一种控油舒缓的植物发酵物及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于微生物发酵技术领域，特别涉及一种控油舒缓的植物发酵物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.近年来，人们对皮肤护理上的的需求日益强烈，有关控油和抗炎的研究逐渐深入，针对皮肤控油和抗炎的各个机制，各类具有控油和抗炎活性的原料不断问世。随着科学的不断发展，天然植物中的活性成分及其功效被不断挖掘。例如，收载于《已使用化妆品原料目录》2021版中的侧柏、圆柏、刺柏和卷柏。根据报道，这四种植物均有多种黄酮类成分，特别是均含有槲皮素和槲皮苷。药理研究表明，它们的提取物具有抗炎、抗氧化和抑菌的功效。目前，获取这些天然植物中的活性成分，通常采用溶剂提取法，这些传统提取方法存在活性成分收率低，耗能高的问题，且得到的提取物的效果并不明显；还有些厂家采用微波萃取和超临界co2萃取进行提取，但是设备要求高，成本高。
3.因此，如何提高植物提取物中的活性成分是本领域亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供一种控油舒缓的植物发酵物及其制备方法和应用，该植物发酵物中具有高含量活性成分总黄酮和槲皮苷，从而具有显著的控油舒缓的功效。
5.本发明的第一方面提供一种植物发酵物，所述植物发酵物的制备原料包括：植物原料、牛乳、甘油和发酵菌株；所述植物原料包括侧柏叶、圆柏叶、刺柏叶、卷柏叶中的至少一种；所述发酵菌株包括植物乳杆菌、乳酸乳杆菌、长双歧杆菌中的至少一种。
6.根据本发明的一些实施方式，所述植物原料、所述牛乳和所述甘油的用量比为(0.01-50g)：(0.01-50g)：1g。进一步的，所述植物原料、所述牛乳和所述甘油的用量比为(0.01-10g)：(0.01-10g)：1g。更进一步的，所述植物原料、所述牛乳和所述甘油的用量比为(0.1-1g)：(0.1-1g)：1g。
7.根据本发明的一些实施方式，所述植物发酵物的制备原料还包括水。
8.根据本发明的一些实施方式，所述甘油和所述水的用量比为1g：(1-1000g)。进一步的，所述甘油和所述水的用量比为1g：(1-100g)。更进一步的，所述甘油和所述水的用量比为1g：(10-50g)。
9.根据本发明的一些实施方式，所述植物发酵物含有活性成分，所述活性成分包括＞1mg/ml的总黄酮，以及＞80μg/ml的槲皮苷。进一步的，所述活性成分包括1-3mg/ml的总黄酮，以及80-150μg/ml的槲皮苷。
10.根据本发明的一些实施方式，所述发酵菌株的浓度为10
5-10
10
cfu/ml。进一步的，所述发酵菌株的浓度为10
8-10
10
cfu/ml。
11.本发明的第二方面提供上述植物发酵物的制备方法，包括以下步骤：
12.将所述植物原料、所述牛乳和所述甘油混合，高压均质，得到植物复合液；
13.将所述植物复合液和所述发酵菌株混合，发酵，得到所述植物发酵物；
14.所述高压均质的压力为20-100mpa。
15.根据本发明的一些实施方式，所述高压均质的压力为50-100mpa。
16.根据本发明的一些实施方式，所述高压均质的温度为25-50℃，所述高压均质的时间为5-40min。进一步的，所述高压均质的温度为30-50℃，所述高压均质的时间为15-20min。
17.根据本发明的一些实施方式，在进行所述发酵前，还加入培养基；所述植物复合液、所述发酵菌株和所述培养基的用量比为(1-500g)：(0.01-10ml)：1g。进一步的，所述植物复合液、所述发酵菌株和所述培养基的用量比为(1-100g)：(0.1-5ml)：1g。更进一步的，所述植物复合液、所述发酵菌株和所述培养基的用量比为(20-80g)：(0.1-1ml)：1g。
18.根据本发明的一些实施方式，所述培养基为mrs培养基。
19.根据本发明的一些实施方式，所述发酵的温度为20-45℃，所述发酵的时间为12-120h。进一步的，所述发酵的温度为30-40℃，所述发酵的时间为72-120h。
20.根据本发明的一些实施方式，在所述发酵后，还包括将发酵液进行灭菌的步骤。
21.根据本发明的一些实施方式，所述灭菌的温度为100-150℃，所述灭菌的时间为10-30min。
22.根据本发明的一些实施方式，在所述高压均质前，还包括将水与所述植物原料、所述牛乳、所述甘油混合。
23.本发明的第三方面提供上述植物发酵物在制备化妆品或外用皮肤制剂中的应用。
24.本发明的第四方面提供一种化妆品，该化妆品包括上述植物发酵物。
25.根据本发明的一些实施方式，所述化妆品还包括化妆品中可接受的辅料。
