-c4的直链或支链烷氧基的取代基取代；
[0016]
b单元为芳基，所述芳烷基任选地被一个或多个选自卤素、羟基、胺基、c
1-c4的直链或支链烷基、c
1-c4的直链或支链烷氧基的取代基取代；
[0017]
x选自c
1-c4的亚烷基；
[0018]
y选自仲胺基或甲基叔胺基。
[0019]
根据本发明一种优选实施方式，r1选自-ch3、ch(ch3)2、-chf2或-cf3；优选地，r1为-ch3或ch(ch3)2。
[0020]
根据本发明一种优选实施方式，r2选自-conhch2ch3、-cooch2ch3、-cooh；优选地，r2为-cooh。
[0021]
根据本发明一种优选实施方式，a单元的结构如下：
[0022][0023]
其中，r3选自-och3或-oh，r4选自-h或-oh；优选地，r4为-h。
[0024]
根据本发明一种优选实施方式，b单元的结构如下：
[0025][0026]
其中，r5选自-h，-f，-ch3，-oh，-nh2或-och3；优选地，r5为-h，-ch3，-oh或-och3。
[0027]
根据本发明一种优选实施方式，x为-ch
2-，y选自-nh-或-n(ch3)-；优选地，y为-nh-。
[0028]
更具体地，所述式(i)所示的化合物选自以下化合物：
[0029][0030]
本发明的第二方面提供一种药物组合物，包括所述的1h-吲哚-2-羧酸衍生物与其他抗肿瘤活性物质；
[0031]
优选地，所述其他抗肿瘤活性物质选自索拉非尼(sorafenib)、乐伐替尼(lenvatinib、卡博替尼(cabozantinib)、瑞戈非尼(regofenib)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、纳武单抗(nivolumab)、folfox4、贝伐单抗(bevacizumab)、利尼伐尼(linifanib)、替万替尼(tivantinib)和阿昔替尼(axitinib)中的一种或多种。
[0032]
本发明的第三方面提供所述的1h-吲哚-2-羧酸衍生物或所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗恶性肿瘤的药物中的用途。
[0033]
具体地，所述恶性肿瘤选自乳腺癌、肺癌、前列腺癌、皮肤癌、结肠癌、胃癌、肝癌、直肠癌、白血病、宫颈癌、食管癌、甲状腺癌、膀胱癌、淋巴癌、胰腺癌、肾癌、子宫癌、口腔癌、皮肤黑色素瘤、卵巢癌、脑癌、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、胆囊癌、胶质母细胞瘤和睾丸癌中的
一种或多种；优选为肝癌。
[0034]
此外，所述肿瘤可以为耐药肿瘤，优选为动脉化栓塞化疗和/或索拉非尼耐药肝癌。
[0035]
相应地，本发明提供了一种预防和/或治疗肿瘤的方法，其包括给予有需要的对象预防和/或治疗有效量的本发明的式(i)所示的化合物、或其药学上可接受的盐、溶剂化物、代谢产物或立体、互变异构体。
[0036]
本发明提供所述的1h-吲哚-2-羧酸衍生物或所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗14-3-3η过表达相关疾病的药物中的用途。优选地，与14-3-3η过表达相关的疾病为肿瘤，特别是恶性肿瘤及相应的耐药肿瘤。所述恶性肿瘤和耐药肿瘤的类型如前所述，在此不再赘述。
[0037]
相应地，本发明提供了一种预防和/或治疗与14-3-3η过表达相关疾病的方法，其包括给予有需要的对象预防和/或治疗有效量的本发明的式(i)所示的化合物、或其药学上可接受的盐、溶剂化物、代谢产物或立体、互变异构体。
[0038]
本发明的第四方面提供所述的1h-吲哚-2-羧酸衍生物在制备14-3-3η蛋白抑制剂和/或肝癌细胞增殖抑制剂中的用途，所述肝癌细胞优选为smmc-7721、bel-7402、bel/5-fu、snu-387、hepg2和hep3b中的至少一种。
[0039]
本发明所述的式(i)所示的化合物及其任意优选形式均涵盖了其互变异构体、内消旋异构体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、氘代化合物、前药或其混合物形式，或式(i)所示的化合物及其任意优选形式均涵盖了其互变异构体、内消旋异构体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、氘代化合物、前药或其混合物的药学上可以接受的盐或溶剂化物。
[0040]
本发明所述基团和化合物中所涉及的元素碳、氢、氧、硫、氮或卤素均包括它们的同位素情况，本发明所述基团和化合物中所涉及的元素碳、氢、氧、硫、氮或卤素任选地进一步被一个或多个它们对应的同位素所替代，其中碳的同位素包括
12
c、
13
c和
14
c，氢的同位素包括氕(h)、氘(d，又称重氢)和氚(t，又称超重氢)，氧的同位素包括
16
o、
17
o和
18
o，氮的同位素包括
14
n和
15
n，氟的同位素
19
f。
[0041]
本发明的化合物能够与14-3-3η蛋白有效结合，且对于一系列人肝癌细胞系的杀伤作用强于阳性药物索拉非尼，具备较大的临床应用潜力。
