一种聚酮类化合物及其制备方法和应用

1.本发明涉及微生物医药技术、天然药物化学领域，具体的说是一种从真菌亚细亚镰刀菌(fusarium asiaticum)的发酵产物中得到聚酮类化合物及其分离纯化制备方法和在抗水产病害菌中的应用。


背景技术：

2.具有氢化萘环骨架结构的镰刀菌素聚酮类化合物是一类主要由镰刀菌属真菌产生的具有生物活性的化合物，其结构中含有一个氢化萘环和一个三元氧环，根据文献调研，并未报道其对水产病害菌活性的研究。
3.亚细亚镰刀菌(fusarium asiaticum)已有文献记载，可从小麦(周永进等，江苏农业学报，2012，5，979-985)和玉米(a.kawakami et al,journal of general plant pathology,2015,81(4),324-327)中分离得到。但目前为止对亚细亚镰刀菌(fusarium asiaticum)次级代谢产物的系统研究报道较少，本发明首次从该菌中分离得到具有抗水产病害菌活性的聚酮类化合物。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种从真菌亚细亚镰刀菌(fusarium asiaticum)的发酵产物中获得聚酮类化合物及其分离纯化方法和在抗水产病害菌中的应用。
5.为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
6.一种聚酮类化合物，聚酮类化合物为式i所示的化合物1或化合物2，其中，化合物1分子式为c
29h46
o4和化合物2分子式为c
27h38
o5；
[0007][0008]
一种聚酮类化合物的制备方法：
[0009]
1)将真菌亚细亚镰刀菌(fusarium asiaticum)于大米固体培养基中发酵，发酵产物经乙酸乙酯反复浸泡萃取，合并萃取液进行浓缩，获得发酵粗提物；
[0010]
2)粗提物进行减压硅胶柱层析，并用梯度为20:1至1:1(v/v)的石油醚-乙酸乙酯和梯度为20:1至1:1(v/v)二氯甲烷-甲醇作为溶剂依次进行梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯2:1洗脱得到的组分，进行rp-18反相硅胶柱层析，以10:90至100:0的甲醇-水洗脱；
[0011]
3)收集上述步骤2)甲醇-水70:30的组分，进行正相硅胶柱层析，以200:1至60:1的二氯甲烷-甲醇洗脱，收集二氯甲烷-甲醇100:1的组分，再用制备tlc(展开剂为石油醚：乙酸乙酯：乙酸＝20：10：0.2)分离纯化，得到纯化目标化合物1；
[0012]
4)收集上述步骤2)甲醇-水60:40的组分，进行正相硅胶柱层析，以80:1至10:1的二氯甲烷-甲醇洗脱，收集二氯甲烷-甲醇30:1的组分，再依次用制备tlc(展开剂为二氯甲烷：丙酮＝10：1)和凝胶lh-20(甲醇)纯化，得到纯化目标化合物2；
[0013]
进一步的说：
[0014]
1)取生长于平板培养基中的真菌亚细亚镰刀菌fusarium asiaticum(大小2.5厘米
×
2.5厘米)接种于已灭过菌的固体培养基中室温静置培养30天，发酵产物使用乙酸乙酯反复浸泡萃取，合并萃取液进行浓缩，浓缩获得发酵粗提物；
[0015]
所述亚细亚镰刀菌(fusarium asiaticum)生长特征为马铃薯蔗糖琼脂(pda)培养基上长有白色气生菌丝，后期菌膜变为粉红色；该菌株在多篇文献中报道，并且可在多个保藏中心通过流通方式获得，比如中国林业微生物菌种保藏管理中心(china forestry culture collection center,cfcc，保藏编号为cfcc 51349)和中国农业微生物菌种保藏管理中心(agricultural culture collection of china,accc,保藏编号为accc 39255)。另外，本领域的技术人员可根据文献公开报道的方法方便地从小麦(周永进等，江苏农业学报，2012，5，979-985)和玉米(a.kawakami et al,journal of general plant pathology,2015,81(4),324-327)中分离获得，并可方便地获得菌株its在基因库中的登记信息，例如，ncbi(mk791240.1)、ncbi(om100564.1)等等。
