家蝇抗菌肽AMP-17抑制铜绿假单胞菌的研究方法

家蝇抗菌肽amp-17抑制铜绿假单胞菌的研究方法
技术领域
1.本发明涉及家蝇抗菌肽amp-17的应用技术领域，具体为家蝇抗菌肽amp-17抑制铜绿假单胞菌的研究方法。


背景技术：

2.铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa，p.a)属于非发酵型革兰氏阴性杆菌，是医院内获得性感染中最常见的一种条件致病菌，可引起肺炎、尿路感染以及菌血症。当人体免疫功能低下时，例如在严重烧伤患者、癌症病人、术后患者以及免疫缺陷病毒感染的患者中可引起严重感染。2021年chinet中国细菌耐药性监测数据显示，从301917份临床分离的标本中检出革兰氏阴性菌占71.4％，其中铜绿假单胞菌以7.96％排名第四位。在西班牙的一项研究中，从357名急性白血病合并血流感染的患者体内共分离出110种多重耐药菌，其中以铜绿假单胞菌为主，整体死亡率达14.8％。在美国，10％～30％的铜绿假单胞菌分离株对碳青霉烯类抗生素耐药，同时也是引起呼吸机相关性肺炎的主要病原体。抗生素的广泛使用、过度使用和滥用与抗微生物药物耐药性的爆炸性增长有关，铜绿假单胞菌也因多重耐药和泛耐药被世界卫生组织(world health organization,who)于2017年列入对人类健康构成最大威胁的全球优先病原体名单。因此，解决铜绿假单胞菌多重耐药问题已成为当务之急。
3.因此，研究和开发新型抗菌药物以解决日益严重的铜绿假单胞菌耐药问题已迫在眉睫，而抗菌肽是一个选择。
4.抗菌肽(antimicrobial peptide，amp)是生物体内一些具有抗菌活性的小分子多肽，在机体受感染或免疫刺激的诱导下产生，具有独特的抗菌机制及抑菌活性，对细菌、真菌、病毒、原虫以及肿瘤细胞等都具有一定的杀灭活性，部分具有免疫调节功能的抗菌肽甚至能够促进伤口愈合。有研究表明，昆虫抗菌多肽在抗药性发展方面优于单个肽和小分子抗生素，其独特的抗菌机制可减少细菌耐药性的产生。随着抗生素的滥用和超级耐药细菌的产生，昆虫抗菌肽已成为设计和开发新型抗菌药物的重要资源。
5.家蝇可作为抗菌肽研发的重要资源。已报道的与家蝇有关的抗菌肽包括攻击素(attacin)、天蚕素(cecropin)、防御素(defensin)、溶菌酶(lysozyme)、双翅肽(diptericin)等。目前，国内外对于家蝇抗菌肽的研究主要集中在分离、纯化和抗菌功能方面，对于抗菌机制的研究主要是针对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、沙门菌和真菌，而关于家蝇抗菌肽对于铜绿假单胞菌的抗菌活性和作用机制尚未有报道。
6.在前期研究中，课题组对家蝇3龄幼虫的全虫转录组进行测序，在转录组测序数据库中筛选出一条对家蝇免疫防御发挥积极作用且特异性高表达的基因，利用基因工程的方法成功合成出重组蛋白并命名为家蝇抗菌肽amp-17(musca domestica antimicrobial pepitides-17，amp-17)，且对amp-17基因进行了克隆表达、抗菌活性及时空表达模式的研究。有研究发现抗菌肽可以与菌体细胞外膜、细胞内膜相互作用，从而破坏膜结构引起细菌死亡，那抗菌肽amp-17是否也可通过类似机制发挥抗细菌活性？因此，将抗菌肽amp-17作用
于金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌及铜绿假单胞菌，结果显示均有抑制作用，其中对铜绿假单胞菌抑制作用较为明显，且对临床分离的耐药铜绿假单胞菌仍有较好的抗菌活性。
7.但现有技术中，抗菌肽amp-17通过哪些途径发挥抗菌作用、是否破坏细菌细胞膜结构，其抗菌作用机制尚未可知，因此需要对以上问题提出一种新的解决方案。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供家蝇抗菌肽amp-17抑制铜绿假单胞菌的研究方法，以解决背景技术中提出的问题。
9.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：家蝇抗菌肽amp-17抑制铜绿假单胞菌的研究方法，至少包括以下步骤：
10.s1：进行抗菌活性的检测，所述抗菌活性的检测至少包括抗菌肽amp-17对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度测试、生长曲线的检测、单位时间下杀菌曲线记录、抑制生物被膜形成实验、清除成熟生物被膜实验和绿脓菌素的测定；
11.s2：进行amp-17抗菌机制研究，所述amp-17抗菌机制研究至少包括扫描电子显微镜、透射电子显微镜、活死菌比例、外膜通透性、内膜通透性、活性氧水平检测；
