治疗慢性关节疾病和/或运动器官再生修复的药物的制作方法

1.本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及治疗慢性关节疾病和/或运动器官再生修复的药物。


背景技术：

2.由于慢性炎症、外力创伤、衰老等因素造成的运动器官损伤，如关节炎症、创伤性骨缺损、软组织系统损伤、以及因此而导致的系统性损伤和运动困难，对病人的日常生活及社会活动都造成很大困扰，严重情况下会造成多种并发症和二次损伤，甚至对病人生命造成威胁。随着人口老龄化的加剧，关节炎已成为最主要的致残疾病，全球范围内患有关节疾病的人数已超过5亿人，占总人口数量超过10％。目前对于慢性关节疾病和运动系统组织器官损伤再生修复的临床治疗主要局限于病人自身康复物理治疗方法以及部分针对表征的化学药物治疗，少量的新型小分子治疗药物和蛋白核酸药物处于临床研究阶段。
3.慢性炎症、外力创伤、衰老等因素造成的关节组织及其他运动器官损伤，依靠手术和物理性康复治疗方式难以在短期内达到理想的治疗效果，会导致损伤时间过长进而难以治愈，同时由于缺乏针对病因的靶向药物精准治疗，损伤的运动器官和慢性炎性组织难以进行直接的再生修复，只能够达到部分程度的缓解。药物治疗目前多为消炎止痛型药物和少量调节机体免疫类中药制剂，仍缺乏针对慢性关节疾病组织特异性的药物，对损伤组织的炎症清除和新生组织再生修复缺乏针对性的疗效。


