一种人偏肺病毒病毒样颗粒、制备方法、应用及疫苗与流程

1.本发明属于病毒领域，具体地说，涉及一种人偏肺病毒病毒样颗粒、制备方法、应用及疫苗。


背景技术：

2.人偏肺病毒(human metapneumovirus，hmpv)是2001年首次分离发现的肺病毒科肺病毒亚科新成员，可感染各年龄人群，其中婴幼儿、老年人和免疫抑制人群感染率较高，血清学研究显示5岁儿童的hmpv抗体阳性率达100％。hmpv主要在冬春季节流行，目前尚未有hmpv疫苗批准上市。处于研究阶段的hmpv疫苗包括减毒活疫苗、亚单位蛋白疫苗、福尔马林灭活疫苗和cd8
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t细胞(tcd8)表位疫苗。然而，减毒活疫苗在免疫功能低下者中禁用，亚单位蛋白疫苗的免疫原性低于减毒疫苗和灭活疫苗，tcd8表位疫苗并不能完全抵御病毒感染，hmpv灭活疫苗会导致抗体依赖性增强现象。
3.病毒样颗粒(virus like particle，vlp)是利用病毒蛋白的自我组装能力形成的颗粒状物质，不含病毒核酸，形态结构与病毒类似。vlp不仅安全性好，而且保留了天然病毒颗粒的空间构象和诱导中和抗体的抗原表位，有效地诱导机体产生体液和细胞免疫应答。因此，vlp 是具有发展潜力的新型候选疫苗，人乳头瘤病毒和乙型肝炎病毒等vlp疫苗已用于临床。
4.因此，倘若能够提供一种人偏肺病毒病毒样颗粒，具有良好的免疫保护作用，则具有重要的理论意义和社会意义。
5.有鉴于此特提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种人偏肺病毒病毒样颗粒、制备方法、应用及疫苗。本发明采用杆状病毒昆虫细胞表达系统制备了基于hmpv f蛋白和流感病毒m1蛋白的病毒样颗粒，具有免疫原性和优良的免疫保护作用，为hmpv疫苗特别是vlp疫苗的研发提供理论数据和奠定基础。
7.为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：
8.本发明的第一目的是提供一种人偏肺病毒病毒样颗粒(hmpv vlp)，人偏肺病毒病毒样颗粒由流感病毒h2n2的m1蛋白和人偏肺病毒的f蛋白组装而成。
9.人偏肺病毒的融合蛋白f(hmpv f蛋白)为膜糖蛋白，介导病毒的穿入及细胞融合，是主要的病毒保护性抗原，所诱导的中和抗体可以保护机体防止不同亚型的病毒感染。流感病毒h2n2的基质蛋白m1，在流感病毒的复制中起到关键作用，从病毒进入到组装中均起作用。
10.本发明中人偏肺病毒病毒样颗粒由流感病毒h2n2的m1蛋白和人偏肺病毒的f蛋白组装形成，在表达时结构稳定，制备效率高，制备的病毒样颗粒免疫原性好，能够达到优良的免疫保护作用。
11.进一步的方案，编码m1蛋白的核酸序列如seq id no:1所示，编码f蛋白的核酸序列如seq id no:2所示。
12.本发明中按照sf9昆虫细胞密码子偏好性对蛋白的编码序列进行了优化，更有利于采用杆状病毒昆虫细胞表达系统制备hmpv vlp，能够提高表达量，更好的获得hmpv vlp。
13.本发明的第二目的是提供一种如上所述的人偏肺病毒病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：
14.(1)构建重组质粒：将流感病毒h2n2的m1基因和人偏肺病毒的f基因序列克隆到 pfastbacdual载体中，得到重组质粒pfastbacdual-m1-f；
15.(2)转染：将重组质粒pfastbacdual-m1-f转染sf9昆虫细胞，获得重组sf9细胞；
16.(3)分离纯化：培养重组sf9细胞，离心纯化得到人偏肺病毒病毒样颗粒vlp。