[0042]
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
[0043]
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
[0044]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
[0045]
实施例一，化合物5的合成
[0046][0047]
步骤1：将3-异丙基苯胺(50mmol)，2-氧代丙酸乙酯(60mmol)，醋酸(150mmol)和醋酸钯(5mmol)溶于100ml dmso。加装一个200ml氧气球后将混合物加热至70℃并搅拌过夜。tlc检测反应完成后停止加热，待反应物自然冷却后首先过滤除去固体杂质，后加入200ml水，充分震荡后静置分层，水相用乙酸乙酯萃取三次，每次100ml，收集全部有机相并用饱和食盐水洗涤一次。有机相用无水硫酸钠除水并过滤，真空旋干多余溶剂后，残留物在pe:ea＝4:1的极性下过硅胶柱纯化，得到纯净的黄色中间体5a，收率为20.6％。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.71(s,1h),7.54(d,j＝8.3hz,1h),7.24(d,j＝1.4hz,1h),7.06(dd,j＝2.2,0.9hz,1h),6.98(dd,j＝8.4,1.5hz,1h),4.30(q,j＝7.1hz,2h),2.95(hept,j＝6.9hz,1h),1.31(t,j＝7.1hz,3h),1.22(d,j＝6.9hz,6h).
[0048]
步骤2：将三氯氧磷(11mmol)滴加至0℃的无水dmf(5ml)中，在0℃下搅拌15分钟。再将中间体5a(10mmol)溶于5ml无水dmf，并将溶液缓慢滴入三氯氧磷的dmf溶液，再将混合体系在0℃下搅拌30分钟。将反应体系转移至油浴锅，在60℃下搅拌反应8-12h。待反应完成后，将混合物缓慢倒入100ml冰水中，再用1m氢氧化钠溶液调ph至10，有大量黄色固体析出，过滤所得固体并转移至50℃烘箱过夜即可得纯净的黄色中间体5b，收率为97.5％。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ12.69(s,1h),10.57(s,1h),8.13(d,j＝8.4hz,1h),7.35(d,j＝1.5hz,1h),7.21(dd,j＝8.4,1.5hz,1h),4.43(q,j＝7.1hz,2h),2.99(p,j＝6.9hz,1h),1.37(t,j＝7.1hz,3h),1.23(d,j＝6.9hz,6h).
[0049]
步骤3：将中间体5b(1mmol)，苄溴(2mmol)和无水碳酸钾(1.5mmol)加入5ml无水乙腈中，升温至50℃，搅拌反应16-48℃。tlc检测反应完成后停止加热，自然冷却后过滤除去固体杂质，再加入4m盐酸调ph至1，后加入10ml水静置分层。水相用乙酸乙酯萃取三次，每次10ml，收集有机相后用无水硫酸钠除水并过滤，再旋干多余溶剂。残留物在pe:ea＝4:1的极性下过硅胶柱纯化，得到纯净的淡黄色中间体5c，收率为81.0％。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ10.44(s,1h),8.21(d,j＝8.3hz,1h),7.53(s,1h),7.32
–
7.25(m,3h),7.24
–
7.19(m,1h),
7.07(dd,j＝6.9,1.8hz,2h),5.83(s,2h),4.36(q,j＝7.1hz,2h),2.97(hept,j＝6.9hz,1h),1.25(t,j＝7.1hz,3h),1.19(d,j＝6.9hz,6h).
[0050]
步骤4：将中间体5c(1mmol)，3-甲氧基苄胺(1.5mmol)和三乙酰氧基硼氢化钠(3mmol)溶于10ml无水乙醇。在室温下搅拌反应24-48h。tlc检测反应完成后，加入5％碳酸氢钠溶液将反应体系调至碱性，静置分层，水相用二氯甲烷萃取三次，每次20ml。收集有机相，用5％碳酸氢钠溶液和饱和食盐水各洗涤一次。有机相用无水硫酸钠除水并过滤，真空旋干多余溶剂后，残留物在pe:ea＝2:1的极性下过硅胶柱纯化，得到纯净的白色中间体5d，收率为69.3％。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.71(d,j＝8.3hz,1h),7.36(s,1h),7.23(dd,j＝8.3,6.8hz,2h),7.20
–
7.13(m,2h),7.04(dd,j＝8.4,1.4hz,1h),6.99
–
6.94(m,2h),6.89
–
6.84(m,2h),6.78
–
6.74(m,1h),5.75(s,2h),4.16(q,j＝7.1hz,2h),4.08(s,2h),3.69(s,3h),3.66(s,2h),2.94(hept,j＝6.9hz,1h),1.20(d,j＝6.9hz,6h),1.14(t,j＝7.1hz,3h).