技术实现要素：

4.本发明的主要目的是提供kank4基因或其mrna、osr2基因或其mrna、ngef基因或其mrna中的至少一者作为治疗慢性关节疾病和/或运动器官再生修复的药物干预靶点的应用，旨在开发治疗慢性关节疾病和/或运动器官再生修复的靶点药物。
5.为实现上述目的，本发明提出kank4基因或其mrna、osr2基因或其mrna、ngef基因或其mrna中的至少一者作为治疗慢性关节疾病和/或运动器官再生修复的药物干预靶点的应用。
6.可选地，所述药物通过过表达所述kank4和/或osr2和/或ngef基因发挥作用。
7.可选地，所述核酸药物包括所述kank4和/或osr2和/或ngef基因的开放阅读框碱基序列、全长碱基序列和/或mrna序列。
8.本技术还提供一种治疗慢性关节疾病和/或运动器官再生修复的蛋白药物，所述蛋白药物包括由kank4和/或osr2和/或ngef基因表达的kank4和/或osr2和/或ngef蛋白，或其多肽片段。
9.本技术还提供一种治疗慢性关节疾病和/或运动器官再生修复的细胞药物，所述细胞药物中含有过表达的kank4和/或osr2和/或ngef基因。
10.可选地，所述慢性关节疾病和/或运动器官再生修复包括：脊椎动物的慢性关节疾病和/或运动器官再生修复；
11.所述脊椎动物包括：人、猴、猪、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠。
12.可选地，所述慢性关节疾病和/或运动器官再生修复包括：骨关节炎、骨质疏松性骨关节炎、滑膜炎、关节软骨损伤、关节创伤、骨缺损、骨组织再生、软骨组织再生、肌肉软组织再生、肌腱软组织再生中的任一种或多种。
13.可选地，所述骨关节炎包括：髋关节炎、膝关节炎、指关节炎中的任一种或多种。
14.本发明技术方案通过采用kank4基因或其mrna、osr2基因或其mrna、ngef基因或其mrna中的至少一者作为治疗慢性关节疾病和/或运动器官再生修复的药物干预靶点，旨在开发治疗慢性关节疾病和/或运动器官再生修复的靶点药物，针对慢性关节疾病、损伤组织的炎症清除和新生组织再生修复进行针对性的治疗。
附图说明
15.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
16.图1(a)为样本间差异基因的火山图分析；
17.图1(b)为样本差异基因的相关性聚类分析；
18.图1(c)为样本差异基因涉及的富集指数分析；
19.图2为分别过表达kank4，osr2，ngef的msc细胞中促成骨和成软骨分化相关基因col2a1，rux2，spp1，col10的表达情况结果图；
20.图3为过表达osr2的msc细胞中成骨和成软骨相关信号通路关键基因sppr，col10，nfkb，col2，erk，runx2的免疫荧光检测结果图；
21.图4为分别过表达kank4，osr2，ngef的msc细胞对于骨-软骨组织再生和损伤修复相关信号通路关键蛋白p-nfkb，mtor，p-raf，col2，col10，ppten，runx2的western blot检测结果图；
22.图5为kank4、osr2、ngef过表达治疗后关节组织损伤修复movat染色结果图；
23.图6为msc细胞分别过表达kank4、osr2、ngef基因之后进行体外成软骨诱导分化结果图；
24.图7为分别过表达了kank4、osr2的msc细胞移植到损伤的骨骼周围软组织后的masson染色结果图。
25.本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
26.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
27.下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明
具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
28.实施例1
29.收集慢性关节疾病和骨骼肌肉系统运动损伤的病人治疗前和治疗修复后的关节骨组织细胞分别作为实验组，对照组为正常的健康个体关节骨组织细胞，样本分别进行高通量测序，测序后比较各组细胞的基因表达差异，分别进行样本间差异基因的火山图分析、样本间差异基因的go富集分析、样本差异基因的相关性聚类分析、样本差异基因涉及的主要生物学过程富集分析、样本差异基因主要的调节信号网络相关性分析。
30.其中，样本间差异基因的火山图分析如图1(a)所示，经计算后以log2(fold change)绝对值大于1为基本标准线，选取在该区间内p值小于0.05的基因群为具有显著性差异的基因，其中log2(fold change)大于1的为上调表达显著差异基因，log2(fold change)小于-1的为下调表达显著差异基因，图1a中每一个点代表一个基因，kank4，osr2，ngef均为上调表达显著性差异基因。样本差异基因的相关性聚类分析如图1(b)所示，根据表达谱的差异分析出表达量的聚集基因簇，依据上调表达值的高低排序，kank4，osr2，ngef为在治疗后显著上调表达的基因。样本差异基因涉及的富集指数分析如图1(c)所示，包含了kank4，osr2，ngef的差异基因所涉及的不同生物学过程go富集分析，均显示出典型的富集峰值，表明kank4，osr2，ngef基因在相关生物学过程中具有显著生物学功能。
31.最后筛选出在治疗前实验组细胞中降低表达水平，治疗修复后实验组细胞中显著表达上调的基因kank4、osr2、ngef。该三个基因可以作为与慢性关节疾病和/或运动系统再生修复相关的靶点基因，通过在慢性关节疾病和运动系统损伤患者中提高这三个基因的表达或激活这三个基因表达得到的mrna或蛋白质的活性，可以实现治疗慢性关节疾病和运动系统损伤的目的。
32.人源基因kank4的dna序列在ncbi上的登录号和长度为kank4:(ncbi reference sequence:nc_000001.11,83270bp)，kank4基因的mrna转录本包括(ncbi reference sequence:nm_181712.5,5499bp)和(ncbi reference sequence:nm_001320269.2,3615b)所示的两个mrna转录本异构体，kank4的的mrna转录本异构体对应表达的kank4蛋白的氨基酸序列分别为seq id no.1和seq id no.2。
33.人源基因osr2的dna序列在ncbi上的登录号和长度为osr2:(ncbi reference sequence:nc_000008.11,7659bp)，osr2基因的mrna转录本包括(ncbi reference sequence:nm_001142462.3,1834bp)、(ncbi reference sequence:nm_053001.4,1752b)、(ncbi reference sequence:nm_001286841.2,2083bp)和(ncbi reference sequence:nm_001394683.1,1563bp)所示的四个mrna转录本异构体，osr2的四个mrna转录本异构体对应表达的osr2蛋白的氨基酸序列分别为seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5和seq id no.6。
34.人源基因ngef的dna序列在ncbi上的登录号和长度为ngef:(ncbi reference sequence:nc_000002.12,134571bp)，ngef基因的mrna转录本包括(ncbi reference sequence:nm_019850.3,3184bp)和(ncbi reference sequence:nm_001114090.2,2797bp)所示的两个mrna转录本异构体，ngef基因的两个mrna转录本异构体对应表达的ngef蛋白的氨基酸序列分别为seq id no.7和seq id no.8。
35.实施例2人骨髓间充质干细胞中分别过表达靶点基因kank4，osr2，ngef后，成软骨诱导分化能力显著提高
36.通过构建分别过表达kank4基因，osr2基因，ngef基因的带有红色荧光标签的慢病毒载体，转染病毒包装细胞之后分别获得过表达kank4，osr2，ngef基因的病毒液。
37.详细实验过程：根据kank4，osr2，ngef的基因序列orf开放阅读框定制商品化的慢病毒过表达载体(自带红色荧光表达序列)lenti-kank4、lenti-osr2、lenti-ngef；表达载体质粒与包装质粒mpd2g和pspax2按照3:2:1的比例加入一管2.5ml的dmem培养液中混合均匀，同时将5ul的lipo3000脂质体加入另一管2.5ml的dmem培养液中，充分混匀后，将两管培养液混合均匀，形成5ml含有lipo3000脂质体和三个质粒的包装表达系统，室温静置10分钟；将5ml脂质体和质粒混合液加入到六孔板的293t细胞中(细胞密度为60-70％)完成细胞转染和病毒包装，转染2.5小时后，更换不含抗生素的新鲜细胞培养液，分别于48小时和72小时收取病毒，加入到待感染的细胞中(如骨髓间充质干细胞)，完成过表达感染；72小时后更换含有1μg/ml puromycin的培养液进行筛选并获得感染后阳性表达的目标细胞。
38.使用病毒液感染人msc细胞后，采用细胞分化培养液进行促细胞软骨分化培养，2周后收集细胞提取细胞rna和蛋白，针对其他促进成骨和成软骨以及周围组织修复相关的关键基因和蛋白表达做检测，结果如图1至图3所示。图2为分别过表达kank4，osr2，ngef的msc细胞中促成骨和成软骨分化相关基因col2a1，rux2，spp1，col10的表达情况，促成骨和成软骨分化相关的标记基因表达水平显著上升。图3为过表达osr2的msc细胞中成骨和成软骨相关信号通路关键基因sppr，col10，nfkb，col2，erk，runx2的免疫荧光检测结果。图4为分别过表达kank4，osr2，ngef的msc细胞对于骨-软骨组织再生和损伤修复相关信号通路关键蛋白p-nfkb，mtor，p-raf，col2，col10，ppten，runx2的western blot检测结果，骨-软骨组织再生和损伤修复相关信号基因表达水平显著上升。
39.实施例3动物实验验证，kank4、osr2、ngef过表达治疗后关节组织损伤修复能力
40.通过构建分别过表达kank4，osr2，ngef的带有红色荧光标签的慢病毒载体，转染病毒包装细胞之后获得过表达kank4，osr2，ngef基因的病毒液。将病毒液用生理盐水稀释后注射进入关节损伤模型的大鼠的关节组织损伤部位，多点注射，治疗6周后获取大鼠关节及周围组织，福尔马林固定后脱钙制作石蜡包埋切片，通过movat染色观察损伤部位组织修复情况，movat结果如图5所示。与对照组相比关节区域软骨和骨组织损伤部位修复良好，染色可见典型的软骨组织、骨组织及周围组织新生区域。
41.实施例4骨组织及软组织损伤后再生修复
42.骨组织来源的msc细胞通过慢病毒感染分别过表达kank4、osr2、ngef基因之后进行体外成软骨诱导分化，培养3周后2型胶原表达量显著升高，结果如图6所示，分别过表达kank4、osr2、ngef基因之后的msc细胞为棕色阳性染色，对照组都是蓝色和非常淡的背景颜色，没有典型的棕色染色。将分别过表达了kank4、osr2的msc细胞移植到损伤的骨骼周围软组织后，1周内形成典型的软组织结构，masson染色如图7所示，显示出典型的纤维样软组织染色结构。
43.以上所述仅为本发明的可选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