12.s3：实验每组3个平行重复，所有数据经graph pad prism 8.0.1处理后用平均值
±
标准差表示，t检验分析两组间差异，定义p＜0.05为差异具有显著性。
13.优选的，所述抗菌肽amp-17对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度测试至少包括如下步骤：
14.将菌液在mhb肉汤培养基上转种2次，确保细菌的纯度及活力；
15.取1个单克隆菌落接种于lb液体培养基中培养至对数生长期，使用细菌比浊仪将菌悬液调至1
×
106cfu/ml备用；
16.将不同浓度的amp-17与1.0
×
106cfu/ml菌悬液在96孔板中于37℃共同培养16～18小时；
17.从判定为mic的孔及高于该孔药物浓度的孔中取100μl菌液稀释到合适浓度后在lb固体培养基上均匀涂布，37℃培养24小时，以lb固体平板上无细菌生长所对应的抗菌肽浓度为mbc。
18.优选的，所述生长曲线的检测至少包括以下步骤：制备1.0
×
106cfu/ml菌悬液，将菌悬液加入96孔板中；
19.与不同浓度的amp-17共同置于37℃孵育24小时，每小时测定一次630nm处的吸光度值，记录结果并绘制生长曲线；
20.以4μg/ml多粘菌素b作为阳性对照，无菌mhb作为空白对照，添加菌悬液的mhb培养基为阴性对照；
21.所述单位时间下杀菌曲线记录至少包括以下步骤：以铜绿假单胞菌cmcc 10104作为模型菌株，研究amp-17随时间变化对该菌作用的影响，将25μg/ml的amp-17和50μg/ml的amp-17与1
×
106cfu/ml的菌悬液在37℃下孵育24h；
22.当孵育0、1、2、4、6、8、10、12、24h时，从中取10μl经amp-17作用的菌悬液以十倍稀释度在mhb培养基中连续稀释至适当浓度；
23.吸取5μl稀释液在lb固体平板上点样，待菌落长出后计数菌落数并绘制单位时间下杀菌曲线。
24.优选的，所述抑制生物被膜形成实验至少包括以下步骤：
25.制备1.0
×
107cfu/ml菌悬液，并采用tsb培养基重悬，将重悬后的菌悬液与3.125μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml的amp-17在96孔板内于37℃共同孵育24h，以无菌的tsb培养基为空白对照，以添加菌悬液的mhb培养基为阴性对照；
26.育完成后弃上清，用无菌pbs轻柔洗涤板孔1～2次除去游离菌；
27.随后加入甲醇固定15min，吸出固定液风干后用0.1％结晶紫染色30min，用无菌pbs清洗1～2次以除去残留结晶紫；
28.最后加入无水乙醇，37℃孵育30min溶解结晶紫，使用多功能酶标仪测量595nm处的吸光度检测生物膜质量。
29.优选的，所述清除成熟生物被膜实验至少包括以下步骤：
30.将过夜生长的铜绿假单胞菌用tsb培养基配置成终浓度为1
×
107cfu/ml的菌悬液，37℃培养24h；
31.以无菌的tsb培养基为空白对照，以添加菌悬液的mhb培养基为阴性对照，用无菌pbs洗去游离菌后，取200μl不同浓度的amp-17加入孔中，37℃温箱培养2h；
32.采用结晶紫染色法检测生物被膜在595nm处的吸光度值，并按下列公式计算成熟生物被膜的清除率：
33.成熟生物被膜清除率(％)＝[1-(实验组od
595
－阴性对照组od
595
)/(阳性对照组od
595
－阴性对照组od
595
)]
×
100％。
[0034]
优选的，所述绿脓菌素的测定至少包括以下步骤：
[0035]
配制1
×
108cfu/ml菌悬液，加入amp-17使其终浓度为25μg/ml和50μg/ml，37℃温箱孵育24h；
[0036]
培养结束后吸取5ml样品，5000rpm/min的转速下离心10min，收集上清液并置于高压灭菌后的15ml离心管中，加入5ml氯仿后静置5～8min后获得溶液；
[0037]
将所述溶液充分涡旋震荡，4500rpm/min离心10min，弃上清，将下层呈现蓝色的氯仿相倒入新的15ml离心管，加入0.2mol/l盐酸1ml，静置30min，涡旋振荡10次至其充分萃取，4500rpm/min离心8min，收集此时呈现粉色的上清液并将其置于96孔板；
[0038]
用多功能酶标仪在520nm处测量吸光度值，并按下列公式计算每毫升上清产生的绿脓菌素：
[0039]
绿脓菌素含量(mg/ml)＝od
520
×
17.072。
[0040]
优选的，所述扫描电子显微镜至少包括以下步骤：
[0041]
制备1.0
×
108cfu/ml菌悬液，与终浓度为50μg/ml amp-17在37℃下处理8h，以加入无菌pbs组为阴性对照，4000rpm离心10min，收集菌体；
