基于二茂铁中空纳米球的ECL传感器及毒死蜱检测方法

基于二茂铁中空纳米球的ecl传感器及毒死蜱检测方法
技术领域
1.本发明涉及农残分析测定技术领域，特别是涉及一种基于二茂铁中空纳米球的ecl传感器及毒死蜱检测方法，包括ecl传感器制备步骤和使用该传感器测定毒死蜱的操作方法等；以ecl信号输出，可检测毒死蜱含量，并对结果相互印证，准确度高；本测定方法简捷快速、选择性好、灵敏度高。


背景技术：

2.电致光传感器是一种新型传感器技术，通过其高灵敏度和快速响应，它可以用于检测农药残留。这种技术的优点是可以快速、准确地检测出农药残留，而且无需复杂的样品准备过程，具有较高的实用性，在如今越来越注重食品安全的社会中，这种技术有望得到广泛应用；硫量子点具有良好的水分散性、低毒性及优异的光学特性，成为了电化学领域的研究热点，shen等人利用升华硫作为原料经过125 hr处理后，合成出新型硫量子点，提出了硫量子点形成过程中组装—裂变机理，并首次观察到硫量子点的显著电化学发光，然而，所制备的硫量子点的合成时间长且量子效率低；因此，科学家们致力于探索更加高效的方法；通过使用不同的纳米材料设计有效的ecl传感策略，可以显著改善传感器的灵敏度，多孔聚合物由于具有轻质、高孔隙率及高比表面积的特性，是令人满意的载体，静电自组装是构建多孔聚合物功能材料的一种有效的策略，通常由模板及两种具有相反电荷的聚合物构成。硅球由于其性能稳定，粒径均匀等优势，常作为自组装模板，使带有相反电荷的聚合物利用静电作用相继吸附在模板表面，对于自组装技术来说，其可以通过简单的改变吸附材料来实现功能的转变。


技术实现要素：

3.本发明的目的之一是制备合成时间短，量子效率高的蓝色发光硫量子点，其发光颜色通过h2o2刻蚀硫点改变粒径来调控，探索调整h2o2加入量及浓度；本发明的目的之二是利用共价交联和静电相互作用，在硅球表面逐层吸附pei-fc-paa，去除硅球模板制备二茂铁中空纳米微球fc-hpns，fc通过争夺可使硫量子点发光的so4
·-及sqds
·-猝灭硫量子点发光，合成的fc-hpns实现猝灭剂富集；其中fc-hpns在水基中制备得到；本发明的目的之三是在电极表面修饰蓝色发光硫量子点，以fc-hpns高效负载毒死蜱互补链，起到催化、放大信号的目的，构建信号关闭型ecl适配体传感器，实现对毒死蜱的灵敏检测。
4.本发明的技术方案为：采用中空fc-hpns负载毒死蜱适配体的互补链cdna，cdna与电极表面的适配体杂交形成双链结构，构建以硫量子点为发光体，fc为猝灭剂的ecl适配体传感器。其信号以循环伏安模式下的ecl信号读出。当毒死蜱存在时，适配体与毒死蜱相结合，双链dna解螺旋，
hr，用ph为7.4的pbs缓冲液冲洗，得到fc-hpns-cdna/mch/apt/ aunps/sqds/aunps/gce。
5.2.ecl适配体传感器检测毒死蜱方法如下：（1）将不同浓度的毒死蜱农药滴加在构建的传感器表面，35~37 ℃孵育1 hr，以ph 7.4~7.8的pbs缓冲液冲洗；（2）以适配体传感器为工作电极，内充饱和kcl的ag/agcl电极为参比电极，铂电极为辅助电极，在-2.0-0.0 v电位区间内进行循环伏安扫描，设置光电倍增管电压为700 v，记录得到的光强结果。
6.本发明的有益效果为：1.本发明模式简捷快速。该传感器使用同一仪器，同一测定溶液体系，无需更换仪器和溶液体系；2.本发明传感信号灵敏且传导速度快；首次在水基中制得fc-hpns，采用fc-hpns作为猝灭剂，不仅可以利用氢氟酸去掉硅球模板提高导电性，还改善了fc猝灭效率低的缺点，提高检测灵敏度；中空fc-hpns具有大比表面积、低密度、高负载能力以及质荷传递距离短等优势，能够起到提高提高传感器导电性，放大信号的作用；3.h2o2后刻蚀法成功实现了sqds的尺寸和颜色调控，并进一步提高了sqds的发光性能，成功将其用于ecl适配体传感器检测农药残留；4.证明基于fc-hpns的信号关的ecl适配体传感器具有良好的分析性能，具有良好的重现性、稳定性和选择性，在实际农残检测中显示出良好的应用前景，为农残检测提供了新方法；5.本发明样品测定程序简单，操作简便快捷。
附图说明
7.图1所示为不同浓度毒死蜱农药的ecl时间-光强度图（a）和线性关系图（b）其中，a
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0，b
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10-14
，c
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，d
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，e
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，f
