一种PAS修饰的脂质纳米粒、包含其的药物制剂，及其制备方法和用途与流程

一种pas修饰的脂质纳米粒、包含其的药物制剂，及其制备方法和用途
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种pas修饰的脂质纳米粒、包含其的药物制剂，及其制备方法和用途。


背景技术：

2.脂质纳米粒(lipid nanoparticles,lnp)是以脂质作为主要组分的囊泡状的纳米载药系统，其生物相容性良好，在基因治疗领域对核酸药物的包封率高，一方面能够有效地保护核酸药物不被机体内广泛存在的生物酶降解失活，延长核酸药物的半衰期，另一方面还能通过膜融合作用介导细胞内吞，增加核酸药物的胞内递送，是近年来用于核酸药物递送的较为成熟的载体系统，其在基因编辑、传染病疫苗、肿瘤疫苗、遗传病治疗等领域均得到了广泛的研究及应用。
3.用于核酸药物递送的lnp通常包括可电离脂质、辅助磷脂、胆固醇和聚乙二醇(peg)化脂质，目前基于lnp递送体系的核酸药物上市品种均由这四种脂质材料组成。其中peg化脂质的亲水链在lnp的成型过程中会暴露在纳米粒的表面，形成一层保护性的水化层结构，不仅有助于维持lnp的物理稳定性，防止纳米粒聚集而引起粒径增大，还能在lnp进入体内后减少lnp与血浆蛋白的相互作用，延长纳米载体的循环时间，延长药物半衰期并增强药效。
[0004][0005][0006]
此外，当今社会的化妆品中大多含有聚乙二醇类的添加剂作为保湿剂和吸收促进剂等，也导致人体内抗-peg抗体普遍产生的可能性。peg修饰引起的这一现象目前也已得到国家药品监督管理局药品审评中心的关注，在最新发布的《脂质体药物非临床药代动力学研究技术指导原则》(征求意见稿)中已提到含有peg化脂质的脂质体需要特别关注abc现象及是否存在抗-peg抗体，还应对peg化脂质的脱落动力学进行研究，因此，peg化脂质的应用陷入了两难的境地。
[0007]
近年来有研究开始寻找peg化脂质的替代修饰方法，其中亲水性多肽pas修饰的脂质显示出了与peg修饰类似的延长半衰期的效果。pas是由脯氨酸(p)、丙氨酸(a)和丝氨酸(s)组成的多肽序列，此类多肽多为亲水性序列，不带电荷，能够形成与peg类似的保护性水化层，且通常不具备免疫原性。已有部分研究证实pas序列在常规脂质体、plga聚合物纳米粒、铁蛋白纳米粒等载药系统中进行修饰后，能够显著增加上述载药系统体内外稳定性，并延长载药系统的半衰期，因此pas具有替代peg对载药系统进行修饰的潜力，但目前还没有将pas修饰应用于核酸药物递送系统的研究报道。


技术实现要素：

[0008]
基于上述peg化脂质的应用缺陷，以及pas多肽类似peg修饰的特点，本发明设计使
用可电离脂质、辅助磷脂、胆固醇和pas脂质制备用于核酸药物递送的脂质纳米粒体系，pas修饰的脂质纳米粒(pas-lnp)不仅具备和peg-lnp类似的水化保护层，能够维持lnp良好的粒径分布、包封率和稳定性，还能有效避免进入体内后抗-peg抗体的产生，解决现有lnp体系产生abc现象潜在风险的技术缺陷，增加基因药物的治疗效果。
[0009]
本发明的目的之一是提供一种pas修饰的脂质纳米粒，其中pas是由脯氨酸(p)、丙氨酸(a)和丝氨酸(s)组成的亲水性多肽，用于核酸药物的递送。该pas修饰的脂质纳米粒的粒径分布良好，对核酸药物的包封率高，稳定性良好，具有高效的细胞转染效果和较高的安全性，在体内能够避免抗-peg抗体的产生以避免abc现象及peg可能引起的免疫原性，提高治疗效果及安全性。
[0010]
本发明的pas修饰的脂质纳米粒的技术方案如下：
[0011]
一种pas修饰的脂质纳米粒，其中，所述pas修饰的脂质纳米粒包括脂质和包封在所述脂质中的核酸类药物。
[0012]
根据本发明所述的pas修饰的脂质纳米粒，其中，所述脂质包括可电离脂质、辅助磷脂、胆固醇和pas脂质中的一种或多种，优选地，所述脂质由可电离脂质、辅助磷脂、胆固醇和pas脂质组成。
[0013]
根据本发明所述的pas修饰的脂质纳米粒，其中，所述核酸类药物包括mrna药物、sirna药物、mirna药物、反义核酸药物、适配体药物和dna药物中的一种或多种，优选地，所述核酸类药物为mrna药物。
[0014]
根据本发明所述的pas修饰的脂质纳米粒，其中，所述脂质的组成为：
[0015]
可电离脂质的摩尔百分比为40-65％，优选45-55％；
[0016]
辅助磷脂的摩尔百分比为10-20％，优选10-15％；
[0017]
胆固醇的摩尔百分比为25-50％，优选30-40％；
[0018]
pas脂质的摩尔百分比为0-10％，优选1-3％。
[0019]
