一种包括外泌体在内的细胞外囊泡连续浓缩纯化提取系统及方法

1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种包括外泌体在内的细胞外囊泡连续浓缩纯化提取系统及方法。


背景技术：

2.细胞外囊泡(extracellular vesicles,evs)是指从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，其内包含了许多不同种类的生物活性分子，如蛋白质、dna、rna、脂质、代谢物等。细胞外囊泡常根据其大小和释放途径分为：外泌体(exosomes)，直径约为30-150nm，起源于内吞途径；微囊泡(microvesicles)，质膜出芽释放，直径约100-1000nm；和凋亡小体(apoptotic body)，直径约1-5μm，由凋亡细胞产生。国际细胞外囊泡学会发表指南性文件将提取的《200nm的细胞外囊泡称为小细胞外囊泡(small extracellular vesicles,sevs)。几乎所有细胞都可以产生细胞外囊泡，也可由培养的细胞如间充质干/基质细胞(mesenchymal stem/stromal cells，mscs)、293t/f细胞、肿瘤细胞等获取。细胞外囊泡也存在于多种组织、体液或植物中，如血液、尿液、牛奶中等。mscs是一类来源于中胚层具有多向分化潜能的基质细胞，免疫原性低且具有免疫调控功能，在基因治疗和细胞替代治疗、免疫性疾病方面有着广泛的临床应用前景。研究认为，间充质干细胞分泌的外囊泡可以保留亲代细胞的治疗特性而且又具有更低的免疫原性及较高的组织相容性，而且可以储存使用属于即用型，因此较细胞有更强的应用优势。
3.目前，超速离心法作为金标准，是普遍接受的一种用于分离提取细胞外囊泡或外泌体的方法，其提取纯度高，然而存在操作复杂、耗时长、回收率低、只能应用于较小量样品及细胞外囊泡结构容易受损等问题，原因在于细胞外囊泡或外泌体质量很小，需要100000g或以上离心才能沉淀，而稍有震动，即会重悬于液体之中，对操作者的技术要求极高。除超速离心法外，目前应用比较广泛的方法还有尺寸排阻色谱法、单次切向流过滤法、阴离子吸附法、免疫磁珠法、聚合物沉淀法，又或者多种技术进行组合，其中，尺寸排阻色谱法通过特定树脂对不同大小的分子进行分离从而分离细胞外囊泡，但样本处理量极低；单次切向流过滤法通过滤膜以切向对液体进行超滤浓缩，其缺点是纯度较低；阴离子吸附法使用特定树脂对细胞外囊泡表面电荷进行吸附，然后通过高盐洗脱下来，缺点是处理过程较复杂，技术要求高；免疫磁珠法是通过带有抗体的磁珠对细胞外囊泡表面蛋白进行吸附，其缺点是样品处理量极低，价钱昂贵；聚合物沉淀法是一种往待提取的液体中加入特定聚合物使细胞外囊泡溶解度降低从而更好沉淀的方法，这种方法的缺点是会和聚合物沉淀难以分离。而多种技术进行组合，如切向流提取法结合超速离心法或切向流提取法结合离子交换法等，也存在各自的缺点，如仪器回收率低、纯度低、需要多台仪器共同操作、需要大量人工操作等，成为细胞外囊泡进入临床应用的障碍。
4.目前，虽然研发出了可以通过连续渗滤方式对物质如蛋白质、病毒或病毒载体等进行浓缩和清洗的系统，但由于这一系统本身设计并非应用于细胞外囊泡，而细胞外囊泡
的分离纯化操作又相对复杂和麻烦，无法仅使用一台设备就能直接得到纯化的细胞外囊泡成品。目前用于提取外泌体的技术要么只使用单台仪器对细胞外囊泡进行单纯的浓缩但没有纯化功能，要么需要使用多台仪器联合以完成浓缩、纯化、除菌等步骤。而且上述这一系列仪器原始设计是对蛋白质、病毒或病毒载体等进行浓缩和清洗的，并不用于细胞外囊泡的分离纯化。因此，若将其改造为用于分离纯化细胞外囊泡时，需要重新设计方案、并对参数等进行大量修改及调试。如果能仅使用一种方法或一台设备即可完成大规模细胞外囊泡的分离纯化，则意义重大。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种包括外泌体在内的细胞外囊泡连续浓缩纯化提取系统及方法，本发明提供的系统可用于细胞外囊泡大规模分离纯化，可提取高纯度的细胞外囊泡，操作简单，提取过程可实现自动化控制，提取效率高。
6.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
7.第一方面，本发明提供的一种包括外泌体在内的细胞外囊泡连续浓缩纯化提取系统，包括原液罐、初级过滤装置、中间产物容器、浓缩纯化装置、第一电控三通阀、第二电控三通阀、控制器、第一恒流泵、第二恒流泵、第三恒流泵、缓冲液容器、过滤除菌装置和终产物容器，其中，所述原液罐、第一恒流泵及初级过滤装置依次连接，所述初级过滤装置的滤出口通过管道与所述中间产物容器的入口连接，所述中间产物容器、第二恒流泵、浓缩纯化装置、第一电控三通阀和第二电控三通阀依次连接成循环浓缩纯化回路，所述中间产物容器的空气入口通过管道依次连接有电控阀和空气过滤器，所述中间产物容器的出口通过管道和第二恒流泵与所述浓缩纯化装置的入口连接，所述浓缩纯化装置的滤出口通过管道连接有废液容器，所述缓冲液容器、第三恒流泵及第一电控三通阀通过管道依次连接，所述第二电控三通阀、过滤除菌装置和终产物容器通过管道依次连接；所述第一恒流泵、第二恒流泵、第三恒流泵、第一电控三通阀、第二电控三通阀及电控阀分别与所述控制器电性连接。