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，g
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，h
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，i
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mol
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。
具体实施方式
8.为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
9.实施例1 基于fc-hpns猝灭硫量子点的ecl传感器的制备：（1）fc-hpns的制备称取0.36 g甲酸二茂铁加入到25 ml超纯水中连续搅拌10 min，随后加入2.5 ml浓度为3.8 mmol
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的edc以及1.0 mmol
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的nhs溶液搅拌过夜；将60
µ
l pei加入到混合溶液中在磁力搅拌器上搅拌2 hr，pei与甲酸二茂铁通过酰胺键交联成功制得pei-fc复合物；将0.03 g sio2超声分散在30 ml超纯水中，接着加入3 ml pei-fc复合物持续搅拌40 min，8000 rmp下离心收集沉淀，并用水和乙醇充分进行洗涤，得到sio2@pei-fc，后将其分散在20 ml超纯水中；然后，将5.2 ml浓度为0.05 g
·
ml-1
的paa加入到上述溶液中持续搅拌50 min后，离心并多次洗涤后，获得了sio2@pei-fc-paa核壳聚合物纳米材料；重复上
述包覆pei-fc过程两次，然后加入1.25 ml edc浓度为4.0 mmol
·
l-1
和浓度为1.0 mmol
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的nhs溶液在4 ℃下搅拌2 hr以增强复合材料骨架稳定性；将2.8 ml浓度为0.1 mol
·
l-1 hf滴入sio2@pei-fc-paa核壳聚合物混合溶液中，室温下持续搅拌20 min，8000 rpm下离心收集产物并多次洗涤去除剩余hf，最终将产物分散在8 ml超纯水中，得到fc-hpns；（2）蓝色发光硫量子点sqds的制备称取1.5 g升华硫、4.0 g naoh、2.5 ml分子量为600的聚己二醇及60 ml超纯水置于100 ml圆底烧瓶中混合，混合物在70
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c下持续搅拌反应48 hr；随着时间的延长，反应物由原始的浅黄色变为红色最终变为橙色溶液，并在紫外灯下发射出微弱的绿色荧光，得到硫点溶液；在持续搅拌下，将40 ml体积分数为1.5%的h2o2加入到30 ml硫点溶液中，紫外灯下溶液由浅绿色变为明亮的蓝色，硫量子点制备完成；将上述溶液放入截留分子量为1000 da的透析袋中透析24 hr以除去未反应的小分子，然后冷冻干燥，得到黄色粉末；取2 mg硫量子点粉末溶于0.8 ml超纯水中，得到硫量子点溶液；（3）ecl传感器的制备1）取20
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l浓度为1.0
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mol
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的毒死蜱cdna和180
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l的fc-hpns及30
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l质量分数为2.5 wt%戊二醛溶液置于离心管中混合，在振荡器上持续振荡1.5 hr得到fc-hpns-cdna，并置于4 ℃冰箱中储存备用；2）将处理好的玻碳电极gce置入质量分数为1%的氯金酸溶液中，使用i-t曲线法在-0.2 v电位下下电沉积金1 min，获得aunps/gce修饰电极；3）移取8.0 μl 硫量子点溶液滴涂在电极上，室温下晾干后得到sqds/aunps/gce；4）用同样的方法再次镀金1 min后，用ph为7.4的pbs缓冲液洗净电极；在电极上滴加8.0 μl浓度为1.0 μmol
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毒死蜱apt，4