26.根据本发明的一些实施方式，所述化妆品中可接受的辅料包括乳化剂、保湿剂、增稠剂、防腐剂中的至少一种。
27.根据本发明的一些实施方式，所述植物发酵物在化妆品中的添加量为0.01-80wt％。进一步的，所述植物发酵物在化妆品中的添加量为0.05-20wt％。更进一步的，所述植物发酵物在化妆品中的添加量为0.1-10wt％。
28.根据本发明的一些实施方式，所述化妆品包括洗发水、沐浴露或洗面奶。
29.相对于现有技术，本发明的有益效果以下：
30.本发明采用特定的植物原料、发酵菌株，以及牛乳和甘油作为制备原料，经发酵制得的植物发酵物具有高含量活性成分总黄酮和槲皮苷，其中总黄酮的含量达到1-3mg/ml，槲皮苷的含量达到80-150μg/ml，具有显著的控油舒缓的功效。
31.本发明通过在高压均质过程辅以牛乳和甘油，使植物组织细胞充分破碎，提高活性成分溶出率，并且和定向微生物发酵技术进行有机结合，采用特定菌株进行发酵，高压均质得到的植物复合原液作为后续的发酵基质，通过微生物的生物转化能力，最终提高了植物发酵物中总黄酮和槲皮苷的含量，使得本发明植物发酵物具有显著的控油舒缓的功效。
具体实施方式
32.为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进
行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
33.以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
34.实施例1
35.一种植物发酵物的制备原料包括：侧柏叶、牛乳、甘油和植物乳杆菌菌液。
36.本实施例植物发酵物的制备方法，包括以下步骤：
37.1)将侧柏叶10g、牛乳20g、甘油20g、去离子水360g混合后，再加入高压均质机中进行高压均质，均质温度为40℃，均质压力为80mpa，均质时间为15min，即得植物复合液；
38.2)将200g植物复合液、2ml植物乳杆菌菌液(浓度为108cfu/ml)和4g mrs培养基混合，30℃下发酵72h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌20min，再将灭菌后的发酵液在转速为6000rpm/min下，离心20min，取离心后的上清液，得到植物发酵物。
39.实施例2
40.一种植物发酵物的制备原料包括：圆柏叶、牛乳、甘油和植物乳杆菌菌液。
41.本实施例植物发酵物的制备方法，包括以下步骤：
42.1)将圆柏叶10g、牛乳20g、甘油20g、去离子水360g混合后，再加入高压均质机中进行高压均质，均质温度为40℃，均质压力为80mpa，均质时间为15min，即得植物复合液；
43.2)将200g植物复合液、2ml植物乳杆菌菌液(浓度为108cfu/ml)和4g mrs培养基混合，30℃下发酵72h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌20min，再将灭菌后的发酵液在转速为6000rpm/min下，离心20min，取离心后的上清液，得到植物发酵物。
44.实施例3
45.一种植物发酵物的制备原料包括：刺柏叶、牛乳、甘油和植物乳杆菌菌液。
46.本实施例植物发酵物的制备方法，包括以下步骤：
47.1)将刺柏叶10g、牛乳20g、甘油20g、去离子水360g混合后，再加入高压均质机中进行高压均质，均质温度为40℃，均质压力为80mpa，均质时间为15min，即得植物复合液；
48.2)将200g植物复合液、2ml植物乳杆菌菌液(浓度为108cfu/ml)和4g mrs培养基混合，30℃下发酵72h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌20min，再将灭菌后的发酵液在转速为6000rpm/min下，离心20min，取离心后的上清液，得到植物发酵物。
49.实施例4
50.一种植物发酵物的制备原料包括：卷柏叶、牛乳、甘油和植物乳杆菌菌液。
51.本实施例植物发酵物的制备方法，包括以下步骤：
52.1)将卷柏叶10g、牛乳20g、甘油20g、去离子水360g混合后，再加入高压均质机中进行高压均质，均质温度为40℃，均质压力为80mpa，均质时间为15min，即得植物复合液；
53.2)将200g植物复合液、2ml植物乳杆菌菌液(浓度为108cfu/ml)和4g mrs培养基混合，30℃下发酵72h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌20min，再将灭菌后的发酵液在转速为6000rpm/min下，离心20min，取离心后的上清液，得到植物发酵物。
54.实施例5