8.现有用于细胞外囊泡分离纯化的系统存在操作复杂、上样量小、重复性差、纯度低、不能大规模制备等问题。与现有技术相比，本发明提供的细胞外囊泡连续浓缩纯化提取系统可用于对含有细胞外囊泡的液体进行过滤、浓缩和纯化，以获得高纯度的细胞外囊泡提取物；可实现大量样品的高纯度提取，操作简单，提取过程可实现自动化控制，提取效率高。
9.在本发明中，启动第一恒流泵，使含有细胞外囊泡的液体从原液罐泵入初级过滤装置进行过滤，并进一步将过滤后排出的滤出液泵入中间产物容器内；
10.切换第一电控三通阀和第二电控三通阀，启动第二恒流泵，使循环浓缩纯化回路导通，利用循环浓缩纯化回路对中间产物容器内的滤出液进行循环浓缩，在循环浓缩过程中，分离出的废液从浓缩纯化装置的滤出口持续排出，滤余液保留在所述循环浓缩纯化回路中；
11.当所述中间产物容器内的滤余液体积减少至所需体积时，切换第二电控三通阀，启动第三恒流泵启动，将缓冲液容器内的缓冲液持续泵入所述循环浓缩纯化回路中，利用所述循环浓缩纯化回路对循环浓缩后保留的滤余液进行连续清洗纯化；在连续清洗纯化过程中，分离出的废液从浓缩纯化装置的滤出口排出，滤余液保留在所述循环浓缩纯化回路
中；连续清洗纯化完成后，关闭所述第三恒流泵；
12.切换第一电控三通阀和第二电控三通阀，打开电控阀，使洁净的空气通入所述中间产物容器，将中间产物容器内的液体压入所述过滤除菌装置内进行过滤除菌，进而获得终产品。
13.作为本发明的优选实施方式，所述原液罐、第一恒流泵及初级过滤装置依次连接成循环过滤回路，以便对所述原液罐内含有细胞外囊泡的液体进行循环过滤。
14.作为本发明的优选实施方式，所述初级过滤装置包括至少一个囊式死端过滤器，所述囊式死端过滤器具有单层滤膜或双层滤膜，所述滤膜的孔径为0.15～1.0μm。
15.进一步的，所述初级过滤装置为一个囊式死端过滤器，所述囊式死端过滤器的滤膜孔径为0.15～0.22μm。
16.进一步的，所述初级过滤装置由至少两个具有不同滤膜孔径的囊式死端过滤器串联而成。
17.更进一步的，所述初级过滤装置由两个具有不同滤膜孔径的囊式死端过滤器串联而成，其中一个囊式死端过滤器的滤膜孔径优选为1.0μm，另一个囊式死端过滤器的滤膜孔径优选为0.22μm，滤膜孔径为1.0μm的囊式死端过滤器位于第一恒流泵与滤膜孔径为0.22μm的囊式死端过滤器之间。
18.作为本发明的优选实施方式，所述初级过滤装置包括至少一个切向流过滤器，所述切向流过滤器具有孔径为0.2～0.22μm的滤膜。
19.作为本发明的优选实施方式，所述浓缩纯化装置具有平板滤膜或中空纤维柱；所述浓缩纯化装置的截留分子量为50～750kd，优选为500～750kd。
20.本发明通过浓缩纯化装置对经过初级过滤装置的滤出液进行浓缩纯化，在50～750kd的截留分子量范围内，获得的细胞外囊泡提取液中细胞外囊泡粒径较小(小于200nm)，属于小细胞外囊泡，其中包括外泌体。
21.作为本发明的优选实施方式，所述第一电控三通阀与第二电控三通阀之间的管道上设置有蛋白浓度检测器，所述蛋白浓度检测器与所述控制器电性连接。本发明通过所述蛋白浓度检测器可以对流经的液体进行蛋白浓度检测，当检测到液体的蛋白浓度无明显变化时，关闭所述第三恒流泵，停止向所述循环浓缩纯化回路输入缓冲溶液。
22.作为本发明的优选实施方式，所述第一恒流泵与初级过滤装置入口之间的管道上设置有第一压力计，所述第一压力计用于与初级过滤装置连接的管道内液体的压力；所述第二恒流泵与浓缩纯化装置之间的管道上设置有第二压力计，所述第二压力计用于检测与所述浓缩纯化装置入口连接的管道内液体的压力；所述第一压力计和第二压力计分别与所述控制器电性连接。
23.作为本发明的优选实施方式，所述初级过滤装置与所述中间产物容器之间的管道上设置有第一流量计，所述浓缩纯化装置与所述废液容器之间的管道上设置有第二流量计，所述第一流量计和第二流量计分别与所述控制器电性连接。所述第一流量计用于检测泵入所述中间产物容器的液体流量，所述第二流量计用于检测从所述浓缩纯化装置滤出口滤出的废液的滤出流量。
24.作为本发明的优选实施方式，所述中间产物容器上设置有重量计，所述重量计与所述控制器连接；所述重量计用于检测所述中间产物容器的重量。
25.作为本发明的优选实施方式，所述初级过滤装置与中间产物容器之间的管道上设置有止回阀，所述止回阀与所述控制器电性连接。在循环过滤时，打开所述止回阀，防止液体倒流；循环过滤结束时，关闭所述止回阀。