根据本发明所述的pas修饰的脂质纳米粒，其中，所述核酸类药物与脂质的质量比为1:10-1:40，优选为1:20-1:30。
[0020]
根据本发明所述的pas修饰的脂质纳米粒，其中，所述可电离脂质包括(但不限于)：dlin-mc3-dma、sm-102、5a2-sc8、c12-200中的一种或多种，优选sm-102。
[0021]
根据本发明所述的pas修饰的脂质纳米粒，其中，所述辅助磷脂包括(但不限于)：二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(dmpc)、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱(popc)、二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(dppe)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(dmpe)、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(pope)中的一种或多种，优选为dspc。
[0022]
根据本发明所述的pas修饰的脂质纳米粒，其中，所述pas脂质包括(但不限于)：含有碳链末端的脯氨酸(p)、丙氨酸(a)、丝氨酸(s)的组合序列，其中碳链末端包括(但不限于)6-20个碳原子，pas的组合序列分子量为500-5000，所述pas脂质优选为十六碳末端和
[0023]
paaapaaapaaapaaapaaapaaapaaa多肽序列连接的pas脂质材料c16-(paaa)7，结构式如下式所示。
[0024][0025]
根据本发明所述的pas修饰的脂质纳米粒，其中，所述pas修饰的脂质纳米粒的平
均粒径范围是90nm-170nm，优选100nm-160nm。本发明使用动态光散射测定粒径，通过数学模型拟合计算获得表观粒径。
[0026]
根据本发明所述的pas修饰的脂质纳米粒，其中，所述pas修饰的脂质纳米粒的多分散系数(pdi)为0.10-0.20，优选0.10-0.18。
[0027]
本发明的目的之二是提供一种pas修饰的脂质纳米粒的制备方法，其中使用微流控方法制备pas修饰的脂质纳米粒，与通过现有技术报道的薄膜分散法来制备pas修饰的脂质纳米粒相比，制备方法稳定、操作简便、重现性高，且不引入二氯甲烷、三氯甲烷等有机溶剂，安全性较高。
[0028]
本发明的pas修饰的脂质纳米粒的制备方法的技术方案如下：
[0029]
取可电离脂质、辅助磷脂、胆固醇，溶解于无水乙醇作为乙醇相，另取pas脂质和核酸类药物溶解于柠檬酸缓冲液作为水相，使用微流控制备仪混合乙醇相和水相，将获得的两相混合液使用磷酸盐缓冲液(ph 7.4)稀释后，采用超滤离心、透析或切向流过滤等方式除去乙醇，再使用0.22μm微孔滤膜进行无菌过滤，即得pas修饰的脂质纳米粒。
[0030]
根据本发明所述的pas修饰的脂质纳米粒的制备方法，其中，所述核酸类药物包括mrna药物、sirna药物、mirna药物、反义核酸药物、适配体药物和dna药物中的一种或多种，优选地，所述核酸类药物为mrna药物。
[0031]
根据本发明所述的pas修饰的脂质纳米粒的制备方法，其中，制备的pas修饰的脂质纳米粒中，
[0032]
所述可电离脂质的摩尔百分比为40-65％，优选45-55％；
[0033]
所述辅助磷脂的摩尔百分比为10-20％，优选10-15％；
[0034]
所述胆固醇的摩尔百分比为25-50％，优选30-40％；
[0035]
所述pas脂质的摩尔百分比为0-10％，优选1-3％。
[0036]
根据本发明所述的pas修饰的脂质纳米粒的制备方法，其中，mrna与总脂质的质量比为1:10-1:40，优选为1:20-1:30。
[0037]
根据本发明所述的pas修饰的脂质纳米粒的制备方法，其中，所述可电离脂质包括(但不限于)：dlin-mc3-dma、sm-102、5a2-sc8、c12-200中的一种或多种，优选sm-102。
[0038]
根据本发明所述的pas修饰的脂质纳米粒的制备方法，其中，所述辅助磷脂包括(但不限于)：二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(dmpc)、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱(popc)、二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(dppe)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(dmpe)、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(pope)中的一种或多种，优选为dspc。