55.一种植物发酵物的制备原料包括：侧柏叶、圆柏叶、牛乳、甘油和植物乳杆菌菌液。
56.本实施例植物发酵物的制备方法，包括以下步骤：
57.1)将侧柏叶5g、圆柏叶5g、牛乳20g、甘油20g、去离子水360g混合后，再加入高压均
质机中进行高压均质，均质温度为40℃，均质压力为80mpa，均质时间为20min，即得植物复合液；
58.2)将200g植物复合液、2ml植物乳杆菌菌液(浓度为108cfu/ml)和4g mrs培养基混合，30℃下发酵72h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌20min，再将灭菌后的发酵液在转速为6000rpm/min下，离心20min，取离心后的上清液，得到植物发酵物。
59.实施例6
60.一种植物发酵物的制备原料包括：刺柏叶、卷柏叶、牛乳、甘油和植物乳杆菌菌液。
61.本实施例植物发酵物的制备方法，包括以下步骤：
62.1)将刺柏叶5g、卷柏叶5g、牛乳20g、甘油20g、去离子水360g混合后，再加入高压均质机中进行高压均质，均质温度为40℃，均质压力为80mpa，均质时间为20min，即得植物复合液；
63.2)将200g植物复合液、2ml植物乳杆菌菌液(浓度为108cfu/ml)和4g mrs培养基混合，30℃下发酵72h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌20min，再将灭菌后的发酵液在转速为6000rpm/min下，离心20min，取离心后的上清液，得到植物发酵物。
64.实施例7
65.一种植物发酵物的制备原料包括：侧柏叶、圆柏叶、刺柏叶、卷柏叶、牛乳、甘油和植物乳杆菌菌液。
66.本实施例植物发酵物的制备方法，包括以下步骤：
67.1)将侧柏叶2.5g、圆柏叶2.5g、刺柏叶2.5g、卷柏叶2.5g、牛乳20g、甘油20g、去离子水360g混合后，再加入高压均质机中进行高压均质，均质温度为40℃，均质压力为80mpa，均质时间为20min，即得植物复合液；
68.2)将200g植物复合液、2ml植物乳杆菌菌液(浓度为108cfu/ml)和4g mrs培养基混合，30℃下发酵72h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌20min，再将灭菌后的发酵液在转速为6000rpm/min下，离心20min，取离心后的上清液，得到植物发酵物。
69.实施例8
70.一种植物发酵物的制备原料包括：侧柏叶、牛乳、甘油和乳酸乳杆菌菌液。
71.本实施例植物发酵物的制备方法，包括以下步骤：
72.1)将侧柏叶10g、牛乳20g、甘油20g、去离子水360g混合后，再加入高压均质机中进行高压均质，均质温度为40℃，均质压力为80mpa，均质时间为15min，即得植物复合液；
73.2)将200g植物复合液、2ml乳酸乳杆菌菌液(浓度为108cfu/ml)和4g mrs培养基混合，33℃下发酵72h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌20min，再将灭菌后的发酵液在转速为6000rpm/min下，离心20min，取离心后的上清液，得到植物发酵物。
74.实施例9
75.一种植物发酵物的制备原料包括：圆柏叶、牛乳、甘油和乳酸乳杆菌菌液。
76.本实施例植物发酵物的制备方法，包括以下步骤：
77.1)将圆柏叶10g、牛乳20g、甘油20g、去离子水360g混合后，再加入高压均质机中进行高压均质，均质温度为40℃，均质压力为80mpa，均质时间为15min，即得植物复合液；
78.2)将200g植物复合液、2ml乳酸乳杆菌菌液(浓度为108cfu/ml)和4g mrs培养基混合，33℃下发酵72h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌20min，再将灭菌后的发酵液在转
速为6000rpm/min下，离心20min，取离心后的上清液，得到植物发酵物。
79.实施例10
80.一种植物发酵物的制备原料包括：刺柏叶、牛乳、甘油和乳酸乳杆菌菌液。
81.本实施例植物发酵物的制备方法，包括以下步骤：
82.1)将刺柏叶10g、牛乳20g、甘油20g、去离子水360g混合后，再加入高压均质机中进行高压均质，均质温度为40℃，均质压力为80mpa，均质时间为15min，即得植物复合液；
83.2)将200g植物复合液、2ml乳酸乳杆菌菌液(浓度为108cfu/ml)和4g mrs培养基混合，33℃下发酵72h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌20min，再将灭菌后的发酵液在转速为6000rpm/min下，离心20min，取离心后的上清液，得到植物发酵物。