26.作为本发明的优选实施方式，所述细胞外囊泡连续浓缩纯化提取系统还包括温度控制装置，所述温度控制装置与所述控制器电性连接。所述温度控制装置用于调控系统所处环境的温度。
27.第二方面，本发明提供的一种包括外泌体在内的细胞外囊泡连续浓缩纯化提取方法，通过第一方面所述的系统实施，包括如下步骤：
28.(1)启动所述第一恒流泵，将原液罐内含有细胞外囊泡的液体持续泵入所述初级过滤装置内进行过滤，将所述初级过滤装置输出的滤出液输入所述中间产物容器内；
29.(2)切换所述第一电控三通阀和第二电控三通阀，启动所述第二恒流泵，使所述循环浓缩纯化回路导通，利用所述循环浓缩纯化回路对步骤(1)所得的滤出液进行循环浓缩，滤出废液，保留滤余液；
30.(3)循环浓缩完成后，切换所述第二电控三通阀，启动所述第三恒流泵，使所述缓冲液容器内的缓冲液持续泵入所述循环浓缩纯化回路中，利用所述循环浓缩纯化回路对步骤(2)保留的滤余液进行连续清洗纯化，滤出废液，保留滤余液，连续清洗纯化完成后，关闭所述第三恒流泵；
31.(4)切换所述第一电控三通阀和第二电控三通阀，打开所述电控阀，使洁净的空气输入所述中间产物容器，将所述中间产物容器内的滤余液压入所述过滤除菌装置进行过滤除菌，获得细胞外囊泡提取液。
32.作为本发明的优选实施方式，所述中间产物容器内循环浓缩后的滤出液体积为步骤(1)输入中间产物容器3的滤出液体积的0.01～0.5倍。
33.作为本发明的优选实施方式，所述步骤(1)还包括：启动第一流量计，所述第一流量计检测泵入所述中间产物容器的液体流量q，并将检测到的液体流量q发送至所述控制器；所述控制器内储存有原液体积v0及循环过滤回路损失体积v1，当循环过滤时间为t时，根据下述公式计算流入所述中间产物容器的滤出液体积v：v＝q
×
t，当满足v＝v
0-v1时，所述控制器判定所述循环过滤完成，关闭所述第一恒流泵，从而停止向所述中间产物容器输入滤出液。
34.在步骤(1)之后还包括：启动所述重量计，通过所述重力计检测所述中间产物容器的重量m1，并将检测到的重量m1发送至所述控制器；所述控制器内储存有所述中间产物容器的初始重量m0，根据下述公式计算所述中间产物容器内的液体重量δm1：δm1＝m
1-m0，根据下述公式计算流入所述中间产物容器的液体的密度ρ，ρ＝δm1/v；
35.进行所述步骤(2)时，通过所述重量计检测所述中间产物容器的实时重量m2，并将检测到的重量m2发送至所述控制器，所述控制器预存有中间产物容器内液体的目标体积v
′
，根据下述公式计算所述中间产物容器内液体的实时重量δm2及实时体积v
t
：δm2＝m
2-m0，v
t
＝δm2/ρ，当满足v
t
＝v
′
时，所述控制器判定所述循环浓缩完成，关闭所述第一恒流泵及止回阀。
36.本发明通过第一流量计、重力计及控制器的配合，实现循环过滤及循环浓缩过程的智能控制，无需人工判断，效率高。
37.作为本发明的优选实施方式，所述步骤(3)中废液的滤出流量与缓冲液的输入流量之比为1：1。
38.作为本发明的优选实施方式，所述步骤(3)中缓冲液的泵入总体积为中间产物容器内的滤余液体积的1～100倍，进一步优选为5～50倍。
39.在连续清洗纯化过程中，相对于循环浓缩后保留的滤余液，同等时间内缓冲液泵入的交换体积较大，可加快纯化速度，结合具有特定截留分子量的浓缩纯化装置，使杂质和细胞外囊泡可以充分分离，同时降低细胞外囊泡在连续清洗纯化过程中的损失量。
40.作为本发明的优选实施方式，所述步骤(3)中缓冲液包括注射用水、灭菌注射用水、纯化水、蒸馏水、生理盐水、葡萄糖溶液及磷酸盐缓冲液中的至少一种。
41.作为本发明的优选实施方式，所述步骤(3)进行循环分离纯化时，对纯化回路中的液体进行蛋白浓度检测，并对检测到的蛋白浓度进行比对分析，若相邻两次检测的蛋白浓度之差在预设范围内，则判定连续清洗纯化完成。
42.作为本发明的优选实施方式，所述步骤(1)～(4)是在环境温度为2～8℃的条件下进行的。所述环境温度优选为4℃。
43.在所述终产物中细胞外囊泡的平均粒径为30～220nm。
44.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
45.本发明提供的系统可用于对含有细胞外囊泡的液体进行过滤、浓缩和纯化，可以获得高纯度的细胞外囊泡提取物，可实现大量样品的高纯度提取，操作简单，提取过程可实现自动化控制，提取中途无需人工干预，提取效率高；
46.利用本发明提供的系统对含有细胞外囊泡的液体进行过滤后，将过滤所得的滤出液浓缩至最小体积，向循环浓缩纯化回路中泵入缓冲液，以对浓缩后的液体进行连续清洗纯化，从而加快纯化速度；本发明还通过优化连续分离纯化的工艺参数，使杂质和细胞外囊泡可以充分分离，在降低细胞外囊泡损失的同时，提高细胞外囊泡提取液的纯度。
附图说明