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c下孵育12 hr，得apt/aunps/sqds/au nps/gce；5）在电极上滴加4 μl浓度为8 μmol
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的mch在37
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c下孵育1 hr，以封闭电极非特异性位点，后用ph为7.4的pbs缓冲液冲洗；6）将8.0 μl fc-hpns-cdna滴涂到修饰的电极表面，在35
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c下孵育1 hr，用ph为7.4的pbs缓冲液冲洗，得到fc-hpns-cdna/mch/apt/ aunps/sqds/aunps/gce。
10.实施例2 基于fc-hpns猝灭硫量子点的ecl传感器的制备：（1）二茂铁中空纳米微球的制备称取0.4 g甲酸二茂铁加入到30 ml超纯水中连续搅拌15 min，随后加入3.5 ml浓度为4.2 mmol
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的edc以及1.0 mmol
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的nhs溶液搅拌过夜；将60
µ
l pei加入到混合溶液中在磁力搅拌器上搅拌2 hr，pei与甲酸二茂铁通过酰胺键交联成功制得pei-fc复合物；将0.03 g sio2超声分散在35 ml超纯水中，接着加入3 ml pei-fc复合物持续搅拌50 min，8000 rmp下离心收集沉淀，并用水和乙醇充分进行洗涤，得到sio2@pei-fc，后将其分散在20 ml超纯水中；然后，将5.5 ml浓度为0.1 g
·
ml-1
的paa加入到上述溶液中持续搅拌50 min后，离心并多次洗涤后，获得了sio2@pei-fc-paa核壳聚合物纳米材料；重复上述包覆pei-fc过程两次，然后加入1.25 ml edc浓度为4.2 mmol
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和浓度为1.2 mmol
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的nhs溶液在4 ℃下搅拌2 hr以增强复合材料骨架稳定性；将3.0 ml浓度为0.12 mol
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hf滴入sio2@pei-fc-paa核壳聚合物混合溶液中，室温下持续搅拌30 min，8000 rpm下离心收集产物并多次洗涤去除剩余hf，最终将产物分散在10.0 ml超纯水中，得到fc-hpns；（2）蓝色发光硫量子点sqds的制备称取1.5 g升华硫、4.2 g naoh、3.5 ml分子量为600的聚己二醇及60 ml超纯水置于100 ml圆底烧瓶中混合，混合物在75
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c下持续搅拌反应50 hr；随着时间的延长，反应物由原始的浅黄色变为红色最终变为橙色溶液，并在紫外灯下发射出微弱的绿色荧光，得到硫点溶液；在持续搅拌下，将50 ml体积分数为2.0%的h2o2加入到35 ml硫点溶液中，紫外灯下溶液由浅绿色变为明亮的蓝色，硫量子点制备完成；将上述溶液放入截留分子量为1000 da的透析袋中透析30 hr以除去未反应的小分子，然后冷冻干燥，得到黄色粉末；取2.5 mg硫量子点粉末溶于1.5 ml超纯水中，得到硫量子点溶液；（3）ecl传感器的制备1）取30
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l浓度为1.2
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mol
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的毒死蜱cdna和200
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l的fc-hpns及40
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l质量分数为3.0 wt%戊二醛溶液置于离心管中混合，在振荡器上持续振荡2.0 hr得到fc-hpns-cdna，并置于4 ℃冰箱中储存备用；2）将处理好的gce置入质量分数为1%的氯金酸溶液中，使用i-t曲线法在-0.2 v电位下下电沉积金1 min，获得aunps/gce修饰电极；3）移取10.0 μl 硫量子点溶液滴涂在电极上，室温下晾干后得到sqds/aunps/gce；4）用同样的方法再次镀金1 min后，用ph为7.4的pbs缓冲液洗净电极；在电极上滴加10 μl浓度为1.0 μmol