84.实施例11
85.一种植物发酵物的制备原料包括：卷柏叶、牛乳、甘油和乳酸乳杆菌菌液。
86.本实施例植物发酵物的制备方法，包括以下步骤：
87.1)将卷柏叶10g、牛乳20g、甘油20g、去离子水360g混合后，再加入高压均质机中进行高压均质，均质温度为40℃，均质压力为80mpa，均质时间为15min，即得植物复合液；
88.2)将200g植物复合液、2ml乳酸乳杆菌菌液(浓度为108cfu/ml)和4g mrs培养基混合，33℃下发酵72h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌20min，再将灭菌后的发酵液在转速为6000rpm/min下，离心20min，取离心后的上清液，得到植物发酵物。
89.实施例12
90.一种植物发酵物的制备原料包括：侧柏叶、圆柏叶、牛乳、甘油和乳酸乳杆菌菌液。
91.本实施例植物发酵物的制备方法，包括以下步骤：
92.1)将侧柏叶5g、圆柏叶5g、牛乳20g、甘油20g、去离子水360g混合后，再加入高压均质机中进行高压均质，均质温度为40℃，均质压力为80mpa，均质时间为20min，即得植物复合液；
93.2)将200g植物复合液、2ml乳酸乳杆菌菌液(浓度为108cfu/ml)和4g mrs培养基混合，33℃下发酵72h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌20min，再将灭菌后的发酵液在转速为6000rpm/min下，离心20min，取离心后的上清液，得到植物发酵物。
94.实施例13
95.一种植物发酵物的制备原料包括：刺柏叶、卷柏叶、牛乳、甘油和乳酸乳杆菌菌液。
96.本实施例植物发酵物的制备方法，包括以下步骤：
97.1)将刺柏叶5g、卷柏叶5g、牛乳20g、甘油20g、去离子水360g混合后，再加入高压均质机中进行高压均质，均质温度为40℃，均质压力为80mpa，均质时间为20min，即得植物复合液；
98.2)将200g植物复合液、2ml乳酸乳杆菌菌液(浓度为108cfu/ml)和4g mrs培养基混合，33℃下发酵72h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌20min，再将灭菌后的发酵液在转速为6000rpm/min下，离心20min，取离心后的上清液，得到植物发酵物。
99.实施例14
100.一种植物发酵物的制备原料包括：侧柏叶、圆柏叶、刺柏叶、卷柏叶、牛乳、甘油和乳酸乳杆菌菌液。
101.本实施例植物发酵物的制备方法，包括以下步骤：
102.1)将侧柏叶2.5g、圆柏叶2.5g、刺柏叶2.5g、卷柏叶2.5g、牛乳20g、甘油20g、去离子水360g混合后，再加入高压均质机中进行高压均质，均质温度为40℃，均质压力为80mpa，均质时间为20min，即得植物复合液；
103.2)将200g植物复合液、2ml乳酸乳杆菌菌液(浓度为108cfu/ml)和4g mrs培养基混合，33℃下发酵72h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌20min，再将灭菌后的发酵液在转速为6000rpm/min下，离心20min，取离心后的上清液，得到植物发酵物。
104.实施例15
105.一种植物发酵物的制备原料包括：侧柏叶、牛乳、甘油和长双歧杆菌菌液。
106.本实施例植物发酵物的制备方法，包括以下步骤：
107.1)将侧柏叶10g、牛乳20g、甘油20g、去离子水360g混合后，再加入高压均质机中进行高压均质，均质温度为40℃，均质压力为80mpa，均质时间为15min，即得植物复合液；
108.2)将200g植物复合液、2ml长双歧杆菌菌液(浓度为108cfu/ml)和4g mrs培养基混合，37℃下发酵72h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌20min，再将灭菌后的发酵液在转速为6000rpm/min下，离心20min，取离心后的上清液，得到植物发酵物。
109.实施例16
110.一种植物发酵物的制备原料包括：圆柏叶、牛乳、甘油和长双歧杆菌菌液。
111.本实施例植物发酵物的制备方法，包括以下步骤：
112.1)将圆柏叶10g、牛乳20g、甘油20g、去离子水360g混合后，再加入高压均质机中进行高压均质，均质温度为40℃，均质压力为80mpa，均质时间为15min，即得植物复合液；