[0039]
根据本发明所述的pas修饰的脂质纳米粒的制备方法，其中，所述pas脂质包括(但不限于)：含有碳链末端的脯氨酸(p)、丙氨酸(a)、丝氨酸(s)的组合序列，其中碳链末端包括(但不限于)：6-20个碳原子，pas的组合序列分子量为500-5000，所述pas脂质优选为十六碳末端和paaapaaapaaapaaapaaapaaapaaa多肽序列连接的pas脂质材料c16-(paaa)7。
[0040]
根据本发明所述的pas修饰的脂质纳米粒的制备方法，其中，制备的pas修饰的脂质纳米粒的平均粒径范围是90nm-170nm，优选100nm-160nm。
[0041]
根据本发明所述的pas修饰的脂质纳米粒的制备方法，其中，制备的pas修饰的脂质纳米粒的pdi为0.10-0.20，优选0.10-0.18。
[0042]
根据本发明所述的pas修饰的脂质纳米粒的制备方法，其中，所述柠檬酸缓冲液的摩尔浓度为10-100mm，ph为3-5，优选50mm，ph＝4。
[0043]
根据本发明所述的pas修饰的脂质纳米粒的制备方法，其中，所述水相与所述乙醇相的流速比为5:1-2:1，优选为3:1，总流速为2-20ml/min，优选为4-8ml/min。
[0044]
本发明的目的之三是提供一种药物制剂，其包括如上所述的pas修饰的脂质纳米粒。
[0045]
根据本发明所述的药物制剂，其中，所述药物制剂还包括ph调节剂、等渗调节剂、冻干保护剂。
[0046]
根据本发明所述的药物制剂，其中，所述ph调节剂包括但不限于tris、hepes、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾中的一种或多种，所述等渗调节剂包括但不限于蔗糖、氯化钠、氯化钾中的一种或多种，所述冻干保护剂包括但不限于蔗糖、海藻糖、乳糖、甘露醇中的一种或多种。
[0047]
根据本发明所述的药物制剂，其中，所述药物制剂为注射剂或吸入液体制剂，所述注射剂和吸入液体制剂可通过本领域常规制备方法制备得到。
[0048]
本发明的目的之四是提供如上所述的pas修饰的脂质纳米粒在核酸类药物递送中的用途。
[0049]
本发明的目的之五是提供一种pas修饰的脂质复合物，其中所述pas修饰的脂质复合物包括可电离脂质、辅助磷脂、胆固醇和pas脂质中的一种或多种，优选地，所述pas修饰的脂质复合物由可电离脂质、辅助磷脂、胆固醇和pas脂质组成。
[0050]
根据本发明所述的pas修饰的脂质复合物，其中，所述脂质复合物的组成为：
[0051]
可电离脂质的摩尔百分比为40-65％，优选45-55％；
[0052]
辅助磷脂的摩尔百分比为10-20％，优选10-15％；
[0053]
胆固醇的摩尔百分比为25-50％，优选30-40％；
[0054]
pas脂质的摩尔百分比为0-10％，优选1-3％。
[0055]
根据本发明所述的pas修饰的脂质复合物，其中，所述可电离脂质包括(但不限于)：dlin-mc3-dma、sm-102、5a2-sc8、c12-200中的一种或多种，优选sm-102。
[0056]
根据本发明所述的pas修饰的脂质复合物，其中，所述辅助磷脂包括(但不限于)：二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(dmpc)、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱(popc)、二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(dppe)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(dmpe)、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(pope)中的一种或多种，优选为dspc。
[0057]
根据本发明所述的pas修饰的脂质复合物，其中，所述pas脂质包括(但不限于)：含有碳链末端的脯氨酸(p)、丙氨酸(a)、丝氨酸(s)的组合序列，其中碳链末端包括(但不限于)：6-20个碳原子，pas的组合序列分子量为500-5000，所述pas脂质优选为c16-(paaa)7。
[0058]
有益效果
[0059]