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毒死蜱apt，4
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c下孵育20 hr，得apt/aunps/sqds/au nps/gce；5）在电极上滴加6 μl浓度为12 μmol
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的mch在37
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c下孵育1 hr，以封闭电极非特异性位点，后用ph为7.4的pbs缓冲液冲洗；6）将10.0 μl fc-hpns-cdna滴涂到修饰的电极表面，在35~37
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c下孵育1 hr，用ph为7.4的pbs缓冲液冲洗，得到fc-hpns-cdna/mch/apt/ aunps/sqds/aunps/gce。
11.实施例3 ecl适配体传感器检测毒死蜱：（1）将不同浓度的毒死蜱农药滴加在构建的传感器表面，35 ℃孵育1 hr，以ph 7.4的pbs缓冲液冲洗；（2）以适配体传感器为工作电极，内充饱和kcl的ag/agcl电极为参比电极，铂电极为辅助电极，在-2.0-0.0 v电位区间内进行循环伏安扫描，设置光电倍增管电压为700 v，记录得到的光强结果。
12.实施例4 ecl适配体传感器检测毒死蜱方法如下：（1）将不同浓度的毒死蜱农药滴加在构建的传感器表面，37 ℃孵育1 hr，以ph 7.8的pbs缓冲液冲洗；（2）以适配体传感器为工作电极，内充饱和kcl的ag/agcl电极为参比电极，铂电极为辅助电极，在-2.0-0.0 v电位区间内进行循环伏安扫描，设置光电倍增管电压为700 v，记录得到的光强结果。
13.实施例5 实际样品的检测
通过对附近市场购买的蔬菜和水果样品进行测试，验证传感器在实际样品检测中的可行性。首先准确称取100 g芹菜、100 g西红柿，榨汁机内磨成汁；将两个样品分别分散在100 ml 0.1 mol
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的ph为7.4的pbs缓冲液中，超声处理5 min，将样品离心，获得上清液；与液相色谱-质谱的结果相比，构建的传感器与结果一致；毒死蜱的回收率在92.1~105%之间，相对标准偏差小于5.1%。

技术特征：
1.基于二茂铁中空纳米球的ecl传感器及毒死蜱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）fc-hpns的制备称取0.3~0.4 g甲酸二茂铁加入到20~30 ml超纯水中连续搅拌10~15 min，随后加入2.5 ~3.5 ml浓度为3.8~4.2 mmol
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的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺edc以及0.8~1.0 mmol
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的n-羟基硫代琥珀酰亚胺nhs溶液搅拌过夜；将55~60
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l 聚乙烯亚胺pei加入到混合溶液中在磁力搅拌器上搅拌2 hr，聚乙烯亚胺与甲酸二茂铁通过酰胺键交联成功制得聚乙烯亚胺-二茂铁复合物pei-fc；将0.02~0.03 g sio2超声分散在30~35 ml超纯水中，接着加入2.5~3 ml pei-fc复合物持续搅拌30~50 min，8000 rmp下离心收集沉淀，并用水和乙醇充分进行洗涤，得到sio2@pei-fc，后将其分散在15~20 ml超纯水中；然后将5~5.5 ml浓度为0.05~0.1 g
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ml-1
的聚丙烯酸paa加入到上述溶液中持续搅拌30~50 min后，离心并多次洗涤后，获得了sio2@pei-fc-paa核壳聚合物纳米材料；重复上述包覆pei-fc过程两次，然后加入1.25 ml edc浓度为3.8~4.2 mmol
·
l-1
和浓度为1.0~1.2 mmol