[0042]
用无菌pbs洗涤菌细胞1次，弃去上清用2.5％戊二醛重悬并于4℃避光固定过夜；
[0043]
固定后的样品用30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％乙醇进行梯度脱水处理；
[0044]
脱水后对菌细胞减压干燥，并用离子喷溅仪喷金，用扫描电子显微镜进行观察并采集图片；
[0045]
所述透射电子显微镜至少包括以下步骤：
[0046]
参照扫描电镜的方法制备样品，样品以4000rpm/min离心10min后弃上清，加入2.5％戊二醛并于4℃避光固定过夜；
[0047]
用1％锷酸于4℃固定2h，随后用乙醇梯度脱水，每次20min，100％丙酮两次，每次15min；
[0048]
用epon812包埋剂进行浸透包埋，用切片机制备超薄切片，以醋酸双氧铀和硝酸铅双染，用透射电子显微镜进行观察并拍照；
[0049]
所述活死菌比例至少包括以下步骤：将25μg/ml和50μg/ml的amp-17与1.0
×
108cfu/ml菌悬液于37℃共同孵育8h，以添加菌悬液的无菌pbs为对照组；
[0050]
孵育完成后向各组加入终浓度为5μm syto9和10μmpi染料，37℃避光孵育15min，孵育完成后洗去未结合的荧光染料并添加防荧光淬灭剂，将样本涂布载玻片后利用激光共聚焦显微镜在488nm和561nm处采集图像。
[0051]
所述外膜通透性至少包括以下步骤：将25μg/ml和50μg/mlamp-17溶液与1.0
×
108cfu/ml铜绿假单胞菌菌悬液在37℃于96孔避光板中共同孵育，随后加入终浓度为10μm的n－苯基-1－萘胺染料避光染色，用多功能酶标仪测定荧光强度，激发波长和发射波长分别为350nm和420nm；
[0052]
所述内膜通透性至少包括以下步骤：将25μg/ml和50μg/ml的amp-17溶液与1
×
108cfu/ml铜绿假单胞菌菌悬液在37℃于96孔避光板中共同孵育12h，在96孔避光板中加入终浓度为10μm的pi染料避光染色，用多功能酶标仪测定荧光强度，每2h检测一次，连续监测12h，激发波长和发射波长分别为622nm和670nm；
[0053]
所述活性氧水平检测至少包括以下步骤：将1.0
×
108cfu/ml的菌悬液与不同浓度的amp-17在37℃作用1h，样本前5min检测本底荧光强度，随后加入2’,7’－二氯二氢荧光素二乙酸酯连续监测1h；
[0054]
采用多功能酶标仪实时监测荧光强度，激发光和发射光波长分别为485nm和528nm。
[0055]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0056]
本发明通过观察经药物作用后细菌胞外形态、胞内结构、活死菌比例、外膜渗透性、内膜通透性等改变，从形态结构和分子水平方向对抗菌肽amp-17对铜绿假单胞菌抗菌机制进行更便捷的研究，为设计具有良好抗菌活性的肽类抗生素提供新思路，为新型抗菌药物的开发奠定基础，为临床治疗提供新方向。
附图说明
[0057]
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0058]
图1为本发明amp-17对p.a cmcc 10104生长曲线的影响的示意图；
[0059]
图2为本发明amp-17对p.a cmcc 10104的杀菌动力学曲线的示意图；
[0060]
图3为本发明amp-17对p.a cmcc 10104的生物被膜的影响的示意图；
[0061]
图4为本发明amp-17对p.a cmcc 10104绿脓菌素产生量的影响的示意图；
[0062]
图5为本发明amp-17处理的铜绿假单胞菌扫描电镜图；
[0063]
图6为本发明amp-17处理的铜绿假单胞菌透射电镜图；
[0064]
图7为本发明激光共聚焦显微镜观察amp-17对p.a cmcc 10104活死菌比例的影响的示意图；
[0065]
图8为本发明amp-17对p.a cmcc 10104外膜通透性的影响的示意图；
[0066]
图9为本发明amp-17对p.a cmcc 10104内膜通透性的影响的示意图；
[0067]
图10为本发明amp-17诱发p.a cmcc 10104活性氧的积累的示意图。
具体实施方式
[0068]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0069]
实施例一：
[0070]
家蝇抗菌肽amp-17抑制铜绿假单胞菌的研究方法，至少包括以下步骤：
[0071]
s1：进行抗菌活性的检测，抗菌活性的检测至少包括抗菌肽amp-17对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度测试、生长曲线的检测、单位时间下杀菌曲线记录、抑制生物被膜形成实验、清除成熟生物被膜实验和绿脓菌素的测定；