本发明提供了一种亲水性多肽pas修饰的用于核酸类药物递送的脂质纳米粒，以及一种使用微流控法制备该纳米粒的方法。目前还未有将pas修饰用于核酸类药物递送的脂质纳米粒的报道，同时也未有使用微流控法制备pas修饰的纳米粒的报道。使用微流控法制备pas修饰的脂质纳米粒操作简便、方法稳定、重现性高，且不引入二氯甲烷、三氯甲烷等
有机溶剂，安全性较高。从实验例的结果可见，经pas修饰的脂质纳米粒的粒径分布良好，对核酸类药物的包封率高，稳定性良好，具有高效的细胞转染效果和较高的安全性，同时与现有的peg修饰的脂质纳米粒相比，在体内能够避免抗-peg抗体的产生以避免abc现象及peg可能引起的免疫原性，提高治疗效果及安全性。此外，pas修饰的脂质纳米粒体现出比peg修饰的脂质纳米粒更优的对雾化剪切力的耐受性，因此pas修饰的脂质纳米粒是一种具有潜力的替代peg修饰的脂质纳米粒，比peg修饰的脂质纳米粒更适合雾化吸入给药进而用于呼吸系统的基因治疗。
附图说明
[0060]
图1示出按实施例1-3和对比例2-4中的处方和制备方法制备的不同比例pas和peg修饰的lnp的凝胶电泳图。
[0061]
图2示出按对比例5和实施例7-8中的处方和制备方法制备不同制备方法及不同脂质处方的pas修饰的lnp的凝胶电泳图。
[0062]
图3示出按实施例6中的处方和制备方法制备的包载质粒dna的pas修饰的lnp的凝胶电泳图。
[0063]
图4示出按实施例1-3和对比例2-4中的处方和制备方法制备的不同比例pas和peg修饰的lnp于4℃放置的粒径分布变化。
[0064]
图5示出按实施例1-3和对比例2-4中的处方和制备方法制备的不同比例pas和peg修饰的lnp于4℃放置28天后的核酸含量变化。
[0065]
图6示出按实施例1-3和对比例2-4中的处方和制备方法制备的不同比例pas和peg修饰的lnp于4℃放置28天后的凝胶电泳图。
[0066]
图7示出按实施例1-3和对比例2-4中的处方和制备方法制备的不同比例pas和peg修饰的lnp的细胞转染效果图。
[0067]
图8示出按实施例1-3和对比例2-4中的处方和制备方法制备的不同比例pas和peg修饰的lnp的细胞毒性评价。
[0068]
图9示出按实施例1-3和对比例2-4中的处方和制备方法制备的不同比例pas和peg修饰的lnp雾化前后的粒径分布对比。
[0069]
图10示出按实施例1-3和对比例2-4中的处方和制备方法制备的不同比例pas和peg修饰的lnp雾化后的细胞转染效果图。
[0070]
图11示出按实施例1、3和对比例2、4中的处方和制备方法制备的不同比例pas和peg修饰的lnp给药后小鼠血清内的抗-peg抗体浓度。
具体实施方式
[0071]
下面结合实施例对本发明做进一步阐述，但本发明的实施方式不限于此。
[0072]
如无特别说明，本发明实施例中使用的原料和试剂均为常规购买获得。
[0073]
本发明中所使用的材料和仪器相关信息如下：
[0074]
微流控制备仪：型号nanofac a，百林赛医药科技(上海)有限公司
[0075]
激光粒度分析仪：型号nanobrook 90plus，美国布鲁克海文仪器公司
[0076]
mrna储备液：luciferase mrna溶液，上海合信成生物技术有限公司质粒dna储备
液：上海碧云天生物技术有限公司
[0077]
c16-(paaa)7：上海强耀生物科技有限公司
[0078]
sm-102：艾伟拓(上海)医药科技有限公司
[0079]
dspc：艾伟拓(上海)医药科技有限公司
[0080]
胆固醇：艾伟拓(上海)医药科技有限公司
[0081]
dmg-peg2000：艾伟拓(上海)医药科技有限公司
[0082]
dlin-mc3-dma：艾伟拓(上海)医药科技有限公司
[0083]
dope：艾伟拓(上海)医药科技有限公司
[0084]
balb/c小鼠：成都达硕实验动物有限公司
[0085]
支气管上皮细胞beas-2b和肺泡上皮细胞a549：商城北纳创联生物科技有限公司
[0086]
lipo 8000转染试剂：上海碧云天生物技术有限公司
[0087]
bca蛋白检测试剂盒：北京索莱宝科技有限公司
[0088]
cck8试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司
[0089]
抗-peg igm elisa检测试剂盒：alpha diagnostics international
[0090]
对比例1无修饰lnp的制备
[0091]
按表1中的处方，采用如下方法制备无修饰lnp：
[0092]