17.本发明采用杆状病毒昆虫细胞表达系统制备hmpv vlp。杆状病毒昆虫细胞表达系统是当今基因工程四大表达系统之一，具有安全、高效、表达产物与天然蛋白在结构及功能上相似等特点，已经成功表达构建多种病毒样颗粒。虽然杆状病毒表达系统日渐成熟，但感染复数、感染时间和细胞密度等因素依然对杆状病毒系统大规模生产有重要影响。因此，本发明着重对影响杆状病毒系统表达的因素进行了摸索和优化。
18.进一步的方案，步骤(3)中，采用贴壁培养的方式培养重组sf9细胞，制备vlp。
19.本发明利用了sf9昆虫细胞贴壁培养和悬浮培养两种方法对hmpv f蛋白进行表达，以探索目的蛋白最佳的表达方式，最终发现通过贴壁培养sf9细胞能够更好的制备hmpv vlp。
20.进一步的方案，步骤(3)中，将重组sf9细胞进行多代扩大培养纯化；
21.优选的，至少经过p1，p2，p3，p4代扩大培养。
22.进一步的方案，扩大培养纯化方法包括：
23.(1)重组质粒转染sf9昆虫细胞后，72h后收获病变细胞上清，即为p1代重组杆状病毒；
24.(2)将p1代重组杆状病毒加入处于对数生长期的sf9昆虫细胞，27℃培养72小时，连续传代重组杆状病毒至p4代，收获病变细胞上清和细胞；
25.(3)收集p4代病变上清和细胞，经超离浓缩后进行蔗糖密度梯度超速离心，重悬于pbs，得到纯化的人偏肺病毒病毒样颗粒vlp。
26.hmpv病毒样颗粒vlp在sf9细胞中表达成功，本发明的扩大培养纯化方法，能够实现hmpv vlp的大量生产，有利于进一步推广大规模生产。
27.本发明的第三目的是提供一种表达如上所述的人偏肺病毒病毒样颗粒的重组载体，以 pfastbacdual为表达载体，插入流感病毒h2n2的m1基因和人偏肺病毒的f基因序列。
28.本发明的第四目的是提供一种重组细胞，所述重组细胞中包含如上所述的载体；
29.优选的，所述重组细胞为包含如上所述的载体的sf9昆虫细胞。
30.本发明的第五目的是提供一种如上所述的人偏肺病毒病毒样颗粒在制备预防和/或治疗人偏肺病毒药物中的应用；
31.优选的，人偏肺病毒病毒样颗粒在制备人偏肺病毒疫苗中的应用。
32.本发明的第六目的是提供一种人偏肺病毒病毒疫苗，包含如上所述的人偏肺病毒病毒样颗粒。
33.进一步的方案，人偏肺病毒病毒疫苗还包括药物学上可接受的辅料；
34.优选的，所述辅料包括佐剂；
35.作为一种优选的实施方式，所述的人偏肺病毒病毒疫苗包括人偏肺病毒病毒样颗粒和氢氧化铝佐剂。
36.本发明将hmpvvlp肌肉注射免疫小鼠可诱导特异性体液免疫和细胞免疫应答，并在hmpv攻毒后产生较好的免疫保护作用，氢氧化铝佐剂可以增强hmpvvlp的免疫原性和免疫保护作用。
37.采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
38.1、本发明的人偏肺病毒病毒样颗粒由优化的流感病毒h2n2的m1蛋白和人偏肺病毒的f蛋白组装而成，具有免疫原性，hmpvvlp肌肉注射免疫小鼠可产生体液免疫和细胞免疫应答，具有优良的免疫保护作用。
39.2、目前国内外尚未有利用杆状病毒昆虫细胞表达系统制备hmpvvlp的报道，本发明建立了杆状病毒昆虫细胞制备vlp方法，对表达条件进行探索和优化，确定最佳实验条件，获得hmpvvlp。具体的，本发明通过利用sf9细胞贴壁培养的方式，经p1、p2、p3和p4代扩大培养，能够获得大量的hmpvvlp。
40.3、本发明的人偏肺病毒病毒样颗粒与氢氧化铝佐剂组合使用，可增强免疫应答水平，hmpv病毒攻击后，vlp可以产生有效的免疫保护作用。
41.下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。
附图说明
42.附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：
43.图1是重组质粒pfastbacdual-m1的pcr鉴定结果；
44.图2是质粒pmd18-t-f和pfastbacdual-m1双酶切鉴定结果；从左到右依次为：pmd18-t-f质粒；pmd18-t-f双酶切；pfastbacdual-m1质粒；pfastbacdual-m1双酶切；dnamarker15000；