[0072]
s2：进行amp-17抗菌机制研究，amp-17抗菌机制研究至少包括扫描电子显微镜、透射电子显微镜、活死菌比例、外膜通透性、内膜通透性、活性氧水平检测；
[0073]
s3：实验每组3个平行重复，所有数据经graph pad prism 8.0.1处理后用平均值
±
标准差表示，t检验分析两组间差异，定义p＜0.05为差异具有显著性。
[0074]
抗菌肽amp-17对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度测试至少包括如下步骤：
[0075]
将菌液在mhb肉汤培养基上转种2次，确保细菌的纯度及活力；
[0076]
取1个单克隆菌落接种于lb液体培养基中培养至对数生长期，使用细菌比浊仪将菌悬液调至1
×
106cfu/ml备用；
[0077]
将不同浓度的amp-17与1.0
×
106cfu/ml菌悬液在96孔板中于37℃共同培养16～18小时；
[0078]
从判定为mic的孔及高于该孔药物浓度的孔中取100μl菌液稀释到合适浓度后在lb固体培养基上均匀涂布，37℃培养24小时，以lb固体平板上无细菌生长所对应的抗菌肽浓度为mbc。
[0079]
生长曲线的检测至少包括以下步骤：制备1.0
×
106cfu/ml菌悬液，将菌悬液加入96孔板中；
[0080]
与不同浓度的amp-17共同置于37℃孵育24小时，每小时测定一次630nm处的吸光度值，记录结果并绘制生长曲线；
[0081]
以4μg/ml多粘菌素b作为阳性对照，无菌mhb作为空白对照，添加菌悬液的mhb培养基为阴性对照；
[0082]
单位时间下杀菌曲线记录至少包括以下步骤：以p.a cmcc 10104作为模型菌株，研究amp-17随时间变化对该菌作用的影响，将25μg/ml的amp-17和50μg/ml的amp-17与1
×
106cfu/ml的菌悬液在37℃下孵育24h；
[0083]
当孵育0、1、2、4、6、8、10、12、24h时，从中取10μl经amp-17作用的菌悬液以十倍稀释度在mhb培养基中连续稀释至适当浓度；
[0084]
吸取5μl稀释液在lb固体平板上点样，待菌落长出后计数菌落数并绘制单位时间下杀菌曲线。
[0085]
抑制生物被膜形成实验至少包括以下步骤：
[0086]
制备1.0
×
107cfu/ml菌悬液，并采用tsb培养基重悬，将重悬后的菌悬液与3.125μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml的amp-17在96孔板内于37℃共同孵育24h，以无菌的tsb培养基为空白对照，以添加菌悬液的mhb培养基为阴性对照；
[0087]
育完成后弃上清，用无菌pbs轻柔洗涤板孔1～2次除去游离菌；
[0088]
随后加入甲醇固定15min，吸出固定液风干后用0.1％结晶紫染色30min，用无菌pbs清洗1～2次以除去残留结晶紫；
[0089]
最后加入无水乙醇，37℃孵育30min溶解结晶紫，使用多功能酶标仪测量595nm处的吸光度检测生物膜质量。
[0090]
清除成熟生物被膜实验至少包括以下步骤：
[0091]
将过夜生长的铜绿假单胞菌用tsb培养基配置成终浓度为1
×
107cfu/ml的菌悬液，37℃培养24h；
[0092]
以无菌的tsb培养基为空白对照，以添加菌悬液的mhb培养基为阴性对照，用无菌pbs洗去游离菌后，取200μl不同浓度的amp-17加入孔中，37℃温箱培养2h；
[0093]
采用结晶紫染色法检测生物被膜在595nm处的吸光度值，并按下列公式计算成熟生物被膜的清除率：
[0094]
成熟生物被膜清除率(％)＝[1-(实验组od
595
－阴性对照组od
595
)/(阳性对照组od
595
－阴性对照组od
595
)]
×
100％。
[0095]
绿脓菌素的测定至少包括以下步骤：
[0096]
配制1
×
108cfu/ml菌悬液，加入amp-17使其终浓度为25μg/ml和50μg/ml，37℃温箱孵育24h；
[0097]
培养结束后吸取5ml样品，5000rpm/min的转速下离心10min，收集上清液并置于高压灭菌后的15ml离心管中，加入5ml氯仿后静置5～8min后获得溶液；
[0098]
将溶液充分涡旋震荡，4500rpm/min离心10min，弃上清，将下层呈现蓝色的氯仿相倒入新的15ml离心管，加入0.2mol/l盐酸1ml，静置30min，涡旋振荡10次至其充分萃取，4500rpm/min离心8min，收集此时呈现粉色的上清液并将其置于96孔板；
[0099]
