一种转录因子KLF14在制备防治缺血性脑卒中产品中的应用

一种转录因子klf14在制备防治缺血性脑卒中产品中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种转录因子klf14在制备防治缺血性脑卒中产品中的应用。


背景技术：

2.缺血性脑卒中是由于大脑动脉狭窄或闭塞，出现短暂性血液供应不足而引起局灶性神经功能缺失发作的一类脑血管疾病，是导致残疾和死亡的主要原因之一。占脑卒中发病率的70％-80％。我国脑卒中发病率急剧攀升，并呈现出低收入群体中快速增长、性别和地域差异明显以及年轻化趋势。
3.目前临床有很多治疗缺血性脑卒中的手段，如溶栓治疗、抗血小板聚集治疗、抗凝治疗、血管内介入治疗、神经保护治疗等等，但是由于缺血性脑卒中的病理机制复杂，这些方法的治疗效果还不是特别有效和理想。因此深入分析病理机制，寻找有效的治疗药物和手段，是亟待解决的关键问题之一。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了解决现有技术中由于缺血性脑卒中的病理机制复杂，缺乏有效的治疗药物和手段的技术问题。
5.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
6.一种转录因子klf14在制备防治缺血性脑卒中产品中的应用。
7.优选的，所述转录因子klf14对ogd/r损伤的海马神经元中提供保护作用。
8.本技术还提供了一种防治缺血性脑卒中的产品，包括转录因子klf14。
9.本技术还提供了一种大鼠局灶性脑缺血再灌注mcao/r损伤模型的建立方法，使用longa的大鼠大脑中动脉线栓法建立脑缺血再灌注损伤模型。
10.优选的，选用250-280gsd小鼠在大鼠称重腹腔麻醉后，将大鼠固定在操作台上，备皮，消毒后沿颈正中线剪开皮肤，用眼科镊分开皮下组织；看到气管后，沿右侧分离，看到颈总动脉后，分离颈总动脉并找到颈内、外分支，结扎颈总动脉近心端，用动脉夹子夹住颈总、颈外动脉；靠近结扎处远心端用显微剪剪一个小口，显微镊持线栓迅速插入，切口远心端血管外结扎固定线栓,拿掉夹在颈总、颈外动脉的夹子；继续插入线栓，有阻力时即可停止，结扎固定线栓以防线栓脱落。
11.优选的，模型建立过程中给大鼠保暖，模型建立完成后消毒缝合并记录。
12.本发明利用缺血性脑卒中动物模型，首次明确缺血复灌损伤后转录因子klf14表达显著增加。利用ogd/r诱导的神经元损伤模型，首次证明海马神经元缺血损伤后klf14表达显著高表达。首次发现转录因子对缺血损伤神经元具有保护作用，本发明为预治急性缺血性脑卒中后提供了新思路，为开发神经保护剂提供了新的靶点。
附图说明
13.图1为本发明一实施方式中大鼠mcao/r损伤后klf14基因表达的示意图，其中a.正常大鼠和mcao/r损伤大鼠脑组织切片ttc染色。白色为损伤梗死区。b.realtimepcr检测正常大鼠和mcao/r大鼠大脑皮层半影区域中klf14的表达变化。；
14.图2为本发明一实施方式中2.原代海马神经元ogd/r损伤后转录因子klf14表达显著增加的示意图，其中a、原代培养海马神经元ogd/r损伤后，realtime-pcr检测各组klf14基因表达。b、原代培养海马神经元ogd/r损伤后，cck-8法分别检测各组神经元活力。
15.图中：control组，ogd/r组，空白小干扰rna+ogd/r组
16.(sinc+ogd/r)，klf14小干扰rna+ogd/r组(siklf14+ogd/r)，空白过表达+ogd/r组(oe-nc+ogd/r)，klf14过表达+ogd/r组
17.(oe-klf14+ogd/r)。
具体实施方式
18.以下结合具体实施例，对本发明作进一步地详细说明。
19.一种转录因子klf14在制备防治缺血性脑卒中产品中的应用。
20.所述klf14序列号：(mus)dq534758.1(rat)nm_001135094.1
21.所述转录因子klf14对ogd/r损伤的海马神经元中提供保护作用。
22.一种防治缺血性脑卒中的产品，包括转录因子klf14。
23.本技术还提供了大鼠局灶性脑缺血再灌注mcao/r损伤模型的建立方法，使用longa的大鼠大脑中动脉线栓法建立脑缺血再灌注损伤模型。
24.具体的，在一实施方式中，选用250-280gsd小鼠在大鼠称重腹腔麻醉后，将大鼠固定在操作台上，备皮，消毒后沿颈正中线剪开皮肤，用眼科镊分开皮下组织；看到气管后，沿右侧分离，看到颈总动脉后，分离颈总动脉并找到颈内、外分支，结扎颈总动脉近心端，用动脉夹子夹住颈总、颈外动脉；靠近结扎处远心端用显微剪剪一个小口，显微镊持线栓迅速插入，切口远心端血管外结扎固定线栓,拿掉夹在颈总、颈外动脉的夹子；继续插入线栓，有阻力时即可停止，结扎固定线栓以防线栓脱落。