47.图1为本发明提供的细胞外囊泡连续浓缩纯化提取系统的结构示意图；
48.图2为本发明提供的细胞外囊泡浓缩纯化的原理图，其中，a为切向流过滤法浓缩样品的原理图，b为连续加入少量缓冲溶液情况下纯化样品的原理图，c为连续加入大量缓冲溶液情况下纯化样品的原理图；
49.图3为本发明提供的实施例2所得提取液的电镜测试结果图。
具体实施方式
50.为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
51.实施例1
52.请参阅图1，本实施例提供的一种细胞外囊泡连续浓缩纯化提取系统，包括原液罐1、初级过滤装置2、中间产物容器3、浓缩纯化装置4、第一电控三通阀5、第二电控三通阀24、第一恒流泵6、第二恒流泵7、第三恒流泵9、缓冲液容器10、过滤除菌装置12、终产物容器13及控制器14，其中，原液罐1通过管道和第一恒流泵6与初级过滤装置2的入口连接，初级过
滤装置2的滤余口通过管道与原液罐1连接，从而使原液罐1、第一恒流泵6及初级过滤装置2依次连接成过滤回路；初级过滤装置2的滤出口通过管道与中间产物容器3的入口连接；中间产物容器3的空气入口通过管道依次连接有电控阀20和空气过滤器21；中间产物容器3、第二恒流泵7、浓缩纯化装置4、第一电控三通阀5及第二电控三通阀24依次连接成循环浓缩纯化回路，浓缩纯化装置4的滤出口通过管道连接有废液容器8，第一电控三通阀5与第二电控三通阀24之间的管道上设置有蛋白浓度检测器11，第一电控三通阀5、第三恒流泵9和缓冲液容器10通过管道依次连接，第二电控三通阀24、过滤除菌装置12和终产物容器13通过管道依次连接；第一恒流泵6、第二恒流泵7、第三恒流泵9、第一电控三通阀5、第二电控三通阀24和蛋白浓度检测器11分别与控制器14电性连接。
53.具体的，初级过滤装置2包括至少一个囊式死端过滤器，囊式死端过滤器具有单层滤膜或双层滤膜，滤膜的孔径为0.15～1.0μm。
54.具体的，初级过滤装置2为一个囊式死端过滤器，囊式死端过滤器的滤膜孔径为0.15～0.22μm。
55.具体的，初级过滤装置2由至少两个具有不同滤膜孔径的囊式死端过滤器串联而成。例如，初级过滤装置2由两个具有不同滤膜孔径的囊式死端过滤器串联而成，其中一个囊式死端过滤器的滤膜孔径优选为1.0μm，另一个囊式死端过滤器的滤膜孔径优选为0.22μm，滤膜孔径为1.0μm的囊式死端过滤器位于第一恒流泵6与滤膜孔径为0.22μm的囊式死端过滤器之间。
56.具体的，初级过滤装置2包括至少一个切向流过滤器，所述切向流过滤器具有孔径为0.2～0.22μm的滤膜。浓缩纯化装置4具有平板滤膜或中空纤维柱，浓缩纯化装置4的截留分子量为50～750kd，优选为500～750kd。
57.具体的，第一恒流泵6与初级过滤装置2入口之间的管道上设置有第一压力计15，第一压力计15用于与初级过滤装置1连接的管道内液体的压力；第二恒流泵7与浓缩纯化装置4之间的管道上设置有第二压力计16，第二压力计16用于检测与浓缩纯化装置4入口连接的管道内液体的压力；第一压力计15和第二压力计16分别与控制器14电性连接。
58.初级过滤装置2与中间产物容器3之间的管道上设置有第一流量计17，浓缩纯化装置4与废液容器8之间的管道上设置有第二流量计18，第一流量计17和第二流量计18分别与控制器14电性连接。第一流量计17用于检测泵入中间产物容器3的液体流量；第二流量计18用于检测从浓缩纯化装置4滤出口滤出的废液的滤出流量。
59.中间产物容器3上设置有重量计19，重量计19与控制器14电性连接；重量计19用于检测中间产物容器3的重量。
60.本实施例提供的细胞外囊泡连续浓缩纯化提取系统还包括温度控制装置22及显示器，温度控制装置22及显示器均与控制器14电性连接。温度控制装置22用于调控系统所处环境的温度，温度控制装置22可以是空调设备，显示器方便操作人员设置相关参数，并将设置的参数储存于控制器14。
61.具体的，初级过滤装置2与中间产物容器3之间的管道上设置有止回阀23，止回阀23与控制器14电性连接。
62.本实施例提供的细胞外囊泡连续浓缩纯化提取系统可用于对含有细胞外囊泡的液体(即样品)进行过滤、浓缩和纯化，以获得高纯度的细胞外囊泡。本实施例提供的系统的
运行原理如下：
63.将含有细胞外囊泡的液体导入原料罐1中，打开止回阀23，启动第一恒流泵6，以导通所述循环过滤回路，利用所述循环过滤回路对原料罐1内含有细胞外囊泡的液体进行循环过滤，滤出液从初级过滤装置2的滤出口输出并泵入中间产物容器3内，当循环过滤完成时，关闭第一恒流泵6及止回阀23；
64.切换第一电控三通阀5和第二电控三通阀24，启动第二恒流泵7，以导通所述循环浓缩纯化回路，利用所述循环浓缩循环回路对中间产物容器3内的滤出液进行循环浓缩，在循环浓缩过程中，废液从浓缩纯化装置4的滤出口排入废液容器8内，滤余液保留在所述循环浓缩纯化回路内；