[0051]
步骤5：将中间体5d(0.25mmol)和氢氧化锂(1.25mmol)溶于由水(2ml)、甲醇(2ml)和四氢呋喃(2ml)组成的混合溶剂中，常温搅拌过夜。待反应完全后，加入20％柠檬酸调ph至3，有白色固体析出，过滤所得固体并在真空中旋干，即可得纯净的白色产物5，收率为98.1％。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ10.98(s,1h),7.58(d,j＝8.3hz,1h),7.33
–
7.26(m,2h),7.20(dd,j＝8.0,6.4hz,2h),7.16
–
7.12(m,1h),7.12
–
7.07(m,2h),7.05(t,j＝2.0hz,1h),7.03
–
6.97(m,2h),6.93(dd,j＝8.3,2.6hz,1h),5.95(s,2h),4.35(s,2h),4.06(s,2h),3.70(s,3h),2.91(hept,j＝6.8hz,1h),1.17(d,j＝6.9hz,6h)；
13
c nmr(101mhz,dmso)δ165.24,159.83,145.04,139.65,137.08,134.86,133.75,130.31,128.67,127.20,127.16,124.96,121.97,119.90,119.70,115.51,114.60,109.96,108.54,55.54,49.37,47.00,41.54,34.35,24.71；hrms(esi)m/z calculated for c
28h31
n2o3[m+h]
+
:443.2329,found:443.2322；hplc analysis:97.36％purity.
[0052]
化合物1-4，6-8，10-11，13-14的合成路线同实施例一。这些最终产物的结构数据如下：
[0053]
化合物1：1-(4-羟基苄基)-3-(((3-甲氧基苄基)氨基)甲基)-6-甲基-1h-吲哚-2-羧酸
[0054]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ10.35(s,1h),9.35(s,1h),7.45(d,j＝8.1hz,1h),7.27(t,j＝7.9hz,1h),7.21(s,1h),6.98
–
6.86(m,6h),6.60
–
6.56(m,2h),5.81(s,2h),4.19(s,2h),3.91(s,2h),3.72(s,3h),2.35(s,3h)；
13
c nmr(101mhz,dmso)δ165.66,159.84,156.61,137.01,136.70,135.39,132.48,130.15,130.13,128.58,124.90,121.87,121.52,119.12,115.36,114.97,114.09,111.08,110.13,55.52,49.72,46.25,42.08,22.11；hrms(esi)m/z calculated for c
26h27
n2o4[m+h]
+
:431.1965,found:431.1955；hplc analysis:94.71％purity.
[0055]
化合物2：3-((4-羟基-3-甲氧基苄基)氨基)甲基)-1-(4-甲氧基苄基)-6-甲基-1h-吲哚-2-羧酸
[0056]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.17(s,1h),9.26(s,1h),7.50(d,j＝8.1hz,1h),7.25(s,1h),7.10
–
7.02(m,2h),6.98(d,j＝1.5hz,1h),6.92(dd,j＝8.2,1.3hz,1h),6.78(q,j＝2.0hz,3h),6.76(d,j＝2.3hz,1h),5.88(s,2h),4.24(s,2h),3.93(s,2h),3.74(s,3h),
3.65(s,3h),2.36(s,3h)；
13
c nmr(101mhz,dmso)δ165.39,158.55,148.06,147.38,136.73,135.32,132.91,131.81,128.55,124.53,124.19,122.64,122.18,119.14,115.91,114.05,114.03,111.13,108.68,56.06,55.44,55.42,49.06,46.12,22.11；hrms(esi)m/z calculated for c
27h29
n2o5[m+h]
+
:461.2060,found:461.2071；hplc analysis:98.79％purity.