45.图3是pfastbacdual-m1-f的f基因pcr鉴定结果；
46.图4是pfastbacdual-m1-f的m13引物pcr鉴定结果；其中，左边两孔：pfastbacdual-m1-f基因(4194bp)；中间两孔：pfastbacdual(2560bp)；最后一孔：dnamarker15000；
47.图5是pfastbacdual-m1-f转染sf9细胞病变图；
48.图6是流感病毒m1蛋白(a)和hmpvf蛋白(b)的westernblotting鉴定结果；
49.图6b中从左至右依次为pfastbacdual-m1-f质粒1μg转染；pfastbacdual-m1-f质粒2μg转染；
50.图7为sf9昆虫细胞表达hmpvvlp电镜观察；
51.图8为hmpvvlp免疫小鼠的血清igg抗体水平；
52.图9为hmpvvlp免疫小鼠刺激的ifn-γ和il-4淋巴细胞数；
53.图10是hmpv攻毒后肌肉注射免疫小鼠体重变化；
54.图11是hmpv攻毒后小鼠肺部病毒量测定；
55.图12是hmpv vlp免疫小鼠肺组织的免疫组化分析。
56.需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。
具体实施方式
57.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
58.实施例一利用杆状病毒昆虫细胞表达系统制备hmpv vlp
59.(1)重组质粒pfastbacdual-m1-f构建：按sf9昆虫细胞密码子偏好性优化流感a/annarbor/6/1960(h2n2)m1基因序列和hmpv f基因，合成m1基因和f基因后分别连接至 pmd18-t，得到pmd18-t-m1和pmd18-t-f。采用sphi和nhei双酶切pmd18-t-m1和 pfastbacdual，然后连接酶切产物，得到的重组质粒命名为pfastbacdual-m1，利用pcr鉴定重组质粒pfastbacdual-m1。采用bamhi和noti双酶切pmd18-t-f和pfastbacdual-m1，连接酶切产物，命名为pfastbacdual-m1-f，然后进行pcr和酶切鉴定。
60.其中，流感a/ann arbor/6/1960(h2n2)m1的基因序列如seq id no:1所示，hmpv f 基因的序列如seq id no:2所示。m1基因和f基因的引物如表1所示。
61.结果：sphi和nhei双酶切pmd18-t-m1和pfastbacdual，连接酶切产物，pcr鉴定连接成功(pfastbacdual-m1，如图1所示)。bamhi和noti双酶切pmd18-t-f和pfastbacdual-m1 后如图2所示，将酶切产物进行过夜连接，pcr鉴定连接产物结果如图3所示，可见特异性条带，说明成功构建重组杆状病毒质粒pfastbacdual-m1-f。
62.表1引物
63.名称序列酶切位点编号m1基因正向引物gctagcatgtctctgctgaccgasphiseq id no:3m1基因反向引物gcatgcttatttgaagcgctgcatnheiseq id no:4f基因正向引物ggatccatgtcctggaaggtggtcatbamhiseq id no:5f基因反向引物gcggccgcttaggagtgagggatganotiseq id no:6
64.(2)重组质粒pfastbacdual-m1-f转化dh10 bac感受态细胞
65.将pfastbacdual-m1-f和pfastbacdual转化dh10bac感受态细胞，分别按照1:10、1:100 和1:1000三个稀释度划板多抗lb平板，经m13引物pcr鉴定和测序，筛选f基因阳性菌落。pfastbacdual-m1-f的m13引物pcr鉴定结果如图4所示。