[0016]
2)对发酵产物的粗提物进行减压硅胶柱层析，并用梯度为20:1至1:1(v/v)的石油醚-乙酸乙酯和梯度为20:1至1:1(v/v)二氯甲烷-甲醇作为溶剂依次进行梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯2:1洗脱得到的组分，进行rp-18反相硅胶柱层析，以10:90至100:0的甲醇-水洗脱；
[0017]
3)收集上述步骤2)甲醇-水70:30的组分，进行正相硅胶柱层析，以200:1至60:1的二氯甲烷-甲醇洗脱，收集二氯甲烷-甲醇100:1的组分，再用制备tlc(展开剂为石油醚：乙酸乙酯：乙酸＝20：10：0.2)分离纯化，得到纯化目标化合物1；
[0018]
4)收集上述步骤2)甲醇-水60:40的组分，进行正相硅胶柱层析，以80:1至10:1的二氯甲烷-甲醇洗脱，收集二氯甲烷-甲醇30:1的组分，再依次用制备tlc(展开剂为二氯甲烷：丙酮＝10：1)和凝胶lh-20(甲醇)纯化，得到纯化目标化合物2。
[0019]
所述大米固体培养基配方为：每100毫升蒸馏水中含大米70克，玉米浆0.2克，蛋白胨0.3克。
[0020]
一种聚酮类化合物的应用，所述式i中所示聚酮类化合物在抗水产病害菌中的应用。
[0021]
所述式i中所示聚酮类化合物在制备新型水产病害菌防治药物中的应用。
[0022]
所述水产病害菌为嗜水气单胞菌aeromonas hydrophila，鲇鱼爱德华氏菌edwardsiella ictarda，迟缓爱德华氏菌edwardsiella tarda，藤黄微球菌micrococcus luteus，铜绿假单胞菌pseudomonas aeruginosa，溶藻弧菌vibrio alginolyticus，哈氏弧菌v.harveyi，副溶血弧菌v.parahemolyticus或创伤弧菌vibrio vulnificus。
[0023]
本发明所具有的优点：
甲醇洗脱，收集二氯甲烷-甲醇30:1的组分，再依次用制备tlc(展开剂为二氯甲烷：丙酮＝10：1)和凝胶lh-20(甲醇)纯化，得到纯化目标化合物2；其结构鉴定为如式i所示，
[0036][0037]
两个化合物具有以下理化和波谱特性：
[0038]
化合物1：无色晶体，mp 135
–
137℃；(c 0.49,meoh)；uv(meoh)λ
max
(logε)242(3.36)nm；ecd(0.49mm,meoh)λ
max
(δε)240(
–
5.58)nm；核磁共振氢谱和碳谱如表i；高分辨ei质谱m/z 458.3392[m]
+
，c
29h46
o4计算值为458.3396。
[0039]
化合物2：白色无定形粉末，(c 0.21,meoh)；uv(meoh)λ
max
(logε)242(3.39)nm；ecd(0.79mm,meoh)λ
max
(δε)213(
–
4.99),246(
–
2.08)nm；核磁共振氢谱和碳谱如表i；高分辨esi质谱m/z 441.2635[m
–
h]
–
，c
27h37
o5计算值为441.2646。
[0040]
表i化合物1和2的核磁共振氢谱(500mhz)和碳谱(125mhz)数据(溶剂dmso-d6)
[0041][0042]
实施例2.水产病害菌抑制剂活性。
[0043]
用最小抑菌浓度法检测式i所示化合物1和2的抗水产病害菌活性。选择以下9株水产病原菌株：嗜水气单胞菌a.hydrophila，鲇鱼爱德华氏菌e.ictarda，迟缓爱德华氏菌e.tarda，藤黄微球菌m.luteus，铜绿假单胞菌p.aeruginosa，溶藻弧菌v.alginolyticus，哈氏弧菌v.harveyi，副溶血弧菌v.parahemolyticus或创伤弧菌v.vulnificu进行抗水产病害菌活性测试。