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l-1
的nhs溶液在4 ℃下搅拌2 hr以增强复合材料骨架稳定性；将2.5~3.0 ml浓度为0.05~0.12 mol
·
l-1 hf滴入sio2@pei-fc-paa核壳聚合物混合溶液中，室温下持续搅拌15~30 min，8000 rpm下离心收集产物并多次洗涤去除剩余hf，最终将产物分散在5~10 ml超纯水中，得到fc-hpns；（2）蓝色发光硫量子点sqds的制备称取1.2~1.5 g升华硫、3.8~4.2 g naoh、2.5~3.5 ml分子量为600的聚己二醇及50~60 ml超纯水置于100 ml圆底烧瓶中混合，混合物在70~75
ꢀ°
c下持续搅拌反应48~50 hr；随着时间的延长，反应物由原始的浅黄色变为红色最终变为橙色溶液，并在紫外灯下发射出微弱的绿色荧光，得到硫点溶液；在持续搅拌下，将40~50 ml体积分数为1.5~2.0%的h2o2加入到30~35 ml硫点溶液中，紫外灯下溶液由浅绿色变为明亮的蓝色，硫量子点制备完成；将上述溶液放入截留分子量为1000 da的透析袋中透析24~30 hr以除去未反应的小分子，然后冷冻干燥，得到黄色粉末；取2~2.5 mg硫量子点粉末溶于0.8~1.5 ml超纯水中，得到硫量子点溶液；（3）ecl传感器的制备1）取20~30
ꢀµ
l浓度为1.0~1.2
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mol
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的毒死蜱互补链cdna和180~200
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l的fc-hpns及30~40
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l质量分数为2.5~3.0 wt%戊二醛溶液置于离心管中混合，在振荡器上持续振荡1.5~2.0 hr得到fc-hpns-cdna，并置于4 ℃冰箱中储存备用；2）将处理好的玻碳电极gce置入质量分数为1%的氯金酸溶液中，使用i-t曲线法在-0.2 v电位下下电沉积金1 min，获得aunps/gce修饰电极；3）移取8.0~10.0 μl 硫量子点溶液滴涂在电极上，室温下晾干后得到sqds/aunps/gce；4）用同样的方法再次镀金1 min后，用ph为7.4的pbs缓冲液洗净电极；在电极上滴加8.0~10 μl浓度为1.0 μmol
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l-1
毒死蜱适配体apt，4
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c下孵育12~20 hr，得apt/aunps/sqds/au nps/gce；5）在电极上滴加4~6 μl浓度为8~12 μmol
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的6-巯基己醇mch在37
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c下孵育1 hr，以封闭电极非特异性位点，后用ph为7.4的pbs缓冲液冲洗；
6）将8.0~10.0 μl fc-hpns-cdna滴涂到修饰的电极表面，在35~37
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c下孵育1 hr，用ph为7.4的pbs缓冲液冲洗，得到fc-hpns-cdna/mch/apt/ aunps/sqds/aunps/gce。2.根据权利要求书1所述的传感器用于检测毒死蜱。3.根据权利要求书1所述的ecl适配体传感器检测毒死蜱，其特征在于，检测方法如下：（1）将不同浓度的毒死蜱农药滴加在构建的传感器表面，35~37 ℃孵育1 hr，以ph 7.4~7.8的pbs缓冲液冲洗；（2）以适配体传感器为工作电极，内充饱和kcl的ag/agcl电极为参比电极，铂电极为辅助电极，在-2.0-0.0 v电位区间内进行循环伏安扫描，设置光电倍增管电压为700 v，记录得到的光强结果。

技术总结
本发明涉及农残分析测定技术领域，特别是涉及一种基于二茂铁中空纳米球的ECL传感器及毒死蜱检测方法，包括ECL传感器制备步骤和使用该传感器测定毒死蜱的操作方法等；这种传感器以ECL信号输出，可检测毒死蜱含量，并对结果相互印证，准确度高；本测定方法简捷快速、选择性好、灵敏度高。灵敏度高。


技术研发人员：成婧 夏方诠 吴亚军 田栋
受保护的技术使用者：济南大学
技术研发日：2023.06.14
技术公布日：2023/8/9