113.2)将200g植物复合液、2ml长双歧杆菌菌液(浓度为108cfu/ml)和4g mrs培养基混合，37℃下发酵72h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌20min，再将灭菌后的发酵液在转速为6000rpm/min下，离心20min，取离心后的上清液，得到植物发酵物。
114.实施例17
115.一种植物发酵物的制备原料包括：刺柏叶、牛乳、甘油和长双歧杆菌菌液。
116.本实施例植物发酵物的制备方法，包括以下步骤：
117.1)将刺柏叶10g、牛乳20g、甘油20g、去离子水360g混合后，再加入高压均质机中进行高压均质，均质温度为40℃，均质压力为80mpa，均质时间为15min，即得植物复合液；
118.2)将200g植物复合液、2ml长双歧杆菌菌液(浓度为108cfu/ml)和4g mrs培养基混合，37℃下发酵72h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌20min，再将灭菌后的发酵液在转速为6000rpm/min下，离心20min，取离心后的上清液，得到植物发酵物。
119.实施例18
120.一种植物发酵物的制备原料包括：卷柏叶、牛乳、甘油和长双歧杆菌菌液。
121.本实施例植物发酵物的制备方法，包括以下步骤：
122.1)将卷柏叶10g、牛乳20g、甘油20g、去离子水360g混合后，再加入高压均质机中进行高压均质，均质温度为40℃，均质压力为80mpa，均质时间为15min，即得植物复合液；
123.2)将200g植物复合液、2ml长双歧杆菌菌液(浓度为108cfu/ml)和4g mrs培养基混合，37℃下发酵72h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌20min，再将灭菌后的发酵液在转速为6000rpm/min下，离心20min，取离心后的上清液，得到植物发酵物。
124.实施例19
125.一种植物发酵物的制备原料包括：侧柏叶、圆柏叶、牛乳、甘油和长双歧杆菌菌液。
126.本实施例植物发酵物的制备方法，包括以下步骤：
127.1)将侧柏叶5g、圆柏叶5g、牛乳20g、甘油20g、去离子水360g混合后，再加入高压均质机中进行高压均质，均质温度为40℃，均质压力为80mpa，均质时间为20min，即得植物复合液；
128.2)将200g植物复合液、2ml长双歧杆菌菌液(浓度为108cfu/ml)和4g mrs培养基混合，37℃下发酵72h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌20min，再将灭菌后的发酵液在转速为6000rpm/min下，离心20min，取离心后的上清液，得到植物发酵物。
129.实施例20
130.一种植物发酵物的制备原料包括：刺柏叶、卷柏叶、牛乳、甘油和长双歧杆菌菌液。
131.本实施例植物发酵物的制备方法，包括以下步骤：
132.1)将刺柏叶5g、卷柏叶5g、牛乳20g、甘油20g、去离子水360g混合后，再加入高压均质机中进行高压均质，均质温度为40℃，均质压力为80mpa，均质时间为20min，即得植物复合液；
133.2)将200g植物复合液、2ml长双歧杆菌菌液(浓度为108cfu/ml)和4g mrs培养基混合，37℃下发酵72h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌20min，再将灭菌后的发酵液在转速为6000rpm/min下，离心20min，取离心后的上清液，得到植物发酵物。
134.实施例21
135.一种植物发酵物的制备原料包括：侧柏叶、圆柏叶、刺柏叶、卷柏叶、牛乳、甘油和长双歧杆菌菌液。
136.本实施例植物发酵物的制备方法，包括以下步骤：
137.1)将侧柏叶2.5g、圆柏叶2.5g、刺柏叶2.5g、卷柏叶2.5g、牛乳20g、甘油20g、去离子水360g混合后，再加入高压均质机中进行高压均质，均质温度为40℃，均质压力为80mpa，均质时间为20min，即得植物复合液；
138.2)将200g植物复合液、2ml长双歧杆菌菌液(浓度为108cfu/ml)和4g mrs培养基混合，37℃下发酵72h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌20min，再将灭菌后的发酵液在转速为6000rpm/min下，离心20min，取离心后的上清液，得到植物发酵物。
139.对比例1(与实施例7的区别仅在于采用常规水煎煮)
140.一种复合提取物的制备方法，包括以下步骤：