用多功能酶标仪在520nm处测量吸光度值，并按下列公式计算每毫升上清产生的绿脓菌素：
[0100]
绿脓菌素含量(mg/ml)＝od
520
×
17.072。
[0101]
扫描电子显微镜至少包括以下步骤：
[0102]
制备1.0
×
108cfu/ml菌悬液，与终浓度为50μg/ml amp-17在37℃下处理8h，以加入无菌pbs组为阴性对照，4000rpm离心10min，收集菌体；
[0103]
用无菌pbs洗涤菌细胞1次，弃去上清用2.5％戊二醛重悬并于4℃避光固定过夜；
[0104]
固定后的样品用30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％乙醇进行梯度脱水处
理；
[0105]
脱水后对菌细胞减压干燥，并用离子喷溅仪喷金，用扫描电子显微镜进行观察并采集图片；
[0106]
透射电子显微镜至少包括以下步骤：
[0107]
参照扫描电镜的方法制备样品，样品以4000rpm/min离心10min后弃上清，加入2.5％戊二醛并于4℃避光固定过夜；
[0108]
用1％锷酸于4℃固定2h，随后用乙醇梯度脱水，每次20min，100％丙酮两次，每次15min；
[0109]
用epon812包埋剂进行浸透包埋，用切片机制备超薄切片，以醋酸双氧铀和硝酸铅双染，用透射电子显微镜进行观察并拍照；
[0110]
活死菌比例至少包括以下步骤：将25μg/ml和50μg/ml的amp-17与1.0
×
108cfu/ml菌悬液于37℃共同孵育8h，以添加菌悬液的无菌pbs为对照组；
[0111]
孵育完成后向各组加入终浓度为5μm syto9和10μm pi染料，37℃避光孵育15min，孵育完成后洗去未结合的荧光染料并添加防荧光淬灭剂，将样本涂布载玻片后利用激光共聚焦显微镜在488nm和561nm处采集图像。
[0112]
外膜通透性至少包括以下步骤：将25μg/ml和50μg/ml amp-17溶液与1.0
×
108cfu/ml铜绿假单胞菌菌悬液在37℃于96孔避光板中共同孵育，随后加入终浓度为10μm的n－苯基-1－萘胺染料避光染色，用多功能酶标仪测定荧光强度，激发波长和发射波长分别为350nm和420nm；
[0113]
内膜通透性至少包括以下步骤：将25μg/ml和50μg/ml的amp-17溶液与1
×
108cfu/ml铜绿假单胞菌菌悬液在37℃于96孔避光板中共同孵育12h，在96孔避光板中加入终浓度为10μm的pi染料避光染色，用多功能酶标仪测定荧光强度，每2h检测一次，连续监测12h，激发波长和发射波长分别为622nm和670nm；
[0114]
活性氧水平检测至少包括以下步骤：将1.0
×
108cfu/ml的菌悬液与不同浓度的amp-17在37℃作用1h，样本前5min检测本底荧光强度，随后加入2’,7’－二氯二氢荧光素二乙酸酯连续监测1h；
[0115]
采用多功能酶标仪实时监测荧光强度，激发光和发射光波长分别为485nm和528nm。
[0116]
实施例二：
[0117]
主要仪器及设备：
[0118]
表1主要仪器
[0119]
[0120][0121]
实验菌株：
[0122]
收集2022年贵州医科大学第二附属医院住院患者临床样本分离的多重耐药性铜绿假单胞菌10株，剔除来自同一患者的重复样本，按铜绿假单胞菌学名pseudomonas aeruginosa的缩写p.a与收集序号将临床分离的菌株命名为p.a 01～10。细菌的鉴定与药敏试验采用法国生物梅里埃2compact全自动微生物分析系统进行分析。p.a cmcc 10104由贵州医科大学现代病原生物学重点特色实验室保存。
[0123]
amp-17对p.a cmcc 10104的抗菌活性检测
[0124]
为评估amp-17对铜绿假单胞菌的药物敏感性，从临床收集了10株多重耐药及泛耐药铜绿假单胞菌作为指示菌，经检测，临床分离的铜绿假单胞菌对头孢菌素类、碳青霉烯类、氨基糖苷类、喹诺酮类和多肽类这5类常用的抗生素呈现出不同程度的耐药性(表1)。此外，amp-17对p.acmcc 10104及临床收集了10株多重耐药及泛耐药铜绿假单胞菌的mic值均为25μg/ml，mbc均为50μg/ml。
[0125]
表2多种抗菌药物对铜绿假单胞菌的mic值生长曲线的检测：
[0126][0127]
参阅图1，未经amp-17处理的对照组中p.a cmcc 10104生长曲线呈“s”型,在16小时后细菌生长到达静止期。经25μg/ml(1
×
mic)的amp-17作用后，p.a cmcc 10104生长在10h内受到抑制，当使用50μg/ml(2
×
mic)的amp-17处理后，培养至24h p.a cmcc 10104没有增长
[0128]
杀菌动力学：
[0129]