技术特征：
1.kank4基因或其mrna、osr2基因或其mrna、ngef基因或其mrna中的至少一者作为治疗慢性关节疾病和/或运动器官再生修复的药物干预靶点的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物通过过表达所述kank4和/或osr2和/或ngef基因发挥作用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物包括所述kank4和/或osr2和/或ngef基因的开放阅读框碱基序列、全长碱基序列和/或mrna序列。4.一种治疗慢性关节疾病和/或运动器官再生修复的蛋白药物，其特征在于，所述蛋白药物包括由kank4和/或osr2和/或ngef基因表达的kank4和/或osr2和/或ngef蛋白，或其多肽片段。5.一种治疗慢性关节疾病和/或运动器官再生修复的细胞药物，其特征在于，所述细胞药物中含有过表达的kank4基因和/或osr2基因和/或ngef基因。6.如权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，所述慢性关节疾病及运动器官再生修复包括：脊椎动物的慢性关节疾病和/或运动器官再生修复；所述脊椎动物包括：人、猴、猪、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述慢性关节疾病和/或运动器官再生修复包括：骨关节炎、骨质疏松性骨关节炎、滑膜炎、关节软骨损伤、关节创伤、骨缺损、骨组织再生、软骨组织再生、肌肉软组织再生、肌腱软组织再生中的任一种或多种。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述骨关节炎包括：髋关节炎、膝关节炎、指关节炎中的任一种或多种。

技术总结
本发明提供作为治疗慢性关节疾病和/或运动器官再生修复的药物，通过采用KANK4和/或OSR2和/或NGEF基因作为治疗慢性关节疾病和/或运动器官再生修复的药物干预靶点，旨在开发治疗慢性关节疾病和/或运动器官再生修复的靶点药物，针对慢性关节疾病、损伤组织的炎症清除和新生组织再生修复进行针对性的治疗。除和新生组织再生修复进行针对性的治疗。除和新生组织再生修复进行针对性的治疗。


技术研发人员：于奎
受保护的技术使用者：广东明珠生物技术有限公司
技术研发日：2022.01.28
技术公布日：2023/8/8