[0057]
化合物3：3-((3-羟基苄基)氨基)甲基)-1-(4-甲氧基苄基)-6-甲基-1h-吲哚-2-羧酸
[0058]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.41(s,1h),9.68(s,1h),7.50(d,j＝8.1hz,1h),7.25(s,1h),7.18(t,j＝7.8hz,1h),7.06(d,j＝8.3hz,2h),6.91(d,j＝8.2hz,1h),6.84
–
6.72(m,5h),5.88(s,2h),4.28(s,2h),3.93(s,2h),3.64(s,3h),2.35(s,3h)；
13
c nmr(101mhz,dmso)δ165.36,158.57,158.10,136.79,135.11,132.95,131.81,130.23,128.55,124.57,122.21,120.18,119.17,116.56,115.99,114.08,111.14,108.90,55.45,49.17,46.15,41.73,22.10；hrms(esi)m/z calculated for c
26h27
n2o4[m+h]
+
:415.1965,found:431.1957；hplc analysis:94.97％purity.
[0059]
化合物4：3-((2-羟基-5-甲氧基苄基)氨基)甲基)-1-(4-甲氧基苄基)-6-甲基-1h-吲哚-2-羧酸
[0060]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ10.92(s,1h),7.53(d,j＝8.2hz,1h),7.22(s,1h),7.05(d,j＝8.2hz,2h),6.90(d,j＝8.1hz,1h),6.79(dt,j＝19.3,5.6hz,5h),5.89(s,2h),4.29(s,2h),3.94(s,2h),3.64(s,3h),3.63(s,3h),2.35(s,3h)；
13
c nmr(101mhz,dmso)δ165.41,158.49,152.34,150.03,136.68,135.39,132.77,131.81,128.50,124.79,122.14,120.39,119.18,116.42,116.36,115.57,114.04,111.11,108.66,55.81,55.41,46.10,44.27,41.86,22.11；hrms(esi)m/z calculated for c
27h29
n2o5[m+h]
+
:461.2059,found:461.2071；hplc analysis:95.98％purity.
[0061]
化合物6：6-异丙基-3-(((3-甲氧基苄基)氨基)甲基)-1-(4-甲基苄基)-1h-吲哚-2-羧酸
[0062]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ10.85(s,1h),7.58(d,j＝8.3hz,1h),7.34
–
7.27(m,2h),7.06
–
7.00(m,3h),6.99(s,4h),6.94(dd,j＝8.1,2.6hz,1h),5.89(s,2h),4.34(s,2h),4.05(s,2h),3.72(s,3h),2.92(p,j＝6.9hz,1h),2.17(s,3h),1.18(d,j＝6.9hz,6h)；
13
c nmr(101mhz,dmso)δ164.95,159.82,145.12,137.14,136.55,136.29,134.82,133.30,130.32,129.22,127.18,124.91,121.98,119.91,119.74,115.53,114.60,110.16,108.59,55.56,49.44,46.75,41.50,34.35,24.72,21.06；hrms(esi)m/z calculated for c
29h33
n2o3[m+h]
+
:457.2486,found:457.2476；hplc analysis:95.41％purity.
[0063]
化合物7：1-(2-氟苄基)-6-异丙基-3-(((3-甲氧基苄基)氨基)甲基)-1h-吲哚-2-羧酸
[0064]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ10.89(s,1h),7.62(d,j＝8.3hz,1h),7.30(dd,j＝15.3,7.4hz,2h),7.24
–
7.15(m,2h),7.08
–
7.00(m,3h),6.95(dq,j＝7.4,2.4,1.8hz,2h),6.64
–
6.55(m,1h),6.01(s,2h),4.38(s,2h),4.09(s,2h),3.73(s,3h),2.93(hept,j＝7.0hz,1h),1.18(d,j＝6.9hz,6h)；
13
c nmr(101mhz,dmso)δ164.88,161.16,159.83,158.73,145.38,137.19,134.79,133.43,130.31,129.23,129.15,128.56,128.52,126.53,
126.39,124.87,124.83,124.80,121.99,120.20,119.86,115.61,115.53,115.41,114.63,110.46,108.03,55.55,49.45,41.46,41.07,34.33,24.66；hrms(esi)m/z calculated for c
28h30
fn2o3[m+h]
+
:461.2235,found:461.2223；hplc analysis:99.18％purity.
[0065]
化合物8：1-(4-羟基苄基)-6-异丙基-3-(((3-甲氧基苄基)氨基)甲基)-1h-吲哚-2-羧酸
[0066]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ10.90(s,1h),9.33(s,1h),7.48(d,j＝8.2hz,1h),7.32
–
7.25(m,2h),7.02
–
6.89(m,6h),6.61
–
6.56(m,2h),5.83(s,2h),4.22(s,2h),3.94(s,2h),3.72(s,3h),2.92(hept,j＝7.0hz,1h),1.19(d,j＝6.9hz,6h).