141.将侧柏叶2.5g、圆柏叶2.5g、刺柏叶2.5g、卷柏叶2.5g、牛乳20g、甘油20g、去离子水360g混合后，在100℃下加热提取1h，过滤，收集滤液，得到复合提取物。
142.对比例2
143.本对比例与实施例7相比，区别仅在于将步骤1)中牛乳和甘油替换为去离子水，且加入量相同，其他原料、添加量以及制备方法与实施例7相同。
144.对比例3
145.本对比例与实施例7相比，区别仅在于将步骤1)中牛乳替换为蜂蜜，且加入量相同，其他原料、添加量以及制备方法与实施例7相同。
146.对比例4
147.本对比例与实施例7相比，区别仅在于将步骤1)中甘油替换为去离子水，且加入量
相同，其他原料、添加量以及制备方法与实施例7相同。
148.对比例5
149.本对比例与实施例7相比，区别仅在于将步骤1)中牛乳替换为卵磷脂，且加入量相同，其他原料、添加量以及制备方法与实施例7相同。
150.对比例6
151.本对比例与实施例7相比，区别仅在于将步骤1)中甘油替换为丁二醇，且加入量相同，其他原料、添加量以及制备方法与实施例7相同。
152.对比例7
153.本对比例与实施例7相比，区别仅在于将步骤2)中植物乳杆菌菌液替换为去离子水，且加入量相同，其他原料、添加量以及制备方法与实施例7相同。
154.对比例8
155.本对比例与实施例7相比，区别仅在于将步骤2)中植物乳杆菌菌液替换为红曲霉菌菌液，且加入量相同，其他原料、添加量以及制备方法与实施例7相同。
156.试验例1：总黄酮含量的测定
157.本测试例对上述实施例1-21的植物发酵物，以及对比例1-8的植物发酵物或复合提取物(以下简称“样品”)中的总黄酮含量进行测试。具体测试方法如下：
158.将样品溶液的总黄酮浓度调整到测定范围，精确吸取2.0ml置于干燥洁净试管中，加入5％亚硝酸钠溶液0.2ml，摇匀后放置5min，加入10％硝酸铝溶液0.2ml后摇匀，放置6min后加入5％氢氧化钠溶液1.0ml，加入溶剂至刻度，摇匀样品试液。每个浓度做3个重复。样品溶液在510nm波长下迅速测定各管吸光值。根据芦丁溶液的标准曲线，由样品溶液吸光值计算其总黄酮的浓度，样品中的总黄酮含量以芦丁表示。
159.试验例2：槲皮苷的含量测定
160.本测试例对上述实施例1-21的植物发酵物，以及对比例1-8的植物发酵物或复合提取物(以下简称“样品”)中的槲皮苷含量进行测试。具体测试方法如下：
161.测试样品制备：取样品5ml，加入5ml色谱级乙腈，混匀后在6000rpm/min下离心20min，取上清液，用0.45μm滤膜过滤后，即得测试样品。
162.色谱条件：使用agilent zorbax sb-c18色谱柱(4.6mm
×
250mm,5μm)；以0.1％磷酸(a)-乙腈(b)为流动相进行梯度洗脱(0min,15％b；10min,30％b；19min,30％b)，流速1.0ml/min；检测波长254nm；柱温25℃。
163.试验例1和试验例2的测试结果见表1所示。
164.表1
[0165][0166][0167]
由表1可知，与对比例1-8相比，实施例1-21的样品中总黄酮含量有很大的提高，这可能由于微生物能高效分离植物组织，使得活性成分更容易溶出；同时在前处理中加入牛乳和甘油，有助于低极性黄酮类成分的溶解，从而提高样品中总黄酮的含量。另外，槲皮苷的含量也有明显提高，可能是由于微生物中存在的活性酶，把其它成分进行转化而实现的。
[0168]
试验例3：细胞划痕实验
[0169]
本测试例对上述实施例1-21的植物发酵物，以及对比例1-8的植物发酵物或复合提取物(以下简称“样品”)进行细胞修复能力评价和对细胞迁移运动的影响测试。具体测试方法如下：
[0170]
用笔在6孔板背后，均匀划横线，横线间约间隔0.5-1cm。在孔中铺满人永生化表皮细胞(hacat)，第二天，待细胞铺满孔，用枪头在孔中按照6孔板预先涂画的横线，划细胞，用pbs洗细胞3次，去除划下的细胞，加入含1％(w/w)样品的细胞培养基，在37℃，5％co2培养箱中，培养24h，拍照，并统计24h的划痕愈合比例。以去离子水替代样品，作为空白对照组。评价结果如表2所示。
[0171]
表2
[0172][0173][0174]
由表2可知，与对比例1-8相比，实施例1-21的样品能更加有效地提升细胞迁移运动与修复能力，这表明本发明制备方法得到的植物发酵物对表皮细胞具有很好的修护功效。侧柏叶、圆柏叶、刺柏叶、卷柏叶未经过牛乳、甘油处理和微生物发酵，得到的产物可能会存在影响细胞活力的成分，导致产物对表皮细胞的修护功效显著降低。
[0175]
试验例4：对uv照射后hacat细胞内il-6和tnf-α含量的影响
[0176]