取mrna储备液，使用50mm柠檬酸缓冲液(ph 4.0)稀释至约0.11mg/ml作为水相，另称取适量sm-102、dspc、胆固醇，溶解于无水乙醇中作为乙醇相，使用微流控制备仪混合两相制备脂质纳米粒，水相和乙醇相的流速比为3:1，总流速为4ml/min，使接收液中mrna与总脂质的质量比约为1:25，接收的混合液使用磷酸盐缓冲液(ph 7.4)透析4h以除去乙醇，将透析后的样品使用0.22μm微孔滤膜进行无菌过滤，即得无修饰的包载mrna的脂质纳米粒体系。
[0093]
对比例2至对比例4peg-lnp的制备
[0094]
按表1中的处方，采用如下方法制备不同比例(摩尔百分比)peg修饰的lnp：
[0095]
取mrna储备液，使用50mm柠檬酸缓冲液(ph 4.0)稀释至约0.11mg/ml作为水相，另称取适量sm-102、dspc、胆固醇、dmg-peg2000，溶解于无水乙醇中作为乙醇相，使用微流控制备仪混合两相制备脂质纳米粒，水相和乙醇相的流速比为3:1，总流速为4ml/min，使接收液中mrna与总脂质的质量比约为1:25，接收的混合液使用磷酸盐缓冲液(ph 7.4)透析4h以除去乙醇，将透析后的样品使用0.22μm微孔滤膜进行无菌过滤，即得peg修饰的包载mrna的脂质纳米粒体系。
[0096]
对比例5采用薄膜分散法制备pas-lnp
[0097]
按表1中的处方，采用如下方法制备pas修饰的lnp：
[0098]
称取适量sm-102、dspc、胆固醇，溶解于三氯甲烷并加入圆底烧瓶中，使用旋转蒸发仪减压蒸发去除有机溶剂，使脂质材料在圆底烧瓶中形成一层均匀的脂质薄膜，将圆底烧瓶于真空条件下放置过夜，另称取适量c16-(paaa)7溶解于50mm柠檬酸缓冲液(ph 4.0)，并加入mrna储备液作为水相，使mrna浓度约为0.11mg/ml，将该溶液加入含脂质薄膜的圆底烧瓶中，于60℃条件下振摇20min水化脂质膜，再使用探头超声(10s，10s，15次)处理样品，将样品加入至适量磷酸盐缓冲液(ph 7.4)中，再使用amicon ultra离心过滤器进行超滤离心，收集的样品使用0.22μm微孔滤膜进行无菌过滤，即得pas修饰的包载mrna的脂质纳米粒
体系。
[0099]
实施例
[0100]
实施例1至实施例3pas-lnp的制备
[0101]
按表1中的处方，采用如下方法制备不同比例(摩尔百分比)pas修饰的lnp：
[0102]
称取适量c16-(paaa)7溶解于50mm柠檬酸缓冲液(ph 4.0)，并加入mrna储备液作为水相，使mrna浓度约为0.11mg/ml，另称取适量sm-102、dspc、胆固醇，溶解于无水乙醇中作为乙醇相，使用微流控制备仪混合两相，其中水相和乙醇相的流速比为3:1，总流速为4ml/min，使接收液中mrna与总脂质的质量比约为1:25，将获得的两相混合液使用磷酸盐缓冲液(ph 7.4)透析4h以除去乙醇，将透析后的样品使用0.22μm微孔滤膜进行无菌过滤，即得pas修饰的包载mrna的脂质纳米粒。
[0103]
实施例4pas-lnp的制备，使用超滤离心法替代透析以除去乙醇
[0104]
按表1中的处方，称取适量c16-(paaa)7溶解于50mm柠檬酸缓冲液(ph4.0)，并加入mrna储备液作为水相，使mrna浓度约为0.11mg/ml，另称取适量sm-102、dspc、胆固醇，溶解于无水乙醇中作为乙醇相，使用微流控制备仪混合两相，其中水相和乙醇相的流速比为3:1，总流速为4ml/min，使接收液中mrna与总脂质的质量比约为1:25，将获得的两相混合液使用磷酸盐缓冲液(ph 7.4)稀释50倍，再使用amicon ultra离心过滤器进行超滤离心，收集的样品使用0.22μm微孔滤膜进行无菌过滤，即得pas修饰的包载mrna的脂质纳米粒体系。
[0105]
实施例5pas-lnp的制备，使用切向流过滤法替代透析以除去乙醇
[0106]
按表1中的处方，称取适量c16-(paaa)7溶解于50mm柠檬酸缓冲液(ph4.0)，并加入mrna储备液作为水相，使mrna浓度约为0.11mg/ml，另称取适量sm-102、dspc、胆固醇，溶解于无水乙醇中作为乙醇相，使用微流控制备仪混合两相，其中水相和乙醇相的流速比为3:1，总流速为4ml/min，使接收液中mrna与总脂质的质量比约为1:25，将获得的两相混合液使用磷酸盐缓冲液(ph 7.4)稀释2倍，再使用切向流过滤装置搭配聚醚砜膜包处理样品以除去乙醇并浓缩lnp样品，在样品循环回流的过程中不断补充磷酸盐缓冲液，直至透过液总体积约为微流控接收液的10倍体积为止，收集的回流液样品使用0.22μm微孔滤膜进行无菌过滤，即得pas修饰的包载mrna的脂质纳米粒体系。
[0107]
实施例6包载dna药物的pas-lnp的制备
[0108]