13
c nmr(101mhz,dmso)δ165.61,159.83,156.62,144.05,136.58,135.43,130.22,130.05,128.81,125.13,121.60,119.34,119.19,115.31,115.09,114.24,109.49,108.57,55.52,49.38,46.20,41.89,34.30,24.80.hrms(esi)m/z calculated for c
28h31
n2o4[m+h]
+
:459.2278,found:459.2268；hplc analysis:91.21％purity.
[0067]
化合物10：3-(((4-羟基-3-甲氧基苄基)氨基)甲基)-6-异丙基-1-(4-甲氧基苄基)-1h-吲哚-2-羧酸
[0068]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.16(s,1h),9.22(s,1h),7.51(d,j＝8.0hz,1h),7.31(s,1h),7.10(d,j＝8.2hz,2h),7.02
–
6.95(m,2h),6.82
–
6.72(m,4h),5.89(s,2h),4.23(s,2h),3.92(s,2h),3.72(s,3h),3.64(s,3h),2.93(hept,j＝7.5,6.8hz,1h),1.19(d,j＝7.0hz,6h)；
13
c nmr(101mhz,dmso)δ165.49,158.54,148.04,147.39,144.36,136.61,135.37,131.79,128.76,124.90,124.15,122.62,119.54,119.24,115.91,114.04,113.99,108.68,108.57,55.99,55.42,55.35,49.05,46.10,34.31,24.78；hrms(esi)m/z calculated for c
29h33
n2o5[m+h]
+
:489.2384,found:489.2372；hplc analysis:95.52％purity.
[0069]
化合物11：3-((3-羟基苄基)氨基)甲基)-6-异丙基-1-(4-甲氧基苄基)-1h-吲哚-2-羧酸
[0070]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.52(d,j＝8.3hz,1h),7.29(d,j＝1.4hz,1h),7.17(t,j＝7.8hz,1h),7.14
–
7.08(m,2h),6.98(dd,j＝8.3,1.4hz,1h),6.82(t,j＝1.9hz,1h),6.77(ddt,j＝9.6,7.7,2.2hz,4h),5.89(s,2h),4.25(s,2h),3.90(s,2h),3.63(s,3h),2.92(hept,j＝7.1hz,1h),1.19(d,j＝6.8hz,6h)；
13
c nmr(101mhz,dmso)δ165.59,158.53,158.11,144.23,136.59,135.66,135.35,131.83,130.18,128.77,125.06,120.05,119.47,119.25,116.47,115.84,114.00,109.26,108.53,55.41,49.34,46.10,41.89,34.31,24.80；hrms(esi)m/z calculated for c
28h31
n2o4[m+h]
+
:459.2278,found:459.2270；hplc analysis:96.46％purity.
[0071]
化合物13：6-(二氟甲基)-1-(4-甲氧基苄基)-3-((3-甲氧基苄基)氨基)甲基)-1h-吲哚-2-羧酸
[0072]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.30(s,1h),7.75(d,j＝8.3hz,1h),7.74
–
7.70(m,1h),7.32(t,j＝7.9hz,1h),7.26(d,j＝8.3hz,1h),7.11
–
7.06(m,2h),7.04(t,j＝56.2hz,1h),7.01
–
6.93(m,3h),6.80
–
6.74(m,2h),5.96(s,2h),4.34(s,2h),4.04(s,2h),3.74(s,3h),3.64(s,3h)；
13
c nmr(101mhz,dmso)δ164.71,159.89,158.69,138.16,135.40,135.06,131.34,130.38,129.14(t,j＝21.7hz),128.59,128.27,121.81,120.11,117.26,116.30
(t,j＝236.1hz),115.42,114.54,114.16,109.78,108.62,55.59,55.45,49.13,46.37,41.50；hrms(esi)m/z calculated for c
27h27
f2n2o4[m+h]
+
:481.1933,found:481.1928；hplc analysis:97.28％purity.
[0073]
化合物14：1-(4-甲氧基苄基)-3-(((3-甲氧基苄基)氨基)甲基)-6-(三氟甲基)-1h-吲哚-2-羧酸
[0074]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.22(s,1h),7.89(s,1h),7.83(d,j＝8.4hz,1h),7.36(dd,j＝8.5,1.5hz,1h),7.33(t,j＝7.9hz,1h),7.11
–
7.07(m,2h),7.01
–
6.93(m,3h),6.80
–
6.75(m,2h),6.01(s,2h),4.36(s,2h),4.05(s,2h),3.74(s,3h),3.64(s,3h).