66.(3)重组杆状病毒质粒pfastbacdual-m1-f转染
67.将重组质粒pfastbacdual-m1-f转染sf9细胞，利用贴壁培养的sf9细胞进行vlp表达，经p1、p2、p3和p4扩大培养表达m1蛋白和f蛋白，采用western-blot鉴定m1蛋白和f 蛋白表达情况。
68.具体的扩大培养方法：
69.(1)重组质粒转染sf9昆虫细胞后，72h后收获病变细胞上清，即为p1代重组杆状病
毒；
70.(2)将p1代重组杆状病毒加入处于对数生长期的sf9昆虫细胞，27℃培养72小时，连续传代重组杆状病毒至p4代，收获病变细胞上清和细胞；
71.(3)收集p4代病变上清和细胞，经超离浓缩后进行蔗糖密度梯度超速离心，重悬于pbs，得到纯化的人偏肺病毒病毒样颗粒vlp，透射电镜鉴定vlp形态结构。
72.结果：显微镜下观察可见pfastbacdual-m1-f转染孔的细胞病变明显(如图5所示)。经western-blot鉴定(m1蛋白以兔源hmpv m1蛋白多抗为一抗，羊抗兔hrp标记的igg 为二抗；f蛋白以鼠源hmpv f蛋白单抗为一抗，羊抗鼠hrp标记的igg为二抗)，流感 m1蛋白(28kd)和hmpv f(62kd)蛋白表达成功(见图6a和6b)。
73.经p1、p2、p3和p4扩大培养表达m1蛋白和f蛋白，通过纯化获得hmpv vlp，在负染电镜观察可见到vlp，如图7所示。
74.实施例二hmpv vlp疫苗的制备及免疫原性研究
75.1、方法
76.(1)hmpv vlp疫苗的制备
77.a.hmpv vlp疫苗：
78.含有佐剂组：每只小鼠免疫剂量为5μg vlp和1mg/ml al(oh)3，
79.不含佐剂组的每只小鼠免疫剂量为5μg vlp。
80.b.pbs-佐剂对照：不含抗原，只含1mg/ml al(oh)3佐剂。
81.(2)小鼠免疫
82.balb/c小鼠随机分成六组，每组10只。将(1)制备的疫苗以肌肉注射免疫方式在第0 天，21天和42天免疫balb/c小鼠。
83.其中，实验组包括含有佐剂和vlp的免疫组、不含佐剂而仅含vlp的免疫组(a)，对照组不含抗原只含佐剂(b)。
84.(3)样本采集及检测
85.每组取5只小鼠，在免疫第21天，42天和56天采集血清，elisa法检测血清总igg抗体水平和中和抗体滴度，分析igg1、igg2a、igg2b和igg3抗体亚型分布。在56天收集小鼠肺泡灌洗液和脾淋巴细胞，elisa法检测siga水平，elispot法检测细胞免疫反应。
86.2、检测结果
87.2.1体液免疫水平
88.(1)血清特异性总igg抗体水平检测：如图8所示，随着免疫次数增加，hmpv vlp 免疫小鼠诱导的血清igg抗体水平逐渐上升，含佐剂的hmpv vlp组的血清总igg抗体水平高于不含佐剂vlp组，佐剂对照组无血清igg抗体产生，说明hmpv vlp肌肉注射免疫时可产生体液免疫水平，氢氧化铝佐剂可增强体液免疫应答。
89.(2)血清特异性总igg亚型检测：将hmpv vlp免疫小鼠血清用pbs进行100倍稀释，吸取80ul稀释后的血清加入小鼠抗体亚型快速检测卡的检测孔，出现多条重链线和多条轻链线，根据红线深浅判定血清抗体主要是igg2b亚型。
90.(3)血清中和抗体检测：将倍比稀释的免疫小鼠血清和hmpv病毒(genbank: mn745087.1)的混合物加入llc-mk2细胞，培养7d后检测病毒拷贝数。结果可见含有佐剂的hmpv vlp肌肉注射免疫小鼠的血清在1：80稀释度时对病毒中和效率可达73.86％，而不含
佐剂的vlp免疫组血清对病毒中和效率为35.75％，佐剂对照组血清对病毒中和效率为6.1％，表明hmpv vlp肌肉注射免疫小鼠可以产生血清中和抗体。
91.2.2细胞免疫水平