[0044]
1)抗菌活性测试(mic法)：
[0045]
最小抑菌浓度(mic)，即体外能够抑制细菌生长的最低药物浓度。在96微孔板中，
通过将不同浓度的药物加入到待测菌的菌悬液中，培养后观察，如果指示菌在某孔内生长，表示该孔的药物浓度不能抑制该菌的生长，该孔内液体浑浊，透光度明显下降。反之，该孔内液体澄清，透光度下降不显著。小孔内完全抑制指示菌生长的最低样品浓度为该化合物的mic。
[0046]
2)菌悬液的制备
[0047]
上述供试细菌分别接种于培养基(其中嗜水气单胞菌a.hydrophila，鲇鱼爱德华氏菌e.ictarda，藤黄微球菌m.luteus，哈氏弧菌v.harveyi，副溶血弧菌v.parahemolyticus用lb培养基；迟缓爱德华氏菌e.tarda，铜绿假单胞菌p.aeruginosa，溶藻弧菌v.alginolyticus和创伤弧菌v.vulnificus用tsb培养基)上于28℃培养24小时后，用移液枪吸取适量菌悬液于无菌试管中，然后用0.85％nacl溶液将菌悬液调至0.5麦氏浊度(相当于1.5
×
108cfu/ml)，并进一步用0.85％nacl溶液稀释至5
×
105cfu/ml。
[0048]
0.5麦氏浊度标准：
[0049]
将0.5ml 0.048mol/l的bacl2(1.175％w/v bacl2·
2h2o)加到99.5ml 0.18mol/l(0.36n)的h2so4(1％v/v)中并不断搅动以维持混悬状态。
[0050]
3)样品的配制
[0051]
分别取1mg左右待测样品(上述所得化合物1或化合物2)，溶解于100μl左右dmso中，充分混匀后，使其最终浓度为2560μg/ml，吸取50μl样品溶液到另一只离心管中，接着加入50μl dmso，得到浓度减半的样品溶液。按照此方法，总共得到11组浓度依次减半的样品溶液(2560、1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5μg/ml)。
[0052]
4)空白对照：选择溶解待测样品的纯溶剂(dmso)作为空白对照。
[0053]
5)mic测定流程
[0054]
5.1)采用无菌操作，将倍比稀释后不同浓度的样品溶液分别加到无菌的96孔板中，第1至第11孔加样品溶液，每孔5μl，第12孔不加样品作为生长对照。
[0055]
5.2)将相当于0.5麦氏比浊度的指示菌悬液，经液体培养基(其中嗜水气单胞菌a.hydrophila，鲇鱼爱德华氏菌e.ictarda，藤黄微球菌m.luteus，哈氏弧菌v.harveyi，副溶血弧菌v.parahemolyticus用lb培养基；迟缓爱德华氏菌e.tarda，铜绿假单胞菌p.aeruginosa，溶藻弧菌v.alginolyticus和创伤弧菌v.vulnificus用tsb培养基)稀释1000倍后，取95μl依次加入到96孔板中，使得第1至第11孔的样品终浓度依次为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。轻轻震荡混匀后，将96孔板密封置于28℃培养箱中，细菌培养24h。
[0056]
5.3)在600nm波长下使用酶标仪测定每孔的吸光值，以在小孔内完全抑制指示菌生长的最低样品浓度为该化合物的mic。(注意：当阴性对照孔内指示菌明显生长实验才有意义；当实验出现单一的跳孔时，应记录抑制菌株生长的最高药物浓度；如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复实验。)
[0057]
表ii化合物1的抗菌活性数据(mic,μg/ml)
[0058]
受试菌ahmlpavavhvpvv化合物14224411
[0059]
表ⅲ化合物2的抗菌活性数据(mic,μg/ml)
[0060]
受试菌ahmlpavpvv
化合物224442
[0061]