将人表皮角质形成细胞接种至6孔板中，在37℃和5％co2的培养箱孵育过夜。待6孔板中细胞铺板率达到50％-60％时，往空白组中加入细胞培养基，不做其他处理；往模型组中加入细胞培养基，往受试样品组加入含1％(w/w)样品的细胞培养基，预处理1h后，分别进行uvb(中波紫外线)辐照40min，辐射强度为30mj/cm2。处理后于37℃和5％co2的培养箱中继续培养24h。培养结束后，根据human il-6elisa kit(碧云天)、human tnf-αelisa kit(碧云天)操作方法，分别测定il-6和tnf-α含量。测试结果如表3所示。
[0177]
表3
[0178][0179][0180]
表3结果表明，相比于对比例1-8，实施例1-21制得的植物发酵物可以更加有效的降低uv照射后hacat细胞产生的炎症因子il-6和tnf-α的水平，表现出抗炎舒缓的活性。
[0181]
试验例5：对金黄色葡萄球菌和马拉色菌的作用
[0182]
菌悬液的配制：选择金黄色葡萄球菌(atcc6538)和糠秕马拉色菌(atcc14521)为试验菌。其中，糠秕马拉色菌是一种条件致病性真菌，在皮脂腺分泌旺盛的情况下大量繁殖，可引起毛囊炎、花斑癣等，已知与头屑产生、头皮健康密切相关；金黄色葡萄球菌也是皮肤常见的致病菌，通常可引起皮肤的丘疹或脓包。分别将试验菌用pbs制成菌悬液，浓度为5
×
106cfu/ml。
[0183]
抑菌圈试验：采用牛津杯法进行抑菌圈试验。吸取菌悬液100μl于已凝固的培养基表面，用无菌涂布棒涂抹均匀，盖好平皿，静置于20℃下10min；最后将无菌牛津杯轻轻倒立在培养基表面，滴加不同质量分数的样品溶液至液面与牛津杯表面平行，放入培养箱中37℃培养18h。参照企业标准《微生物抗菌评价值体外抑制细菌真菌测试作业指导书(药敏测试)》抑菌圈结果判定标准：抑菌圈直径》20mm为极度敏感，表示为++++；15-20mm为高度敏
感，表示为+++；10-15mm为中度敏感，表示为++；《10mm为低敏感，表示为+；0mm为无抑菌效果，表示为-。测试结果如表4所示。
[0184]
表4
[0185][0186]
从表4的测试结果可知，实施例1-21的样品在质量分数5％或1％的条件下均可对金黄色葡萄球菌和糠秕马拉色菌起到抑制效果。与对比例1-8的样品相比，在同等浓度下对金黄色葡萄球菌和糠秕马拉色菌的抑制有更强的效果。实施例1-21的样品对致病菌有很好的抑制效果，说明可以用于维持正常健康的皮肤微生态。
[0187]
试验例6：红细胞溶血性评价
[0188]
本测试例对上述实施例1-21的植物发酵物，以及对比例1-8的植物发酵物或复合提取物(以下简称“样品”)进行红细胞溶血性评价。红细胞溶血实验基本原理是通过测定血红蛋白溶出量及变性程度来评价化学品对眼组织细胞的损伤。本实验依照欧洲替代方法验证中心的实验测试方法及分级标准。其中hd50为50％红细胞发生溶血时的样品浓度，di为蛋白质变性指数，l/d为hd50与di的比值。评价标准见表5，评价结果见表6。
[0189]
表5
[0190]
l/d分级l/d》100无刺激性10《l/d≤100微刺激性1《l/d≤10轻度刺激性0.1《l/d≤1中毒刺激性l/d≤0.1重度刺激性
[0191]
表6
[0192][0193][0194]
由表6可知，除了对比例8为微刺激性之外，发酵前后和发酵所用的物料无刺激性，实施例1-21和对比例1-7的植物发酵物或复合提取物是相对温和的原料。
[0195]
应用例1
[0196]
本应用例提供了一种洗发水，该洗发水包括实施例7的植物发酵物。按质量百分数算，其配方见表7。应用例1的洗发水的制备方法按照本领域常规制备方法制备而成。
[0197]
表7
[0198][0199][0200]
应用对比例1
[0201]
应用对比例1与应用例1的区别在于，应用对比例1将实施例7的植物发酵物替换成对比例1的复合提取物，其他成分、用量以及制备方法与应用例1相同。
[0202]
试验例7：洗发水去屑舒缓功效评价
[0203]
选取志愿者60名，随机分为2组，年龄在20-50岁之间，男女各半。第1组分别在第1天、第3天、第5天、第7天使用应用例1的洗发水5g；第2组分别在第1天、第3天、第5天、第7天使用应用对比例1的洗发水5g。第8天进行受试者效果回访，受试者根据使用感受进行评分。评分标准采用10分制，分数越高，使用感越好。鳞屑的改善情况(0分为无改善，10分为明显改善)；瘙痒情况改善(0分为无改善，10分为明显改善)；整体使用感(0分为非常差，10分为非常好)。测试结果见表8。
[0204]
试验例8：洗发水控油功效评价
[0205]