参阅图2，amp-17对p.a cmcc 10104的杀菌动力学显示：amp-17以浓度和时间依赖性方式杀死铜绿假单胞菌，在2
×
mic的抗菌肽浓度作用下，amp-17对铜绿假单胞菌持续抑制，在10h内杀灭铜绿假单胞菌，且随后的14小时内无细菌生长，杀菌效果无反弹。
[0130]
amp-17对p.a cmcc 10104生物被膜的影响：
[0131]
抑制生物被膜形成的结果如图3a所示，12.5μg/ml的amp-17即可抑制铜绿假单胞菌生物被膜的形成。而当amp-17浓度达到12.5μg/ml时，生物被膜的清除效果与对照组相较(图3b)，差异有统计学意义，提示amp-17对铜绿假单胞菌形成的成熟生物被膜具有良好的清除作用。采用激光共聚焦显微镜采集图像，结果如图3c所示，可以更加直观看出经50μg/ml的amp-17作用后，铜绿假单胞菌生物被膜形态无法维持，细菌数量减少，视野中出现大量浮游态细菌。
[0132]
绿脓菌素含量的检测：
[0133]
本实验采用氯仿盐酸法抽提绿脓菌素并对其含量进行检测，实验结果如图4所示，与未经抗菌肽amp-17处理的菌株相比，随着amp-17浓度的增大，各组绿脓菌素产生量明显减少。
[0134]
amp-17对p.a cmcc 10104抗菌机制研究：
[0135]
扫描电子显微镜观察细菌形态：
[0136]
参阅图5，如前所述，为了可视化amp-17对铜绿假单胞菌的细胞膜的损伤作用，通过扫描电镜，直接观察经amp-17处理24h后的菌体形态变化。amp-17未处理的菌体(见图5a和图5c)形态完整，菌细胞具有平整而无损的表面。经50μg/ml amp-17处理24h之后的铜绿假单胞菌细胞明显受到了损伤(见图5b和图5d)，菌细胞出现聚集，菌体表面破裂从而呈现不规则形状，有的菌体出现裂口并伴随菌体溶解现象，细胞内容物外泄，提示铜绿假单胞菌菌体的完整性遭受损伤。
[0137]
透射电子显微镜观察细菌内部结构：
[0138]
采用透射电子显微镜观察amp-17对细菌细胞膜和内部结构的影响，结果如图6所示。未经amp-17处理的对照组，细菌菌体形态饱满，细胞膜层次分明且结构清晰而完整，内部结构致密。经amp-17(50μg/ml)处理的菌体形态发生明显变化，细菌菌体呈现不规则形态，细胞膜完整性受到破坏，细胞内出现空腔改变，提示细胞内容物往外流出，表明amp-17对铜绿假单胞菌内部结构具有破坏作用。
[0139]
活死菌比例：
[0140]
本实验采用荧光染色的方法对p.a cmcc 10104进行标记，使用激光共聚焦显微镜采集图像。将syto9与pi按适当比例相混合，在激发光和发射光的照射下，膜结构完整的细菌仅发出绿色荧光，而膜受损的细菌能发出红色荧光。如图7所示，未经amp-17处理的细菌细胞几乎都是活的，视野中出现大量绿色荧光。经25μg/ml的amp-17处理后，视野中红色荧光逐渐增加，提示细菌细胞膜受损，细菌开始死亡。经50μg/ml的amp-17处理后，视野中所有细菌均发红色荧光。这一结果表明，高浓度的amp-17能在同一时间点发挥快速杀菌的效果，抗菌效果具有剂量依赖性。
[0141]
amp-17对p.a cmcc 10104外膜通透性的影响：
[0142]
本实验采用n－苯基-1－萘胺(npn)荧光探针来测定经amp-17作用后铜绿假单胞菌的外膜通透性改变，当细胞外膜受损时，npn可以进入到细胞外膜磷脂层，样本中荧光强度增强。如图8所示，前5min内对未加抗菌肽的样本进行荧光检测，样本荧光值几乎不变。在第5min时加入amp-17后，反应体系中的荧光强度逐渐增强，并且荧光强度的增加与amp-17浓度相关。上述结果提示，amp-17对铜绿假单胞菌的细胞外膜具有较快的破坏作用，破坏外膜的程度具有剂量依赖性。
[0143]
amp-17对p.a cmcc 10104内膜通透性的影响：
[0144]
amp-17对铜绿假单胞菌内膜的通透性改变采用pi荧光探针进行检测。如图9所示，随着抗菌药物作用时间的延长，荧光强度增加，提示细菌对pi的摄取率增加，内膜通透性增加。
[0145]
amp-17对p.a cmcc 10104中活性氧(ros)的积累：
[0146]
许多抗菌肽能诱导ros的产生，大剂量的ros会给细胞带来不可逆的损伤，超出细胞的抗氧化时导致细胞蛋白质、脂质以及dna产生一定的破坏，最终导致细胞的死亡。
[0147]
无荧光的dcfh-da能够自由进入铜绿假单胞菌细胞膜并被酯酶水解生成dcfh，dcfh无法自由穿过细菌细胞膜从而留存在细菌细胞膜内。当菌细胞内ros积累时，无荧光的dcfh会被氧化生成有荧光的dcf，通过监测dcf的荧光强度就能间接了解细菌菌体细胞内
ros的含量。n－乙酰半胱氨酸(n-acetylcysteine，nac)是活性氧清除剂，能够调控ros对细菌的影响。