25.模型建立过程中给大鼠保暖，模型建立完成后消毒缝合并记录。
26.以下结合具体实施例对本技术进行阐述：
27.实施例1：建立大鼠局灶性脑缺血再灌注mcao/r损伤模型
28.选用250-280gsd小鼠，采用longa的大鼠大脑中动脉线栓法(mcao)建立脑缺血再灌注损伤模型。
29.具体的，在一实施方式中，在大鼠称重腹腔麻醉后，将大鼠固定在操作台上，备皮，消毒后沿颈正中线剪开皮肤，用眼科镊分开皮下组织；
30.看到气管后，沿右侧分离，看到颈总动脉后，分离颈总动脉并找到颈内、外分支，结扎颈总动脉近心端，用动脉夹子夹住颈总、颈外动脉；
31.靠近结扎处远心端用显微剪剪一个小口，显微镊持线栓迅速插入，切口远心端血管外结扎固定线栓,拿掉夹在颈总、颈外动脉的夹子；
32.继续插入线栓，有阻力时即可停止，结扎固定线栓以防线栓脱落。操作过程中给大鼠保暖，消毒缝合并记录。
33.实施例2：原代培养海马神经元及ogd/r细胞损伤模型：
34.在一实施方式中，此法可模拟在体脑缺血模型，又称离体缺血模型。
35.具体的，在一实施方式中，使用三气培养箱，通过直接通入n2的方式精确控制培养箱内co2和o2浓度，同时剥夺神经元培养基中的糖，从而造成培养神经元缺氧缺糖的环境，模拟在体脑缺血的情况。
36.将孕18d胎鼠海马制备的海马神经元悬液接种于细胞培养皿中培养，神经元培养基(含2％b27)培养7天后，弃去培养皿中的细胞培养基并用无糖培养基代替。然后置于低氧工作站(1％o2、5％co2、94％n2)中进行缺氧培养45min。培养皿移出三气培养箱，然后将无糖培养基换成含糖细胞培养基并置于原细胞培养箱正常培养不同时间后进行检测。
37.实施例3：mtt比色法检测海马神经元活力
38.将海马神经元以5
×
104/ml的密度接种于96孔培养板中，培养7d后，分别ogd 0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，然后每孔加入10μl(5mg/ml)的mtt，于37℃培养箱中孵育4h。
39.4h后取出培养板每孔加入20％sds100μl，再置于37℃孵育20h。
40.用酶标仪在570nm波长下检测各孔的光密度值(od)值。实验要重复3次，且每次实验各组分别设6个复孔。
41.以正常对照组的细胞活力为100％，计算各实验组细胞的存活百分率。公式＝[细胞存活百分率(％)＝(损伤组细胞活力
÷
正常对照组细胞活力)
×
100％]。
[0042]
实施例4：半影区组织和细胞rna提取及klf14基因表达检测(realtime-pcr)
[0043]
选取模型成功的大鼠，快速取脑，用生理盐水洗去表面的血迹，在-20℃冷冻20min。
[0044]
参考ashwals等的方法加以改进。在距离额叶前端3mm和9mm处行冠状切片，取中间6mm厚的组织块，前端和后端各切1mm冠状切片，用于ttc染色(37℃水浴避光染色30min)进一步确认大脑梗死情况和判断取样部位。请参阅图1，图1表明大鼠脑切片ttc染色以及mcao/r损伤大鼠梗死区组织中转录因子klf14基因表达显著增加。
[0045]
余下的4mm脑块，缺血侧距矢状缝约2mm处从上到下切去同侧半球的正中结构(此区域由大脑前动脉供血，弃去)，余下的缺血侧脑块，沿矢状切面旁2mm处，并和矢状切面呈30
°
斜切，其中外侧皮层为缺血梗死区，内侧皮层为缺血半暗区。按invitrogen公司trizolreagent说明书进行。realtime-pcr采用takara公司的sybrprimescriptrt-pcrkit，操作按试剂盒说明书进行(gapdh为内参)。
[0046]
结果如图2所示，图2中表明原代海马神经元ogd/r损伤后转录因子klf14表达显著增加。转录因子klf14对ogd/r损伤神经元有保护作用。
[0047]
本技术中通过证实大脑中动脉栓塞/复灌(middlecerebralartery occlusion/reperfusion,mcao/r)损伤大鼠脑组织中klf14显著高表达。体外原代培养海马神经元经(oxygenandglucosedeprivation/reoxygenation,ogd/r)损伤后klf14表达显著增加；敲低或过表达调控klf14的表达，结果提示klf14对ogd/r损伤神经元中具有保护作用。本发明为预治急性缺血性脑卒中后提供了新思路，为开发神经保护剂提供了新的靶点。