招募20名头皮油脂分泌旺盛的自愿者，年龄在在20-30岁之间。若志愿者为女性避开生理周期，生活作息规律，尽量避免剧烈运动、暴晒、熬夜等。测试前一天晚上不洗头。测试前，志愿者在室内为温度20-22℃和湿度为40％-65％的房间内静坐30min，期间不能喝水和饮料。测试部位暴露，呈测试状态放置，保持放松。测试时间点为用样前、用样后即时、6小时、8小时。测试部位取前额-头顶5cm区域，用皮肤笔在测试区域画一个1cm
×
1cm的正方形。用样时，采用半头洗头。将头部延发际线中分，半边为空白对照，用清水洗头。另外半边为样
品区，用试验样洗头。用胶带条弯卷成一个圆环，使之与头皮接触，头皮中的类脂化合物(油脂)将使得这种测试胶带的透明度发生变化，然后将测试胶带条展平后放到头皮油脂测试仪的滑块中，把滑块推到仪器中。通过仪器中的光电管可以测试得到胶带上的透光率分布曲线，透光率曲线分布的峰值代表头皮中类脂化合物即油脂的含量，测试时胶带条的环状顶端正好是和头皮全部接触的部位。头皮油脂均值差的计算，空白对照组和样品组在不同时段的头皮油脂均值差＝空白对照组的头皮油脂含量-样品组的头皮油脂含量。测试结果见表9。
[0206]
表8
[0207]
样品去屑效果抗瘙痒效果整体使用感实施例78.68.08.5对比例16.26.47.3
[0208]
表9
[0209][0210]
由表8可知，相比应用对比例1的洗发水，应用例1添加了实施例7的植物发酵物的洗发水，志愿者在使用之后有明显的去屑和抗瘙痒效果，整体使用感也有很大提升。表明实施例7的植物发酵物不仅可以抑制il-6和tnf-α的产生，还可以抑制金黄色葡萄球菌和糠秕马拉色菌，洗发水的去屑和抗瘙痒效与原料的抗炎和抑菌的功效相关。
[0211]
另外，由表9可知，添加实施例7的植物发酵物的洗发水能够减缓头皮油脂的分泌，实现控油效果。
[0212]
以上对本发明的较佳实施方式进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可作出种种的等同变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本技术权利要求所限定的范围内。

技术特征：
1.一种植物发酵物，其特征在于，所述植物发酵物的制备原料包括：植物原料、牛乳、甘油和发酵菌株；所述植物原料包括侧柏叶、圆柏叶、刺柏叶、卷柏叶中的至少一种；所述发酵菌株包括植物乳杆菌、乳酸乳杆菌、长双歧杆菌中的至少一种。2.根据权利要求1所述的植物发酵物，其特征在于，所述植物原料、所述牛乳和所述甘油的用量比为(0.01-50g)：(0.01-50g)：1g。3.根据权利要求1所述的植物发酵物，其特征在于，所述植物发酵物含有活性成分，所述活性成分包括＞1mg/ml的总黄酮，以及＞80μg/ml的槲皮苷。4.根据权利要求1所述的植物发酵物，其特征在于，所述发酵菌株的浓度为10
5-10
10
cfu/ml。5.权利要求1-4任一项所述的植物发酵物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将所述植物原料、所述牛乳和所述甘油混合，高压均质，得到植物复合液；将所述植物复合液和所述发酵菌株混合，发酵，得到所述植物发酵物；所述高压均质的压力为20-100mpa。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在进行所述发酵前，还加入培养基；所述植物复合液、所述发酵菌株和所述培养基的用量比为(1-500g)：(0.01-10ml)：1g。7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述发酵的温度为20-45℃，所述发酵的时间为12-120h。8.权利要求1-4任一项所述的植物发酵物在制备化妆品或外用皮肤制剂中的应用。9.一种化妆品，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的植物发酵物。10.根据权利要求9所述的化妆品，其特征在于，所述化妆品包括洗发水、沐浴露或洗面奶。

技术总结
本发明属于微生物发酵技术领域，公开了一种控油舒缓的植物发酵物及其制备方法和应用。该植物发酵物的制备原料包括：植物原料、牛乳、甘油和发酵菌株；植物原料包括侧柏叶、圆柏叶、刺柏叶、卷柏叶中的至少一种；发酵菌株包括植物乳杆菌、乳酸乳杆菌、长双歧杆菌中的至少一种。本发明通过将高压均质和定向微生物发酵技术进行有机结合，在高压均质过程辅以牛乳和甘油，可以使植物组织细胞充分破碎，活性成分充分释放溶解，提高了原料的利用效率，高压均质得到的复合原液作为后续的发酵基质，通过微生物的生物转化能力，制备得到的植物发酵物具有显著控油舒缓功效。显著控油舒缓功效。


技术研发人员：何敬愉 林琳 潘丹阳 徐崇 张得香
受保护的技术使用者：广州环亚化妆品科技股份有限公司
技术研发日：2023.05.17
技术公布日：2023/8/9