[0148]
结果如图10显示，铜绿假单胞菌暴露在amp-17下会导致细菌ros水平呈现上升趋势。与25μg/ml组相比，50μg/ml的amp-17可以诱导铜绿假单胞菌细胞中更高浓度ros的积累，并且随着时间的增加，铜绿假单胞菌中的ros水平随之增加。将nac与铜绿假单胞菌作用后，加入amp-17作用1h发现dcf的荧光强度与不加肽的对照组无差异。上述结果提示amp-17的存在能够诱导ros的产生。
[0149]
家蝇抗菌肽amp-17通过增加膜通透性、破坏菌体形态和膜流动性、导致细胞内容物外流、降低绿脓菌素产生量、诱发氧化应激反应从而对铜绿假单胞菌发挥抗菌作用。
[0150]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

技术特征：
1.家蝇抗菌肽amp-17抑制铜绿假单胞菌的研究方法，其特征在于：至少包括以下步骤：s1：进行抗菌活性的检测，所述抗菌活性的检测至少包括抗菌肽amp-17对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度测试、生长曲线的检测、单位时间下杀菌曲线记录、抑制生物被膜形成实验、清除成熟生物被膜实验和绿脓菌素的测定；s2：进行amp-17抗菌机制研究，所述amp-17抗菌机制研究至少包括扫描电子显微镜、透射电子显微镜、活死菌比例、外膜通透性、内膜通透性、活性氧水平检测；s3：实验每组3个平行重复，所有数据经graph pad prism 8.0.1处理后用平均值
±
标准差表示，t检验分析两组间差异，定义p＜0.05为差异具有显著性。2.根据权利要求1所述的家蝇抗菌肽amp-17抑制铜绿假单胞菌的研究方法，其特征在于：所述抗菌肽amp-17对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度测试至少包括如下步骤：将菌液在mhb肉汤培养基上转种2次，确保细菌的纯度及活力；取1个单克隆菌落接种于lb液体培养基中培养至对数生长期，使用细菌比浊仪将菌悬液调至1
×
10
6 cfu/ml备用；将不同浓度的amp-17与1.0
×
10
6 cfu/ml菌悬液在96孔板中于37 ℃共同培养16～18小时；从判定为mic的孔及高于该孔药物浓度的孔中取100 μl菌液稀释到合适浓度后在lb固体培养基上均匀涂布，37℃培养24小时，以lb固体平板上无细菌生长所对应的抗菌肽浓度为mbc。3.根据权利要求1所述的家蝇抗菌肽amp-17抑制铜绿假单胞菌的研究方法，其特征在于：所述生长曲线的检测至少包括以下步骤：制备1.0
×
10
6 cfu/ml菌悬液，将菌悬液加入96孔板中；与不同浓度的amp-17共同置于37 ℃孵育24小时，每小时测定一次630 nm处的吸光度值，记录结果并绘制生长曲线；以4
ꢀµ
g/ml多粘菌素b作为阳性对照，无菌mhb作为空白对照，添加菌悬液的mhb培养基为阴性对照；所述单位时间下杀菌曲线记录至少包括以下步骤：将25
µ
g/ml的amp-17和50
µ
g/ml的amp-17与1
×
106cfu/ml的菌悬液在37℃下孵育24h；当孵育0、1、2、4、6、8、10、12、24h时，从中取10μl经amp-17作用的菌悬液以十倍稀释度在mhb培养基中连续稀释至适当浓度；吸取5μl稀释液在lb固体平板上点样，待菌落长出后计数菌落数并绘制单位时间下杀菌曲线。4.根据权利要求1所述的家蝇抗菌肽amp-17抑制铜绿假单胞菌的研究方法，其特征在于：所述抑制生物被膜形成实验至少包括以下步骤：制备1.0
×
107cfu/ml菌悬液，并采用tsb培养基重悬，将重悬后的菌悬液与3.125
µ
g/ml、6.25
µ
g/ml、12.5
µ
g/ml、25
µ
g/ml、50
µ
g/ml和100
µ
g/ml的amp-17在96孔板内于37℃共同孵育24h，以无菌的tsb培养基为空白对照，以添加菌悬液的mhb培养基为阴性对照；育完成后弃上清，用无菌pbs轻柔洗涤板孔1～2次除去游离菌；随后加入甲醇固定15min，吸出固定液风干后用0.1%结晶紫染色30min，用无菌pbs清洗
1～2次以除去残留结晶紫；最后加入无水乙醇，37℃孵育30 min溶解结晶紫，使用多功能酶标仪测量595nm处的吸光度检测生物膜质量。5.根据权利要求1所述的家蝇抗菌肽amp-17抑制铜绿假单胞菌的研究方法，其特征在于：所述清除成熟生物被膜实验至少包括以下步骤：将过夜生长的铜绿假单胞菌用tsb培养基配置成终浓度为1
×
107cfu/ml的菌悬液，37℃培养24h；以无菌的tsb培养基为空白对照，以添加菌悬液的mhb培养基为阴性对照，用无菌pbs洗去游离菌后，取200μl不同浓度的amp-17加入孔中，37℃温箱培养2h；采用结晶紫染色法检测生物被膜在595nm处的吸光度值，并按下列公式计算成熟生物被膜的清除率：成熟生物被膜清除率（%）=[1-（实验组od