按表1中的处方，采用如下方法制备包载dna药物的pas修饰的lnp：
[0109]
称取适量c16-(paaa)7溶解于50mm柠檬酸缓冲液(ph 4.0)，并加入质粒dna储备液作为水相，使dna浓度约为0.11mg/ml，另称取适量sm-102、dspc、胆固醇，溶解于无水乙醇中作为乙醇相，使用微流控制备仪混合两相，其中水相和乙醇相的流速比为3:1，总流速为4ml/min，使接收液中质粒dna与总脂质的质量比约为1:25，将获得的两相混合液使用磷酸盐缓冲液(ph 7.4)透析4h以除去乙醇，将透析后的样品使用0.22μm微孔滤膜进行无菌过滤，即得pas修饰的包载dna的脂质纳米粒。
[0110]
实施例7pas-lnp的制备
[0111]
按表1中的处方，采用如下方法制备以dlin-mc3-dma作为可电离脂质的pas修饰的lnp：
[0112]
称取适量c16-(paaa)7溶解于50mm柠檬酸缓冲液(ph 4.0)，并加入mrna储备液作为水相，使mrna浓度约为0.11mg/ml，另称取适量dllin-mc3-dma、dspc、胆固醇，溶解于无水
乙醇中作为乙醇相，使用微流控制备仪混合两相，其中水相和乙醇相的流速比为3:1，总流速为4ml/min，使接收液中mrna与总脂质的质量比约为1:25，将获得的两相混合液使用磷酸盐缓冲液(ph 7.4)透析4h以除去乙醇，将透析后的样品使用0.22μm微孔滤膜进行无菌过滤，即得pas修饰的包载mrna的脂质纳米粒。
[0113]
实施例8pas-lnp的制备
[0114]
按表1中的处方，采用如下方法制备以dope作为辅助磷脂的pas修饰的lnp：
[0115]
称取适量c16-(paaa)7溶解于50mm柠檬酸缓冲液(ph 4.0)，并加入mrna储备液作为水相，使mrna浓度约为0.11mg/ml，另称取适量sm-102、dope、胆固醇，溶解于无水乙醇中作为乙醇相，使用微流控制备仪混合两相，其中水相和乙醇相的流速比为3:1，总流速为4ml/min，使接收液中mrna与总脂质的质量比约为1:25，将获得的两相混合液使用磷酸盐缓冲液(ph 7.4)透析4h以除去乙醇，将透析后的样品使用0.22μm微孔滤膜进行无菌过滤，即得pas修饰的包载mrna的脂质纳米粒。
[0116]
表1不同比例peg和pas修饰的lnp脂质组成摩尔百分比
[0117]
[0118][0119]
实验部分
[0120]
实验例1pas-lnp和peg-lnp的粒径分布
[0121]
使用激光粒度分析仪测定各组lnp的粒径分布情况，结果见表2，可见无peg或pas水化层修饰的lnp粒径和pdi均较大，而具有水化层修饰的lnp粒径和pdi均有显著改善，同时可见3％和5％peg或pas修饰的lnp比1.5％peg或pas修饰的lnp粒径有所降低，但随着修饰比例的增加pdi显示出逐渐增大的趋势。在相同修饰比例下，pas-lnp比peg-lnp的粒径大，其中1.5％pas修饰的lnp的粒径较大，为约160nm，pas修饰量增加到3％后粒径减小至约100nm。
[0122]
使用薄膜分散法制备pas-lnp的过程与微流控法相比较为繁琐，薄膜水化和探头超声的过程增加了核酸药物降解的风险，且须引入三氯甲烷等有机溶剂，经薄膜分散法制备的1.5％pas-lnp(对比例5)粒径较大，约210nm。
[0123]
表2不同比例peg和pas修饰的lnp的粒径分布
[0124][0125]
实验例2pas-lnp和peg-lnp对mrna包载能力的表征
[0126]
使用rna琼脂糖凝胶电泳法评价各组lnp的包封率。按实施例1-3和对比例2-4中的处方和制备方法制备不同比例pas和peg修饰的lnp，将各组lnp及游离mrna与上样缓冲液混合均匀后，使用1％琼脂糖凝胶进行电泳分离，电泳结果使用凝胶成像系统进行观察并拍照。结果如图1所示，游离mrna能够形成清晰可见的电泳条带，而当mrna被完全包载于lnp内时，由于lnp的阻滞作用会导致mrna难以在电场作用下向下泳动。在各组lnp中，可见1.5％peg修饰的lnp能够完全包载mrna，3％和5％peg的修饰即可见游离mrna的条带，表明mrna无法被完全包载，证实peg水化层修饰比例较高时可能对mrna形成了空间位阻，阻碍了mrna的包封；对于pas修饰的lnp而言，可见1.5％和3％的修饰比例均能完全包载mrna，5％pas修饰无法完全包载。
[0127]
按对比例5和实施例7-8中的处方和制备方法制备pas修饰的lnp，将各组lnp及游离mrna与上样缓冲液混合均匀后，使用1％琼脂糖凝胶进行电泳分离，电泳结果使用凝胶成像系统进行观察并拍照。结果如图2所示，可见使用薄膜分散法制备的1.5％pas-lnp，以及不同处方的2％pas-lnp均能完全包载mrna。