65.当保留在中间产物容器3内滤余液减少至所需体积时，切换第一电控三通阀5，启动第三恒流泵9，将缓冲液容器10内的缓冲液泵入所述循环浓缩纯化回路中，利用所述循环浓缩纯化回路对浓缩后的滤余液进行连续清洗纯化，在连续清洗纯化过程中，废液从浓缩纯化装置4的滤出口排入废液容器8内，滤余液保留在所述循环浓缩纯化回路内；利用蛋白浓度检测器11对流经的液体进行检测，当检测到液体的蛋白浓度无明显变化时，连续清洗纯化完成后，关闭第三恒流泵9，停止向所述循环浓缩纯化回路输入缓冲溶液；
66.切换所述第一电控三通阀5和第二电控三通阀24，打开电控阀20，使洁净的空气通入中间产物容器3，将中间产物容器3内的液体压入过滤除菌装置12内进行过滤除菌，从而获得终产物。
67.在本实施例中，细胞外囊泡浓缩纯化的原理如图2所示，图2中a为切向流过滤器浓缩样品的原理图，b、c为加入缓冲溶液后纯化样品的原理图，随着缓冲溶液的加入并经纯化后，样品中的杂质逐渐被稀释和滤出，而样品中的细胞外囊泡被留存下来。
68.实施例2
69.本实施例提供的一种细胞外囊泡连续分离纯化方法，通过细胞外囊泡连续浓缩纯化提取系统实施，本实施例采用的细胞外囊泡连续浓缩纯化提取系统与实施例1的不同之处在于，本实施例采用的初级过滤器2为一个切向流中空纤维过滤器，所述切向流中空纤维过滤器的过滤面积为82cm2，滤膜孔径为0.22μm；本实施例采用的浓缩纯化装置4为一个切向流中空纤维过滤器，所述切向流中空纤维过滤器的过滤面积为94cm2，滤膜的截留分子量为500kd。
70.该细胞外囊泡连续分离纯化方法的流程如图2所示，具体包括如下步骤：
71.(1)收集500ml的msc细胞培养基上清液，并将该上清液注入原液罐1内，即需要处理的原液体积v0为500ml；打开止回阀23，启动第一恒流泵6，以导通所述循环过滤回路，利用所述循环过滤回路对原液罐1内含有细胞外囊泡的液体进行循环过滤，在循环过滤过程中，从初级过滤装置2输出的滤出液被泵入中间产物容器3内；
72.步骤(1)还包括：启动第一流量计17，第一流量计17检测泵入中间产物容器3的液体流量q，并将检测到的液体流量q发送至控制器14；控制器14内储存有原液体积v0及循环过滤回路损失体积v1，当循环过滤时间为t时，根据下述公式计算流入中间产物容器3的滤出液体积v：v＝q
×
t，当满足v＝v
0-v1时，控制器14判定所述循环过滤完成，控制第一恒流泵6和止回阀23关闭，从而停止向中间产物容器3输入滤出液，同时，启动重量计19，通过重力计19检测中间产物容器3的重量m1，并将检测到的重量m1发送至控制器14；控制器14内储存
有中间产物容器3的初始重量m0，根据下述公式计算中间产物容器3内的液体重量δm1：δm1＝m
1-m0，根据下述公式计算流入中间产物容器3的液体的密度ρ，ρ＝δm1/v。
73.(2)在控制器14的控制下，切换第一电控三通阀5和第二电控三通阀24，启动第二恒流泵7，以导通所述循环浓缩纯化回路，利用所述循环浓缩纯化回路对所述滤出液进行循环浓缩，滤出废液，保留滤余液；当中间产物容器3保留的滤余液体积减少至目标体积时，通过第二流量计18测出从浓缩纯化装置4滤出口滤出的废液的滤出流量为10ml/min，控制器14判定所述循环浓缩完成；
74.在进行步骤(2)之前，通过显示器设置目标体积v
′
，并将目标体积v
′
存储于控制器14内；进行步骤(2)时，通过重量计19检测中间产物容器3的实时重量m2，并将检测到的重量m2发送至控制器14，根据下述公式计算中间产物容器3内液体的实时重量δm2及实时体积v
t
：δm2＝m
2-m0，v
t
＝δm2/ρ，当满足v
t
＝v
′
时，控制器14判定所述循环浓缩完成；在本实施例中，v
′
为10ml。
75.(3)循环浓缩完成后，切换第二电控三通阀24，启动第三恒流泵9，使缓冲液容器10内的缓冲液以10ml/min的流量泵入所述循环浓缩纯化回路中，利用所述循环浓缩纯化回路对循环浓缩后保留的滤余液进行连续清洗纯化，滤出废液(废液的滤出流量为10ml/min)，保留滤余液；在连续清洗纯化过程中，通过蛋白浓度检测器11对流经液体的蛋白质浓度进行定时检测(每隔1min一次)；当泵入的生理盐水达到200ml时，相邻两次检测的蛋白浓度之差的绝对值小于预设值(如预设值为10μg/ml)时，判定所述连续清洗纯化完成，关闭第三恒流泵9；
76.(4)切换所述第一电控三通阀和第二电控三通阀，打开电控阀20，使洁净的空气输入中间产物容器3，将中间产物容器3内连续清洗纯化后保留的滤余液压入过滤除菌装置12进行过滤除菌，获得终产物细胞外囊泡提取液。
77.上述步骤(1)～(4)是在环境温度为4℃的条件下进行的。
78.对比例1
79.本对比例提供了一种通过传统超速离心法分离msc细胞培养基上清液中细胞外囊泡的方法，具体包括如下步骤：
80.(1)收集250ml的msc细胞培养基上清液，使用0.22μm滤膜过滤，收集滤液；