13
c nmr(101mhz,dmso)δ164.47,159.92,158.75,139.42,135.03,134.93,131.20,130.39,129.16,128.62,125.62(q,j＝272.7hz),123.69(q,j＝31.4hz),121.82,120.49,116.45(q,j＝3.65hz),115.45,114.60,114.20,109.22(d,j＝4.81hz),108.55,55.60,55.46,49.17,46.39,41.44.hrms(esi)m/z calculated for c
27h26
f3n2o4[m+h]
+
:499.1839,found:499.1829；hplc analysis:97.56％purity.
[0075]
实施例二，化合物9的合成
[0076][0077]
化合物9的合成从中间体5b出发，步骤3、4、5同实施例一，但步骤5中需在1m hcl中结晶，而非20％柠檬酸。
[0078]
步骤6：将9d(0.25mmol)溶于5ml冰醋酸，在20℃下搅拌1h，后加入2.5mmol锌粉，在20℃下搅拌过夜。反应完成后，过滤除去固体杂质，真空旋干醋酸，加入饱和碳酸钠溶液中和混合物中残余醋酸，用乙酸乙酯萃取得到黄色中间体9e，无需进一步提纯即可进行下一步反应，收率84.3％。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.67(d,j＝8.4hz,1h),7.39(s,1h),7.19(t,j＝7.8hz,1h),7.02(dd,j＝8.3,1.4hz,1h),6.85(d,j＝8.7hz,2h),6.78
–
6.70(m,3h),6.42
–
6.35(m,2h),5.53(s,2h),4.94(s,2h),4.19(q,j＝7.1hz,2h),4.03(s,2h),3.69(s,3h),3.63(s,2h),2.96(p,j＝6.9hz,1h),1.22(d,j＝6.7hz,6h),1.19(t,j＝7.1hz,3h).
[0079]
化合物9：1-(4-氨基苄基)-6-异丙基-3-(((3-甲氧基苄基)氨基)甲基)-1h-吲哚-2-羧酸
[0080]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.44(s,1h),7.49(d,j＝8.3hz,1h),7.34
–
7.30(m,2h),6.99
–
6.92(m,4h),6.92
–
6.86(m,2h),6.41
–
6.33(m,2h),5.75(s,2h),4.89(s,2h),4.24(s,2h),3.98(s,2h),3.73(s,3h),2.93(hept,j＝7.0hz,1h),1.19(d,j＝6.9hz,6h)；
13
c nmr(101mhz,dmso)δ165.51,159.84,147.88,144.14,136.60,135.31,135.27,130.37,128.60,126.72,124.90,121.76,119.46,119.14,115.30,114.49,113.95,108.79,108.49,
55.55,48.90,46.30,41.60,34.32,24.81；hrms(esi)m/z calculated for c
28h32
n3o3[m+h]
+
:458.2438,found:458.2427；hplc analysis:90.22％purity.
[0081]
实施例三，化合物12的合成
[0082][0083]
化合物12的合成同样从中间体12c出发，12c经由步骤1,2,3合成，步骤4、5同实施例一。
[0084]
步骤7：将中间体12d(0.3mmol)，碘甲烷(0.33mmol)和无水碳酸钾(0.36mmol)加入到5ml无水乙腈中。将混合物搅拌回流24h，待反应完全后，用4m hcl除去残余碳酸钾，再加入10ml乙酸乙酯，静置分层。水相用乙酸乙酯萃取三次，每次10ml。收集有机相，用无水硫酸钠除水并过滤。真空除去多余溶剂，残留物在pe:ea＝4:1的极性下过硅胶柱纯化，得到纯净的白色中间体12e，收率75.8％。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.76(d,j＝8.2hz,1h),7.33(s,1h),7.19(t,j＝8.0hz,1h),6.97
–
6.94(m,1h),6.89(d,j＝8.7hz,2h),6.84
–
6.81(m,2h),6.79
–
6.75(m,3h),5.62(s,2h),4.26(q,j＝7.1hz,2h),3.96(s,2h),3.69(s,3h),3.64(s,3h),3.44(s,2h),2.38(s,3h),2.04(s,3h),1.25(t,j＝7.1hz,3h).
[0085]
化合物12：1-(4-甲氧基苄基)-3-(((3-甲氧基苄基)(甲基)氨基)甲基)-6-甲基-1h-吲哚-2-羧酸
[0086]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.58(d,j＝8.2hz,1h),7.35
–
7.30(m,1h),7.28(s,1h),7.00(d,j＝8.4hz,2h),6.96(d,j＝2.5hz,2h),6.94(t,j＝4.4hz,2h),6.75(d,j＝8.5hz,2h),5.86(s,2h),4.38(s,2h),4.02(s,2h),3.73(s,3h),3.62(s,3h),2.37(s,3h),2.36(s,3h)；
13
c nmr(101mhz,dmso)δ164.92,159.93,158.57,137.25,134.37,133.69,133.61,131.52,130.42,128.25,124.77,122.70,122.55,119.23,116.23,114.54,114.15,111.29,109.82,57.62,55.56,55.42,50.93,46.29,37.64,22.08；hrms(esi)m/z calculated for c
28h31
n2o4[m+h]
+
:459.2278,found:459.2268；hplc analysis:98.58％purity.