595
－阴性对照组od
595
）/（阳性对照组od
595
－阴性对照组od
595
）]
×
100%。6.根据权利要求1所述的家蝇抗菌肽amp-17抑制铜绿假单胞菌的研究方法，其特征在于：所述绿脓菌素的测定至少包括以下步骤：配制1
×
108cfu/ml菌悬液，加入amp-17使其终浓度为25
µ
g/ml和50
µ
g/ml，37℃温箱孵育24h；培养结束后吸取5ml样品，5000rpm/min的转速下离心10min，收集上清液并置于高压灭菌后的15ml离心管中，加入5ml氯仿后静置5～8min后获得溶液；将所述溶液充分涡旋震荡，4500rpm/min离心10min，弃上清，将下层呈现蓝色的氯仿相倒入新的15ml离心管，加入0.2mol/l盐酸1ml，静置30min，涡旋振荡10次至其充分萃取，4500rpm/min离心8min，收集此时呈现粉色的上清液并将其置于96孔板；用多功能酶标仪在520nm处测量吸光度值，并按下列公式计算每毫升上清产生的绿脓菌素：绿脓菌素含量（mg/ml）= od
520
×
17.072。7.根据权利要求1所述的家蝇抗菌肽amp-17抑制铜绿假单胞菌的研究方法，其特征在于：所述扫描电子显微镜至少包括以下步骤：制备1.0
×
108cfu/ml菌悬液，与终浓度为50μg/mlamp-17在37℃下处理8h，以加入无菌pbs组为阴性对照，4000rpm离心10min，收集菌体；用无菌pbs洗涤菌细胞1次，弃去上清用2.5%戊二醛重悬并于4℃避光固定过夜；固定后的样品用30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇进行梯度脱水处理；脱水后对菌细胞减压干燥，并用离子喷溅仪喷金，用扫描电子显微镜进行观察并采集图片；所述透射电子显微镜至少包括以下步骤：参照扫描电镜的方法制备样品，样品以4000 rpm/min离心10min后弃上清，加入2.5%戊二醛并于4℃避光固定过夜；用1%锷酸于4℃固定2h，随后用乙醇梯度脱水，每次20min，100%丙酮两次，每次15min；用epon812包埋剂进行浸透包埋，用切片机制备超薄切片，以醋酸双氧铀和硝酸铅双染，用透射电子显微镜进行观察并拍照；
所述活死菌比例至少包括以下步骤：将25μg/ml和50μg/ml的amp-17与1.0
×
108cfu/ml菌悬液于37℃共同孵育8h，以添加菌悬液的无菌pbs为对照组；孵育完成后向各组加入终浓度为5μm syto9和10μm pi染料，37℃避光孵育15min，孵育完成后洗去未结合的荧光染料并添加防荧光淬灭剂，将样本涂布载玻片后利用激光共聚焦显微镜在488nm和561nm处采集图像。8.根据权利要求1所述的家蝇抗菌肽amp-17抑制铜绿假单胞菌的研究方法，其特征在于：所述外膜通透性至少包括以下步骤：将25μg/ml和50μg/ml amp-17溶液与1.0
×
10
8 cfu/ml铜绿假单胞菌菌悬液在37℃于96孔避光板中共同孵育，随后加入终浓度为10μm的n－苯基-1－萘胺染料避光染色，用多功能酶标仪测定荧光强度，激发波长和发射波长分别为350nm和420nm；所述内膜通透性至少包括以下步骤：将25μg/ml和50μg/ml的amp-17溶液与1
×
10
8 cfu/ml铜绿假单胞菌菌悬液在37℃于96孔避光板中共同孵育12h，在96孔避光板中加入终浓度为10μm的pi染料避光染色，用多功能酶标仪测定荧光强度，每2h检测一次，连续监测12h，激发波长和发射波长分别为622 nm和670nm；所述活性氧水平检测至少包括以下步骤：将1.0
×
10
8 cfu/ml的菌悬液与不同浓度的amp-17在37℃作用1h，样本前5min检测本底荧光强度，随后加入2’,7’－二氯二氢荧光素二乙酸酯连续监测1h；采用多功能酶标仪实时监测荧光强度，激发光和发射光波长分别为485nm和528nm。

技术总结
本发明公开了家蝇抗菌肽AMP-17抑制铜绿假单胞菌的研究方法，涉及家蝇抗菌肽AMP-17的应用技术领域。本发明通过观察经药物作用后细菌胞外形态、胞内结构、活死菌比例、外膜渗透性、内膜通透性等改变，从形态结构和分子水平方向对抗菌肽AMP-17对铜绿假单胞菌抗菌机制进行更便捷的研究，为设计具有良好抗菌活性的肽类抗生素提供新思路，为新型抗菌药物的开发奠定基础，为临床治疗提供新方向。为临床治疗提供新方向。为临床治疗提供新方向。


技术研发人员：陶如玉 田淳仁 石磊 国果 苏庭
受保护的技术使用者：贵州医科大学第二附属医院
技术研发日：2023.05.31
技术公布日：2023/8/9