[0128]
按实施例6中的处方和制备方法制备pas修饰的包载质粒dna的lnp，将各组lnp及游离质粒dna与上样缓冲液混合均匀后，使用1％琼脂糖凝胶进行电泳分离，电泳结果使用凝胶成像系统进行观察并拍照。结果如图3所示，可见2％pas修饰的lnp能够完全包载质粒dna。
[0129]
实验例3pas-lnp和peg-lnp的稳定性评价
[0130]
按实施例1-3和对比例2-4中的处方和制备方法制备不同比例pas和peg修饰的lnp，并将各组样品置于4℃放置，于0天、7天、14天、21天、28天取样，按实验例1中的方法测定各组样品的粒径分布。结果见图4，可见各组lnp于4℃放置28天后，粒径略有增大，pdi无显著变化，表明peg和pas修饰的lnp在放置过程中均不会出现明显的聚集沉降现象，pas和peg均能良好地维持lnp的粒径形态。
[0131]
另取于4℃放置的0天和28天lnp样品，使用5％triton溶液裂解各组lnp样品后，再使用ribogreen试剂盒测定各组样品的mrna含量，以0天的mrna含量作为100％，计算28天的mrna含量占0天含量的百分比。结果见图5，可见各组lnp于4℃放置28天后总核酸含量与0天样品相比并无显著变化，表明pas和peg修饰的lnp均具有良好的稳定性，包载的核酸在放样
过程中并无降解。
[0132]
另取于4℃放置的28天lnp样品，按实验例2的方法考察28天样品的包封率，结果见图6，可见各组lnp于4℃放置28天后的包封率与0天样品(图1)基本一致，表明pas和peg修饰的lnp稳定性良好，其中1.5％peg-lnp、1.5％pas-lnp、3％pas-lnp能够完全包载核酸药物，且在放置过程中核酸药物不会泄露。
[0133]
实验例4pas-lnp和peg-lnp的细胞转染效果评价
[0134]
按实施例1-3和对比例2-4中的处方和制备方法，使用荧光素酶表达的mrna(luciferase mrna)制备不同比例pas和peg修饰的lnp，将支气管上皮细胞beas-2b和肺泡上皮细胞a549按每孔1
×
105个的密度分别接种于24孔板，培养过夜后向孔板内加入各组载luciferase mrna的lnp及游离的luciferase mrna(每孔125ng mrna)，另取游离luciferase mrna与lipo8000转染试剂混合后加药作为阳性对照，于37℃，5％co2条件下孵育24h后，使用荧光素酶检测试剂盒检测各孔细胞的荧光素酶表达量，并使用bca蛋白检测试剂盒校正各孔内细胞的总蛋白含量。结果见图7，可见各组lnp在两种细胞上均显示出比游离mrna和lipo 8000阳性对照显著更强的转染效果，其中1.5％peg和pas修饰的lnp转染效果无显著差异，随peg和pas的修饰比例升高，细胞转染效果逐渐降低，这是由于修饰量升高后形成的空间位阻影响了lnp的入胞。同时可见3％和5％修饰下，pas-lnp体现出了比peg-lnp更强的细胞转染能力。
[0135]
实验例5pas-lnp和peg-lnp的安全性评价
[0136]
按实施例1-3和对比例2-4中的处方和制备方法制备不同比例pas和peg修饰的lnp，将支气管上皮细胞beas-2b和肺泡上皮细胞a549按每孔8000个的密度分别接种于96孔板，培养过夜后向孔板内加入各组lnp，使孔内mrna浓度分别为31.25、62.5、125、250、500ng/ml，于37℃，5％co2条件下孵育24h后，使用cck8试剂盒检测各孔内细胞活性。结果见图8，可见各组lnp在两种细胞上均未体现出显著的细胞毒性，在所有浓度梯度下细胞的存活率均大于80％，表明pas和peg修饰的lnp均具有较好的安全性。
[0137]
实验例6雾化过程对pas-lnp和peg-lnp的影响
[0138]
按实施例1-3和对比例2-4中的处方和制备方法制备不同比例pas和peg修饰的lnp，使用小动物肺部液体定量雾化给药装置对各组lnp进行雾化处理，并收集雾化后的lnp样品，按实验例1中的方法测定各组样品的粒径分布。结果见图9，可见各组lnp样品雾化后与雾化前相比，粒径和pdi均有增大，是由于雾化过程产生的剪切力通常会一定程度上影响纳米载体的粒径分布和稳定性，结果可见peg-lnp雾化前后对比的粒径分布差异比pas-lnp更加显著，表明pas-lnp对雾化过程的耐受能力强于peg-lnp，pas-lnp可能比peg-lnp更适用于呼吸系统内雾化的给药方式。
[0139]
实验例7雾化后的pas-lnp和peg-lnp的细胞转染效果评价
[0140]