81.(2)在4℃下，将步骤(1)所得的滤液以300r/min的转速离心10min，弃去沉淀，取上层清液；将所述上层清液在4℃下以2000r/min的转速离心10min，弃去沉淀，取上层清液；
82.(3)将步骤(2)所得的上层清液在4℃下以10000r/min的转速离心30min，弃去沉淀，将上层清液转移到超速离心管中；
83.(4)将步骤(3)所得的上层清液在4℃下以100000r/min的转速离心90min，弃去上层清液，取沉淀；
84.(5)加入pbs缓冲溶液重悬步骤(4)所得的沉淀，pbs缓冲溶液与步骤(4)所得的沉淀的重量比为1:1，再次在4℃下以100000r/min的转速离心90min，弃去上清，取沉淀，向所得的沉淀加入生理盐水1ml，获得细胞外囊泡提取液。
85.对比例2
86.本对比例提供了一种通过现有切向流浓缩纯化装置提取msc细胞培养基上清液中细胞外囊泡的方法，具体包括如下步骤：
87.(1)收集500ml的msc细胞培养基上清液；
88.(2)利用蠕动泵(来自于润泽流体公司)，将步骤(1)所得的上清液过切向流中空纤维过滤器(过滤面积为82cm2，滤膜孔径为0.22μm，来自于瑞普利金公司)，并将滤出液并入一中间产物容器；
89.(3)利用蠕动泵(来自于润泽流体公司)，将中间产物容器内的滤出液过切向流过滤器(过滤面积为94cm2，滤膜的截留分子量为500kd，来自于科百特公司)，直至中间产物容器内的液体被浓缩至10ml；
90.(4)向中间产物容器内手动加入200ml生理盐水，然后将中间产物容器内的混合液体过切向流滤膜，直至将中间产物容器内的液体被浓缩至10ml。
91.对比例3
92.本对比例提供了一种通过现有切向流浓缩纯化装置提取msc细胞培养基上清液中细胞外囊泡的方法，本对比例与对比例2的不同之处仅在于，本对比例的步骤(4)具体包括：向中间产物容器内手动加入50ml生理盐水，然后将中间产物容器内的混合液体过切向流滤膜，直至将中间产物容器内的液体被浓缩至10ml；再重复上述操作三次。
93.对比例4
94.本对比例提供了一种通过现有切向流浓缩纯化装置提取msc细胞培养基上清液中细胞外囊泡的方法，本对比例与对比例2的不同之处仅在于，本对比例的步骤(4)具体包括：向中间产物容器内手动加入67ml生理盐水，然后将中间产物容器内的混合液体过切向流滤膜，直至将中间产物容器内的液体被浓缩至10ml；再重复上述操作二次。
95.对比例5
96.本对比例提供了一种通过现有切向流浓缩纯化装置提取msc细胞培养基上清液中细胞外囊泡的方法，本对比例与对比例2的不同之处仅在于，本对比例的步骤(4)具体包括：向中间产物容器内手动加入67ml生理盐水，然后将中间产物容器内的混合液体过切向流滤膜，直至将中间产物容器内的液体被浓缩至10ml；再重复上述操作一次。
97.效果例1
98.以msc细胞培养基上清液、实施例2的提取液、对比例1获得的提取液、对比例2～5步骤(4)所得中间产物容器内的液体及对比例2步骤(3)的浓缩液为测试对象，进行如下测试：
99.(1)蛋白杂质含量：利用bradford法测定样品的蛋白浓度，具体的，采用bradford蛋白定量试剂盒定量检测出样品的蛋白浓度，结果如表1所示；
100.(2)还原性杂质含量：利用bca法测定样品的总蛋白浓度，采用bca蛋白定量分析试剂盒测定样品的总蛋白浓度，然后使用bca法检测结果减去bradford法检测结果，计算结果即为还原性杂质(如谷氨酰胺、天冬氨酸、烟酰胺等)的含量，结果如表1所示；
101.(3)粒子浓度：使用nta法进行检测；
102.(4)粒子回收率：＝终产物粒子浓度
×
终产物体积/(原液粒子浓度
×
原液量)；
103.(5)对实施例2所得的提取液进行电镜测试，测试结果如图3所示。
104.表1
[0105][0106]
从表1和图3可以看出，实施例2获得的提取液中的细胞外囊泡具有完整的囊泡结构，提取液中几乎不存在蛋白颗粒，粒子回收率达到79.94％，粒子浓度较高。与对比例1～6的方法相比，本发明实施例2提供的方法通过细胞外囊泡连续浓缩纯化提取系统实现了细胞外囊泡分离纯化工艺的自动化，提取效率高，同时制备出杂质含量少、纯度高的细胞外囊泡提取液。
[0107]
实施例3
[0108]
本实施例提供的一种细胞外囊泡连续分离纯化方法，通过细胞外囊泡连续浓缩纯化提取系统实施。
[0109]
本实施例采用的细胞外囊泡连续浓缩纯化提取系统与实施例2的不同之处在于，本实施例采用的初级过滤器2为一个切向流中空纤维过滤器，所述切向流中空纤维过滤器的过滤面积为290cm2，滤膜孔径为0.22μm；本实施例采用的浓缩纯化装置4为一个切向流中空纤维过滤器，所述切向流中空纤维过滤器的过滤面积为340cm2，滤膜的截留分子量为500kd。
[0110]