92.对于记忆性b淋巴细胞进行检测，含有佐剂的hmpv vlp肌肉注射免疫组ifn-γ斑点数高于不含有佐剂的hmpv vlp免疫组和佐剂对照组，p值分别为p《0.05和p＝0.01；含有佐剂的hmpv vlp免疫组il-4斑点数高于不含有佐剂的hmpv vlp免疫组和佐剂对照组， p值为p≤0.01，结果如图9所示。结果表明，hmpv vlp肌肉注射免疫小鼠可诱导细胞免疫应答，并且氢氧化铝佐剂可增强细胞免疫水平。
93.实施例三hmpv攻毒及vlp免疫保护作用检测
94.在小鼠免疫第三次后第28天，采用hmpv(genbank:mn745087.1)通过鼻腔粘膜进行攻毒，然后进行如下检测：
95.(1)临床观察及生存分析：监测攻毒0-14天小鼠存活率，精神状态和体重变化。
96.(2)肺部病毒载量检测：hmpv攻毒5天后，每组取3只小鼠，无菌取肺，用dmem 匀浆后提取核酸，使用荧光定量pcr检测hmpv病毒载量。
97.(3)he染色进行肺病理检测：攻毒5天后收集肺组织，he染色进行肺病理检测，进行肺嗜酸性粒细胞分析。通过对肺脏小气管周围炎性细胞数、肺泡腔内炎性细胞数和肺间质炎性细胞数和厚度分析，评估肺组织病理学情况。
98.(4)肺免疫组织化学检测：hmpv攻毒5天后，将肺组织取出，用多聚甲醛固定，进行基于免疫酶标技术的免疫组织化学分析，以判断hmpv对肺组织的感染情况。免疫组化阳性率一般依据阳性细胞百分比和阳性强度两个方面。累积光密度值是所有阳性信号光密度的积分，除以待测区域组织面积可反映阳性多少和深浅，与阳性率成正比，分析每组的平均光密度。
99.结果：
100.(1)临床表现观察及生存分析：hmpv vlp实验组和佐剂对照组小鼠均存活，存活率为100％。病毒攻击后小鼠体重从第3天开始出现下降趋势，在攻毒第4天所有小鼠的体重开始逐步上升，在第14天恢复至攻毒前体重，如图10所示。
101.肺病毒载量检测
102.(2)肺病毒载量检测：通过检测肺组织病毒载量，判断免疫组小鼠肺内病毒复制是否受到抑制。结果显示在病毒感染第5天，与佐剂对照组相比，含有和不含有佐剂的hmpv vlp 免疫组的病毒载量明显降低(如图11所示)，并且含有氢氧化铝佐剂的hmpv vlp免疫组的病毒载量低于不含佐剂的vlp免疫组，表明hmpv vlp免疫后产生了保护作用。
103.(3)he染色进行肺病理检测：攻毒5天后收集肺组织，通过对肺脏小气管周围炎性细胞数、肺泡腔内炎性细胞数和肺间质炎性细胞数和肺泡壁厚度分析，评估肺组织病理学情况。样品各项炎细胞统计分值判定为：0-1个/20
×
视野评分为0；2≤/20
×
视野＜5评分为1，5≤/20
×
视野＜10个评分为2，10≤/20
×
视野＜20个评分为3，＞20
×
视野≥10个评分为4。
104.本发明中，不含佐剂和含佐剂的hmpv vlp肌肉注射免疫小鼠的肺部组织病理均值分别为5.6和5，佐剂对照组为8，表明hmpv vlp肌肉注射免疫小鼠产生的肺病理损伤比佐剂对照组较弱，结果见表2。
105.表2 hmpv攻毒vlp肌肉注射免疫小鼠的肺组织病理分析结果
[0106][0107]
(4)肺组织免疫组织化学检测：将肺组织用多聚甲醛固定后进行免疫组化分析，通过光密度值初步判断hmpv vlp免疫保护作用。由图12可以看出，含有佐剂的hmpv vlp免疫组小鼠肺组织的平均光密度低于不含佐剂的vlp组和佐剂对照组，p值分别为p＞0.05和p ＜0.05。表明hmpv攻毒后，含有佐剂的vlp肌肉注射免疫小鼠的肺组织中病毒含量减少，而佐剂对照组的病毒含量高于vlp实验组，可见hmpv vlp在hmpv攻毒后产生了免疫保护作用。
[0108]
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

技术特征：