按实施例1-3和对比例2-4中的处方和制备方法，使用荧光素酶表达的mrna(luciferase mrna)制备不同比例pas和peg修饰的lnp，按实验例6中的方法对lnp进行雾化处理后，按实验例4中的方法进行雾化后lnp样品在a549细胞上的细胞转染效果评价，结果见图10，可见雾化处理后各组lnp的转染效果趋势与雾化前完全一致，在1.5％修饰比例下，pas-lnp和peg-lnp的转染效果最强，且无显著差异，在3％和5％修饰比例下pas-lnp的转染效果比peg-lnp更强。
[0141]
实验例8pas-lnp和peg-lnp给药后小鼠血清抗-peg抗体的检测
[0142]
按实施例1、3和对比例2、4中的处方和制备方法制备不同比例pas和peg修饰的lnp。本实验中使用雄性balb/c小鼠，体重18-22g，随机分为5组，分别为生理盐水对照组、1.5％peg-lnp给药组、5％peg-lnp给药组、1.5％pas-lnp给药组、5％pas-lnp给药组，每组3只。分别按约0.35μmol总脂质/kg的剂量经尾静脉注射至balb/c小鼠体内，并使用生理盐水组作为对照，给药7天后将各组小鼠经眼眶静脉取血并收集血清，使用抗-peg igm的elisa检测试剂盒，按试剂盒说明书操作测定各组小鼠给药后血清中抗-peg抗体的浓度。结果见图11，可见1.5％和5％pas修饰的lnp给药组小鼠血清内的抗-peg抗体水平与生理盐水对照组基本相同，而1.5％和5％peg修饰的lnp给药组小鼠血清内的抗-peg抗体水平则显著高于pas-lnp给药组小鼠，表明pas修饰的lnp能够避免体内抗-peg抗体的产生，进而避免abc现象以及peg可能引起的免疫原性。

技术特征：
2:1，优选为3:1，总流速为2-20ml/min，优选为4-8ml/min。12.一种药物制剂，其包括如权利要求1-7中任一项所述的pas修饰的脂质纳米粒。13.根据权利要求12所述的药物制剂，其中，所述药物制剂还包括ph调节剂、等渗调节剂、冻干保护剂。14.根据权利要求13所述的药物制剂，其中，所述ph调节剂包括tris、hepes、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾中的一种或多种，所述等渗调节剂包括蔗糖、氯化钠、氯化钾中的一种或多种，所述冻干保护剂包括蔗糖、海藻糖、乳糖、甘露醇中的一种或多种。15.根据权利要求12或13所述的药物制剂，其中，所述药物制剂为注射剂或吸入液体制剂。16.如权利要求1-7中任一项所述的pas修饰的脂质纳米粒在核酸类药物递送中的用途。17.一种pas修饰的脂质复合物，其中所述pas修饰的脂质复合物包括可电离脂质、辅助磷脂、胆固醇和pas脂质中的一种或多种，优选地，所述pas修饰的脂质复合物由可电离脂质、辅助磷脂、胆固醇和pas脂质组成。18.根据权利要求17所述的pas修饰的脂质复合物，其中，所述脂质复合物的组成为：可电离脂质的摩尔百分比为40-65％，优选45-55％；辅助磷脂的摩尔百分比为10-20％，优选10-15％；胆固醇的摩尔百分比为25-50％，优选30-40％；pas脂质的摩尔百分比为0-10％，优选1-3％。19.根据权利要求17或18所述的pas修饰的脂质复合物，其中，所述可电离脂质包括：dlin-mc3-dma、sm-102、5a2-sc8、c12-200中的一种或多种，优选sm-102；所述辅助磷脂包括：二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺中的一种或多种，优选为二硬脂酰磷脂酰胆碱；所述pas脂质包括：含有碳链末端的脯氨酸(p)、丙氨酸(a)、丝氨酸(s)的组合序列，其中碳链末端包括：6-20个碳原子，pas的组合序列分子量为500-5000，所述pas脂质优选为c16-(paaa)7。

技术总结
本发明提供了一种PAS修饰的脂质纳米粒，所述PAS修饰的脂质纳米粒包括脂质和包封在所述脂质中的核酸类药物。经PAS修饰的脂质纳米粒的粒径分布良好，对核酸类药物的包封率高，稳定性良好，具有高效的细胞转染效果和较高的安全性，同时与现有的PEG修饰的脂质纳米粒相比，在体内能够避免抗-PEG抗体的产生以避免加速血液清除现象及PEG可能引起的免疫原性，提高治疗效果及安全性。此外，PAS修饰的脂质纳米粒体现出比PEG修饰的脂质纳米粒更优的对雾化剪切力的耐受性，因此PAS修饰的脂质纳米粒更适合雾化吸入给药进而用于呼吸系统的基因治疗。疗。


技术研发人员：刘亚圆 王震宇 张利 冯博 舒宏 杜书文
受保护的技术使用者：四川普锐特药业有限公司
技术研发日：2023.05.29
技术公布日：2023/8/9