本实施例提供的方法与实施例2的不同之处在于，本实施例的步骤(1)收集鲜牛奶去除脂肪和蛋白的余液500ml；本实施例的步骤(2)中目标体积为20ml，测出废液的滤出流量为5ml/min；本实施例的步骤(3)将1000ml生理盐水以5ml/min的流量持续泵入中间产物容器3内，期间，在泵入的生理盐水的体积达到100ml、200ml、400ml、800ml、1000ml时对中间产物容器3内的液体进行人工采样。
[0111]
对比例6
[0112]
本对比例提供了一种通过现有切向流浓缩纯化装置提取msc细胞培养基上清液中细胞外囊泡的方法，本对比例与对比例2的不同之处在于，本对比例的步骤(1)收集鲜牛奶去除脂肪和蛋白的余液500ml；本对比例采用的切向流中空纤维过滤器的过滤面积为290cm2，切向流滤膜的过滤面积为340cm2，本对比例的步骤(4)向中间产物容器内手动加入的生理盐水为1000ml；本对比例的步骤(3)和步骤(4)均将中间产物容器内的液体浓缩至20ml。
[0113]
对比例7
[0114]
本对比例提供了一种通过现有切向流浓缩纯化装置提取msc细胞培养基上清液中细胞外囊泡的方法，本对比例与对比例7的不同之处仅在于，本对比例的步骤(4)具体包括：向中间产物容器内手动加入250ml生理盐水，然后将中间产物容器内的混合液体过切向流滤膜，直至将中间产物容器内的液体被浓缩至20ml；再重复上述操作三次。
[0115]
对比例8
[0116]
本对比例提供了一种通过现有切向流浓缩纯化装置提取msc细胞培养基上清液中细胞外囊泡的方法，本对比例与对比例7的不同之处仅在于，本对比例的步骤(4)具体包括：向中间产物容器内手动加入334ml生理盐水，然后将中间产物容器内的混合液体过切向流滤膜，直至将中间产物容器内的液体被浓缩至20ml；再重复上述操作二次。
[0117]
对比例9
[0118]
本对比例提供了一种通过现有切向流浓缩纯化装置提取msc细胞培养基上清液中细胞外囊泡的方法，本对比例与对比例7的不同之处仅在于，本对比例的步骤(4)具体包括：向中间产物容器内手动加入500ml生理盐水，然后将中间产物容器内的混合液体过切向流滤膜，直至将中间产物容器内的液体被浓缩至20ml；再重复上述操作一次。
[0119]
效果例2
[0120]
以鲜牛奶去除脂肪和蛋白的余液、实施例3的五次人工采样样品、对比例6～9步骤(4)所得中间产物容器内的液体为测试对象，进行如下测试：
[0121]
(1)蛋白杂质含量：利用bradford法测定样品的蛋白浓度，具体的，采用bradford蛋白定量试剂盒定量检测出样品的蛋白浓度；
[0122]
(2)还原性杂质含量：利用bca法测定样品的总蛋白浓度，采用bca蛋白定量分析试剂盒测定样品的总蛋白浓度，然后使用bca法检测结果减去bradford法检测结果，计算结果即为还原性杂质含量；
[0123]
(3)粒子浓度：使用nta法进行检测；
[0124]
(4)粒子回收率：＝终产物粒子浓度
×
终产物体积/(原液粒子浓度
×
原液量)；
[0125]
测得结果如表2所示。
[0126]
表2
[0127][0128][0129]
从表2可以看出，与对比例6～9相比，实施例3只需经过200ml的生理盐水连续清洗纯化后，采集的样品中还原性杂质和蛋白杂质的浓度显著降低，同时，实施例3的方法获得细胞外囊泡提取液的粒子回收率高，粒子浓度较高。由实施例3可知，随着泵入的生理盐水逐渐增多，循环浓缩纯化回路中液体的杂质含量逐渐减少，当泵入的生理盐水≥800ml后，循环浓缩纯化回路中液体的杂质含量无明显变化，但是粒子的回收率明显下降。因此，在对20ml浓缩后的滤出液进行连续清洗纯化的过程中，泵入的生理盐水的总体积优选为200～800ml，即，缓冲液的泵入总体积优选为中间产物容器内循环浓缩后的滤出液体积的10～40倍。
[0130]
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能
理解为对本发明的限制。
[0131]
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“设置”、“连接”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
[0132]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

技术特征：