1.一种人偏肺病毒病毒样颗粒，其特征在于，人偏肺病毒病毒样颗粒由流感病毒h2n2的m1蛋白和人偏肺病毒的f蛋白组装而成。2.根据权利要求1所述的人偏肺病毒病毒样颗粒，其特征在于，编码m1蛋白的核酸序列如seq id no:1所示，编码f蛋白的核酸序列如seq id no:2所示。3.一种如权利要求1或2所述的人偏肺病毒病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建重组质粒：将流感病毒h2n2的m1基因和人偏肺病毒的f基因序列克隆到pfastbacdual载体中，得到重组质粒pfastbacdual-m1-f；(2)转染：将重组质粒pfastbacdual-m1-f转染sf9昆虫细胞，获得重组sf9细胞；(3)分离纯化：培养重组sf9细胞，离心纯化得到人偏肺病毒病毒样颗粒vlp。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，采用贴壁培养的方式培养重组sf9细胞，制备vlp。5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，将重组sf9细胞进行多代扩大培养纯化；优选的，至少经过p1，p2，p3，p4代扩大培养；优选的，扩大培养纯化方法包括：(1)重组质粒转染sf9昆虫细胞后，72h后收获病变细胞上清，即为p1代重组杆状病毒；(2)将p1代重组杆状病毒加入处于对数生长期的sf9昆虫细胞，27℃培养72小时，连续传代重组杆状病毒至p4代，收获病变细胞上清和细胞；(3)收集p4代病变上清和细胞，经超离浓缩后进行蔗糖密度梯度超速离心，重悬于pbs，得到纯化的人偏肺病毒病毒样颗粒vlp。6.一种表达如权利要求1或2所述的人偏肺病毒病毒样颗粒的重组载体，其特征在于，以pfastbacdual为表达载体，插入流感病毒h2n2的m1基因和人偏肺病毒的f基因序列。7.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞中包含权利要求6所述的载体；优选的，所述重组细胞为包含权利要求6所述的载体的sf9昆虫细胞。8.一种如权利要求1或2所述的人偏肺病毒病毒样颗粒在制备预防和/或治疗人偏肺病毒药物中的应用；优选的，人偏肺病毒病毒样颗粒在制备人偏肺病毒疫苗中的应用。9.一种人偏肺病毒病毒疫苗，其特征在于，包含如权利要求1或2所述的人偏肺病毒病毒样颗粒。10.根据权利要求9所述的人偏肺病毒病毒疫苗，其特征在于，还包括药物学上可接受的辅料；优选的，所述辅料包括佐剂；优选的，所述的人偏肺病毒病毒疫苗包括人偏肺病毒病毒样颗粒和氢氧化铝佐剂。

技术总结
本发明公开了一种人偏肺病毒病毒样颗粒、制备方法、应用及疫苗。人偏肺病毒病毒样颗粒由流感病毒H2N2的M1蛋白和人偏肺病毒的F蛋白组装而成，编码M1蛋白的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码F蛋白的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。制备方法包括(1)构建重组质粒：将流感病毒H2N2的M1基因和人偏肺病毒的F基因序列克隆到pFastBacDual载体中，得到重组质粒pFastBacDual-M1-F；(2)转染：将重组质粒pFastbacdual-M1-F转染sf9昆虫细胞，获得重组sf9细胞；(3)分离纯化：培养重组sf9细胞，离心纯化得到人偏肺病毒病毒样颗粒VLP。本发明采用杆状病毒昆虫细胞表达系统制备了基于HMPV F蛋白和流感病毒M1蛋白的病毒样颗粒，具有免疫原性和优良的免疫保护作用，为HMPV疫苗特别是VLP疫苗的研发提供理论数据和奠定基础。是VLP疫苗的研发提供理论数据和奠定基础。是VLP疫苗的研发提供理论数据和奠定基础。


技术研发人员：麻粉莲 郑丽舒 陈爱珺 姚立红
受保护的技术使用者：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所
技术研发日：2022.01.29
技术公布日：2023/8/8