注：上述表ii、表ⅲ中ah:嗜水气单胞菌a.hydrophilia；ml:藤黄微球菌m.luteus；pa:铜绿假单胞菌p.aeruginosa；va:溶藻弧菌v.alginolyticus；vh:哈氏弧菌v.harveyi；vp:副溶血性弧菌v.parahaemolyticus；vv:创伤弧菌v.vulnificus。
[0062]
实验结果表明化合物1和2有较好且广谱的抗菌活性，如表ii、表ⅲ所示，在抗细菌活性实验中化合物1和2对嗜水气单胞菌(a.hydrophilia)，藤黄微球菌(m.luteus)，铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)，副溶血性弧菌(v.parahemolyticus)和创伤弧菌(v.vulnificus)具有较强的抑制活性，mic值为1
–
4μg/ml。化合物1还对溶藻弧菌(v.alginolyticus)和哈氏弧菌(v.harveyi)也具有较强的抑制活性，mic值钧为4μg/ml。
[0063]
上述实验结果证明本发明所涉及的化合物对水产病害菌具有较强的抑制作用，它们可用于制备新型水产病害菌防治药物。

技术特征：
1.一种聚酮类化合物，其特征在于：聚酮类化合物为式i所示的化合物1或化合物2，其中，化合物1分子式为c
29
h
46
o4和化合物2分子式为c
27
h
38
o5；2.一种权利要求1所述的聚酮类化合物的制备方法，其特征在于：1)将真菌亚细亚镰刀菌(fusarium asiaticum)于大米固体培养基中发酵，发酵产物经乙酸乙酯反复浸泡萃取，合并萃取液进行浓缩，获得发酵粗提物；2)粗提物进行减压硅胶柱层析，并用梯度为20:1至1:1(v/v)的石油醚-乙酸乙酯和梯度为20:1至1:1(v/v)二氯甲烷-甲醇作为溶剂依次进行梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯2:1洗脱得到的组分，进行rp-18反相硅胶柱层析，以10:90至100:0的甲醇-水洗脱；3)收集上述步骤2)甲醇-水70:30的组分，进行正相硅胶柱层析，以200:1至60:1的二氯甲烷-甲醇洗脱，收集二氯甲烷-甲醇100:1的组分，再用制备tlc(展开剂为石油醚：乙酸乙酯：乙酸＝20：10：0.2)分离纯化，得到纯化目标化合物1；4)收集上述步骤2)甲醇-水60:40的组分，进行正相硅胶柱层析，以80:1至10:1的二氯甲烷-甲醇洗脱，收集二氯甲烷-甲醇30:1的组分，再依次用制备tlc(展开剂为二氯甲烷：丙酮＝10：1)和凝胶lh-20(甲醇)纯化，得到纯化目标化合物2。3.按权利要求2所述的聚酮类化合物的制备方法，其特征在于：所述大米固体培养基配方为：每100毫升蒸馏水中含大米70克，玉米浆0.2克，蛋白胨0.3克。4.一种权利要求1所述的聚酮类化合物的应用，其特征在于：所述式i中所示聚酮类化合物在抑制水产病害菌中的应用。5.按权利要求4所述的聚酮类化合物的应用，其特征在于：所述式i中所示聚酮类化合物在制备水产病害菌防治药物中的应用。6.按权利要求4或5所述的聚酮类化合物的应用，其特征在于：所述水产病害菌为嗜水气单胞菌aeromonas hydrophila，鲇鱼爱德华氏菌edwardsiella ictarda，迟缓爱德华氏菌edwardsiella tarda，藤黄微球菌micrococcusluteus，铜绿假单胞菌pseudomonas aeruginosa，溶藻弧菌vibrio alginolyticus，哈氏弧菌v.harveyi，副溶血弧菌v.parahemolyticus或创伤弧菌v.vulnificus。

技术总结
本发明涉及微生物医药技术、天然药物化学领域，具体的说是一种从真菌亚细亚镰刀菌(Fusarium asiaticum)的发酵产物中得到聚酮类化合物及其分离纯化方法和在抗水产病害菌活性方面的应用。所述聚酮类化合物的分子式分别为C


技术研发人员：王斌贵 石小杉 李晓明
受保护的技术使用者：中国科学院海洋研究所
技术研发日：2022.01.27
技术公布日：2023/8/8