[0087]
实施例四，中间体2-(氨基甲基)-4-甲氧基苯酚的合成
[0088][0089]
合成化合物4所需关键中间体2-(氨基甲基)-4-甲氧基苯酚无市售购买产品，其合成步骤分为如下两步。
[0090]
步骤8：将2-羟基-5-甲氧基苯甲醛(10mmol)和盐酸羟胺(12mmol)溶于10ml乙醇和
5ml组成的混合溶剂，常温下搅拌2h，析出大量白色固体。待反应完成后，过滤所得固体并在真空下旋干，即可得纯净的白色中间体2-羟基-5-甲氧基苯甲醛肟，收率76.2％。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.28(s,1h),9.58(s,1h),8.27(s,1h),7.03(d,j＝2.7hz,1h),6.84
–
6.77(m,2h),3.67(s,3h).
[0091]
步骤9：将2-羟基-5-甲氧基苯甲醛肟(5mmol)溶于10ml醋酸，20℃下搅拌30分钟后加入锌粉(30mmol)，保持该温度并搅拌过夜。反应完全后，过滤除去固体杂质，真空旋干除去多余醋酸。向残留物中加入1m hcl(10ml)，回流8h，真空旋干水分，并加入适量甲基叔丁基醚析晶，过滤并干燥即可得到纯净的2-(氨基甲基)-4-甲氧基苯酚盐酸盐晶体，收率74.3％。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.54(s,2h),6.96(d,j＝3.0hz,1h),6.84(d,j＝8.8hz,1h),6.76(dd,j＝8.8,3.0hz,1h),3.88(s,2h),3.66(s,3h).
[0092]
实施例五，本发明中化合物对肝癌细胞株的抑制活性的测定
[0093]
实验选用人肝癌smmc-7721、bel-7402、snu-387、hep g2和hep 3b细胞株(以上均由中国科学院细胞库提供)以及对5-氟尿嘧啶(5-fu)耐药的bel-7402细胞株(bel/5-fu，bel/5-fu细胞株经验证具有化疗多药耐药性(doi.org/10.1186/s13046-018-1005-y))。分别应用1μm，5μm、10μm、25μm和50μm待测化合物处理72h，测试不同化合物浓度下细胞的抑制率，并使用非线性回归计算生成标准曲线，算得ic
50
值。结果显示为“最佳拟合值
”±“
标准误差”，详见表一。每个待测化合物均进行了至少三次独立重复实验。
[0094]
表一本发明中化合物对肝癌细胞株的抑制活性
[0095][0096]
其中，对照1的结构如下所示：
[0097][0098]
由表一可知，本发明包含的多种化合物均对一系列肝癌细胞株和肝癌耐药细胞株发挥了良好的抑制作用，比索拉非尼活性更优。
[0099]
实施例六，本发明中的化合物对14-3-3η蛋白的蛋白-小分子结合力的测定
[0100]
仪器选用fortebio inc.(fremont，ca，usa)提供的octet red 96e，ni-nta探针同样购自该公司，通过生物层干涉测量法(bli)确定本发明中的化合物和14-3-3η蛋白之间的蛋白-小分子相互作用。实验开始前，使用zeba脱盐旋光柱对14-3-3η蛋白进行脱盐处理，然后根据octet red 96e的标准实验方案，可分为如下几步进行实验：
①
基线1，传感器在0.1m pbs缓冲液中实现平衡；
②
负载，将传感器置于蛋白-生物素溶液中4℃下浸泡过夜以负载蛋白质；
③
基线2，将传感器移到含有0.1m pbst的板上并再次达到平衡；
④
关联，将传感器移至小分子配体的缓冲液中并测量kon；
⑤
解离，将传感器移到0.1m pbst缓冲液中并测得kdis。利用5种浓度(6.25μm，12.5μm，50μm，100μm，200μm)下的小分子配体拟合得到最终曲线，所有数据均由fortebio数据分析软件进行分析，平衡解离常数(kd)值用公式(kd＝k
dis
/k
on
)进行计算。其实验结果如表二所示。
[0101]
表二本发明中化合物对对14-3-3η蛋白的蛋白-小分子结合力
[0102]
[0103][0104]