技术特征：
1.一种转录因子klf14在制备防治缺血性脑卒中产品中的应用。2.根据权利要求1所述的转录因子klf14在制备防治缺血性脑卒中产品中的应用，其特征在于：所述转录因子klf14对ogd/r损伤的海马神经元中提供保护作用。3.一种防治缺血性脑卒中的产品，其特征在于：包括转录因子klf14。4.一种大鼠局灶性脑缺血再灌注mcao/r损伤模型的建立方法，其特征在于：使用sd大鼠大脑中动脉线栓法建立脑缺血再灌注损伤模型。5.根据权利要求4所述的一种大鼠局灶性脑缺血再灌注mcao/r损伤模型的建立方法，其特征在于：选用250-280gsd小鼠在大鼠称重腹腔麻醉后，将大鼠固定在操作台上，备皮，消毒后沿颈正中线剪开皮肤，用眼科镊分开皮下组织；看到气管后，沿右侧分离，看到颈总动脉后，分离颈总动脉并找到颈内、外分支，结扎颈总动脉近心端，用动脉夹子夹住颈总、颈外动脉；靠近结扎处远心端用显微剪剪一个小口，显微镊持线栓迅速插入，切口远心端血管外结扎固定线栓,拿掉夹在颈总、颈外动脉的夹子；继续插入线栓，有阻力时即可停止，结扎固定线栓以防线栓脱落。6.根据权利要求5所述的一种大鼠局灶性脑缺血再灌注mcao/r损伤模型的建立方法，其特征在于：模型建立过程中给大鼠保暖，模型建立完成后消毒缝合并记录。

技术总结
本发明提供一种转录因子KLF14在制备防治缺血性脑卒中产品中的应用，涉及生物医学技术领域，现有的针对脑缺血损伤机制中某一靶点开发的候选药物临床试验均失败。通过研究新的病理机制，探寻新的防治靶点，是科研人员一直努力的方向。KLF14为一种转录因子，可以调控。本发明证实大脑中动脉栓塞/复灌(Middlecerebralarteryocclusion/reperfusion,MCAO/R)损伤大鼠脑组织中KLF14显著高表达。体外原代培养海马神经元经(oxygenandglucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)损伤后KLF14表达显著增加；敲低或过表达调控KLF14的表达，结果提示KLF14对OGD/R损伤神经元中具有保护作用。本发明为预治急性缺血性脑卒中后提供了新思路，为开发神经保护剂提供了新的靶点。开发神经保护剂提供了新的靶点。开发神经保护剂提供了新的靶点。


技术研发人员：陈霞 秦健鑫 周利宏 邓爱清 余蕾
受保护的技术使用者：南通大学
技术研发日：2023.06.14
技术公布日：2023/8/9