1.一种包括外泌体在内的细胞外囊泡连续浓缩纯化提取系统，其特征在于，包括原液罐、初级过滤装置、中间产物容器、浓缩纯化装置、第一电控三通阀、第二电控三通阀、控制器、第一恒流泵、第二恒流泵、第三恒流泵、缓冲液容器、过滤除菌装置和终产物容器，其中，所述原液罐、第一恒流泵及初级过滤装置通过管道依次连接，所述初级过滤装置的滤出口通过管道与所述中间产物容器的入口连接，所述中间产物容器、第二恒流泵、浓缩纯化装置、第一电控三通阀和第二电控三通阀依次连接成循环浓缩纯化回路，所述中间产物容器的空气入口通过管道依次连接有电控阀和空气过滤器，所述中间产物容器的出口通过管道和第二恒流泵与所述浓缩纯化装置的入口连接，所述浓缩纯化装置的滤出口通过管道连接有废液容器，所述缓冲液容器、第三恒流泵及第一电控三通阀通过管道依次连接，所述第二电控三通阀、过滤除菌装置和终产物容器通过管道依次连接，所述第一恒流泵、第二恒流泵、第三恒流泵、第一电控三通阀、第二电控三通阀及电控阀分别与所述控制器电性连接。2.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述初级过滤装置包括至少一个囊式死端过滤器，所述囊式死端过滤器具有单层滤膜或双层滤膜，所述滤膜的孔径为0.15～1.0μm。3.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述初级过滤装置包括至少一个切向流过滤器，所述切向流过滤器具有孔径为0.2～0.22μm的滤膜。4.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述浓缩纯化装置为平板滤膜或中空纤维柱；所述浓缩纯化装置的截留分子量为50～750kd。5.如权利要求1所述的系统，其特征在于，包括以下(ⅰ)～(ⅳ)中的至少一种：(ⅰ)所述第一电控三通阀与第二电控三通阀之间的管道上设置有蛋白浓度检测器，所述蛋白浓度检测器与所述控制器电性连接；(ⅱ)所述第一恒流泵与初级过滤装置入口之间的管道上设置有第一压力计，所述第二恒流泵与浓缩纯化装置之间的管道上设置有第二压力计，所述第一压力计和第二压力计分别与所述控制器电性连接；(ⅲ)所述初级过滤装置与所述中间产物容器之间的管道上设置有第一流量计，所述浓缩纯化装置与所述废液容器之间的管道上设置有第二流量计，所述第一流量计和第二流量计分别与所述控制器电性连接；(ⅳ)所述中间产物容器上设置有重量计，所述重量计与所述控制器电性连接。6.如权利要求1所述的系统，其特征在于，还包括温度控制装置，所述温度控制装置与所述控制器电性连接，所述温度控制装置用于调控系统所处环境的温度。7.一种包括外泌体在内的细胞外囊泡连续分离纯化方法，其特征在于，通过如权利要求1～6中任一项所述的系统实施，包括如下步骤：(1)启动所述第一恒流泵，将原液罐内含有细胞外囊泡的液体持续泵入所述初级过滤装置内进行过滤，将所述初级过滤装置输出的滤出液输入所述中间产物容器内；(2)切换第一电控三通阀和第二电控三通阀，启动所述第二恒流泵，使所述循环浓缩纯化回路导通，利用所述循环浓缩纯化回路对步骤(1)所得的滤出液进行循环浓缩，滤出废液，保留滤余液；(3)循环浓缩完成后，切换所述第一电控三通阀，启动所述第三恒流泵，使所述缓冲液容器内的缓冲液持续泵入所述循环浓缩纯化回路中，利用所述循环浓缩纯化回路对步骤(2)保留的滤余液进行连续清洗纯化，滤出废液，保留滤余液，连续清洗纯化完成后，关闭所
述第三恒流泵；(4)切换所述第一电控三通阀和第二电控三通阀，打开所述电控阀，使洁净的空气输入所述中间产物容器，将所述中间产物容器内的滤余液压入所述过滤除菌装置进行过滤除菌，获得细胞外囊泡提取液。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述中间产物容器内循环浓缩后的滤出液体积为步骤(1)输入中间产物容器的滤出液体积的0.01～0.5倍。9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中废液的滤出流量与缓冲液的输入流量之比为1：1；所述步骤(3)中缓冲液的泵入总体积为中间产物容器内滤余液体积的5～100倍。10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中缓冲液包括注射用水、灭菌注射用水、纯化水、蒸馏水、生理盐水、葡萄糖溶液及磷酸盐缓冲液中的至少一种。

技术总结
本发明涉及一种包括外泌体在内的细胞外囊泡连续浓缩纯化提取系统及方法，属于生物技术领域。该系统包括原液罐、初级过滤装置、中间产物容器、浓缩纯化装置、第一电控三通阀、第二电控三通阀、控制器、第一恒流泵、第二恒流泵、第三恒流泵、缓冲液容器、过滤除菌装置和终产物容器，所述中间产物容器、第二恒流泵、浓缩纯化装置、第一电控三通阀和第二电控三通阀连接成循环浓缩纯化回路。本发明利用该系统对含有细胞外囊泡的液体进行过滤后，将滤出液循环浓缩，向循环浓缩纯化回路中泵入缓冲液，以对浓缩后的液体进行连续清洗纯化，加快纯化速度；通过优化工艺参数，使杂质和细胞外囊泡分离，降低细胞外囊泡损失，提高细胞外囊泡提取液的纯度。纯度。纯度。


技术研发人员：付清玲 吴子聪
受保护的技术使用者：中山大学附属第一医院
技术研发日：2023.06.14
技术公布日：2023/8/9