由表二可知，本发明的多种代表性化合物，如化合物5、6、7、11，均与14-3-3η蛋白存在良好的蛋白-小分子结合力，其结合力优于阳性对照ato(ato已被证实可以与14-3-3η蛋白相结合(doi.org/10.1186/s13046-018-1005-y))。可以证明本发明中的代表性化合物为14-3-3η蛋白的小分子抑制剂。
[0105]
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

技术特征：
1.一种1h-吲哚-2-羧酸衍生物，所述1h-吲哚-2-羧酸衍生物为式(i)所示的化合物、或其药学上可接受的盐、溶剂化物、代谢产物或立体、互变异构体；其中，r1选自c
1-c4的直链或支链的烷基或卤代烷基；r2选自羧基、含2～4个碳原子的酰胺基或含2～4个碳原子的酯基；a单元为芳基，所述芳基任选地被一个或多个选自羟基、c
1-c4的直链或支链烷氧基的取代基取代；b单元为芳基，所述芳烷基任选地被一个或多个选自卤素、羟基、胺基、c
1-c4的直链或支链烷基、c
1-c4的直链或支链烷氧基的取代基取代；x选自c
1-c4的亚烷基；y选自仲胺基或甲基叔胺基。2.根据权利要求1所述的1h-吲哚-2-羧酸衍生物，其中，r1选自-ch3、ch(ch3)2、-chf2或-cf3；优选地，r1为-ch3或ch(ch3)2；r2选自-conhch2ch3、-cooch2ch3、-cooh；优选地，r2为-cooh。3.根据权利要求1所述的1h-吲哚-2-羧酸衍生物，其中，a单元的结构如下：其中，r3选自-och3或-oh，r4选自-h或-oh；优选地，r4为-h。4.根据权利要求1所述的1h-吲哚-2-羧酸衍生物，其中，b单元的结构如下：其中，r5选自-h，-f，-ch3，-oh，-nh2或-och3；优选地，r5为-h，-ch3，-oh或-och3。5.根据权利要求1所述的1h-吲哚-2-羧酸衍生物，其中，x为-ch
2-，y选自-nh-或-n(ch3)-；优选地，y为-nh-。6.根据权利要求1所述的1h-吲哚-2-羧酸衍生物，其中，所述式(i)所示的化合物选自以下化合物：
7.一种药物组合物，包括权利要求1-6中任意一项所述的1h-吲哚-2-羧酸衍生物与其他抗肿瘤活性物质；优选地，所述其他抗肿瘤活性物质选自索拉非尼、乐伐替尼、卡博替尼、瑞戈非尼、雷莫芦单抗、纳武单抗、folfox4、贝伐单抗、利尼伐尼、替万替尼和阿昔替尼中的一种或多种。8.权利要求1-6中任意一项所述的1h-吲哚-2-羧酸衍生物或权利要求7所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗恶性肿瘤的药物或用于预防和/或治疗14-3-3η过表达相关疾病的药物中的用途。9.根据权利要求8所述的用途，其中，所述恶性肿瘤选自乳腺癌、肺癌、前列腺癌、皮肤癌、结肠癌、胃癌、肝癌、直肠癌、白血病、宫颈癌、食管癌、甲状腺癌、膀胱癌、淋巴癌、胰腺癌、肾癌、子宫癌、口腔癌、皮肤黑色素瘤、卵巢癌、脑癌、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、胆囊癌、胶质母细胞瘤和睾丸癌中的一种或多种；优选为肝癌；
所述恶性肿瘤为耐药肿瘤，优选为动脉化栓塞化疗和/或索拉非尼耐药肝癌。10.权利要求1-6中任意一项所述的1h-吲哚-2-羧酸衍生物在制备14-3-3η蛋白抑制剂和/或肝癌细胞增殖抑制剂中的用途，所述肝癌细胞优选为smmc-7721、bel-7402、bel/5-fu、snu-387、hepg2和hep3b中的至少一种。

技术总结
本发明属于药物化学领域，涉及一种1H-吲哚-2-羧酸衍生物及药物组合物与应用。所述1H-吲哚-2-羧酸衍生物为式(I)所示的化合物、或其药学上可接受的盐、溶剂化物、代谢产物或立体、互变异构体。本发明的化合物能够与14-3-3η蛋白有效结合，且对于一系列人肝癌细胞系的杀伤作用强于阳性药物索拉非尼，具备较大的临床应用潜力。用潜力。用潜力。


技术研发人员：蒋宇扬 高振雄 张存龙 陈大伟 吴伟彬 刘子建
受保护的技术使用者：深圳贝瑞生物医药科技有限公司
技术研发日：2022.01.29
技术公布日：2023/8/8