耐受重金属且具有重金属处理能力的集胞藻基因工程菌及构建方法与应用

1.本发明属于工业微生物领域，具体涉及耐受重金属且具有重金属处理能力的集胞藻基因工程菌及构建方法与应用。


背景技术：

2.重金属是密度相对较高且在低浓度下具有毒性的金属化学元素。尽管重金属是地球的自然组成部分，但由于快速的工业化和城市化，重金属对环境造成了严重污染。近年来，释放到土壤或水圈中的镉(cd)、铜(cu)、铅(pb)、锌(zn)、汞(hg)、铬(cr)等化学物质，引起了越来越多的生态和全球公共卫生问题。例如，一些诸如铜、锌和镁的重金属，虽然是人体必需的微量元素，但它们的过度积累也造成严重损害。此外，其他重金属，特别是汞和铅，将导致严重的并发症，包括腹痛、血性腹泻和肾衰竭。因此，制定高效、低成本的重金属污染治理策略至关重要。
3.传统的重金属化学和物理处理方法通常成本高昂且效果较差。通过细菌、微藻和酵母等微生物进行经济环保的生物修复，已成为一种有希望的策略。其中，蓝藻是唯一进行产氧光合作用的原核生物，约占地球总固碳量的25％。除了作为主要生产者的传统角色外，蓝藻模型如集胞藻pcc 6803已被设计为“光驱动电池工厂”，直接从二氧化碳中生产几十种可再生燃料和化学品。更重要的是，蓝藻由于其丰富的重金属结合位点和结合亲和力，具有一定的生物修复潜力。例如，生物量为2.8g/l的发菜在15-30分钟内对铅和镉(80μg/ml)的去除效率分别达到85％和79％。此外，海洋蓝藻ccy0110释放的多糖被用作重金属的生物吸附剂，对cu
2+
、cd
2+
和pb
2+
的吸附效率分别约为18.4、23.5和16.5mg/g。然而，大多数重金属即使在低浓度下也对蓝藻有毒，这反过来限制了它们的生物修复能力。例如，虽然集胞藻pcc 7806对10mg/l cr
3+
溶液的吸附效率达到约75.4％，但由于生长明显受阻，在20mg/l的cr
3+
浓度下吸附效率显著降低。此外，toth等人证明，cd
2+
对集胞藻pcc6803的毒性作用涉及快速抑制co2依赖性电子传输，随后抑制ps ii电子传输和反应中心蛋白d1的降解。因此，亟需一种耐受重金属且具有重金属处理能力的集胞藻基因工程菌。


技术实现要素：

4.本发明的目的是克服现有技术的不足，提供耐受重金属且具有重金属处理能力的集胞藻基因工程菌。
5.本发明的第二个目的是提供耐受重金属且具有重金属处理能力的集胞藻基因工程菌的构建方法。
6.本发明的第三个目的是提供耐受重金属且具有重金属处理能力的集胞藻基因工程菌在重金属生物处理中的应用。
7.本发明的技术方案概述如下：
8.耐受重金属且具有重金属处理能力的集胞藻基因工程菌的构建方法，包括如下步
骤：
9.(1)构建载体pja2-p
tho-pcs-p
tho-mt：
10.将pja2-spe-p
tho-t
rbcl
质粒骨架与编码植物螯合蛋白合成酶的基因pcs通过重组连接组装成载体pja2-p
tho-pcs；
11.将pja2-spe-p
tho-t
rbcl
质粒骨架与编码金属硫蛋白的基因mt连接组装成载体pja2-p
tho-mt；
12.以pja2-p
tho-pcs为模板，以seq id no.10和seq id no.11所示核苷酸序列为上、下游引物，反向pcr扩增得到pja2-p
tho-pcs质粒骨架；
13.以pja2-p
tho-mt为模板，以seq id no.12和seq id no.13所示核苷酸序列为上、下游引物，pcr扩增得到p
tho-mt-t
rbcl
片段；
14.将pja2-p
tho-pcs质粒骨架与p
tho-mt-t
rbcl
片段通过重组连接，得到载体pja2-p
tho-pcs-p
tho
–
mt；
15.所述pja2-spe-p
tho-t
rbcl
质粒骨架的核苷酸序列如seq id no.1所示；
16.所述基因pcs的核苷酸序列如seq id no.2所示；
17.所述基因mt的核苷酸序列如seq id no.3所示；
18.(2)通过自然转化，将步骤(1)获得的载体pja2-p
tho-pcs-p
tho-mt转入集胞藻中，获得耐受重金属且具有重金属处理能力的集胞藻基因工程菌。
19.上述方法构建的耐受重金属且具有重金属处理能力的集胞藻基因工程菌。
20.上述耐受重金属且具有重金属处理能力的集胞藻基因工程菌在重金属生物处理中的应用。本发明的优点：
21.本发明的耐受重金属且具有重金属处理能力的集胞藻基因工程菌对cd
2+
、cu
2+
和zn
2+
等的耐受均有所提高，且在15μm cd
2+
处理两天后，集胞藻基因工程菌的干重、fv/fm、叶绿素a、类胡萝卜素都高于对照菌株；另外，上述集胞藻基因工程菌的活细胞和细胞冻干粉均对300μm cd
2+
有较好的处理能力；由cd
2+
、cu
2+
和zn
2+
组成的废水样品经上述集胞藻基因工程菌处理后能够培养正常的pcc 6803菌株。
附图说明
22.图1为载体pja2-p
tho-pcs-p
tho-mt示意图。
23.图2为耐受重金属且具有重金属处理能力的集胞藻基因工程菌(简称工程菌)和对照菌(含有空载体pja2-spe-p
tho-t
rbcl
)在添加不同重金属的生长曲线。图2-a为添加4.6μmcd
2+
；图2-b添加6μm cu
2+
；图2-c添加3μm zn
2+
。
24.图3为工程菌和对照菌在处理15μm cd
2+
两天后的生长参数。图3-a为干重；图3-b为fv/fm；图3-c为叶绿素a含量；图3-d为类胡萝卜素含量。
25.图4为工程菌的活细胞和细胞冻干粉均对300μm cd
2+
的处理。
26.图5为含cd
2+
、cu
2+
和zn
2+
的废水样品经工程菌冻干粉处理后培养的pcc 6803菌株的生长曲线。图5-a为处理15μm cd
2+
；图5-b为处理15μm cd
2+
、3μm zn
2+
；图5-c为处理15μm cd
2+
、3μm zn
2+
、6μm cu
2+
。
27.图中的6803-c为对照菌；6803-pm为工程菌。
dh5a和e.coli hb101的混合在一起，孵化30分钟。
48.(2)取1ml处于对数增长时期的pcc 6803(od
750nm
≈1)离心并重悬于0.2ml液体bg11培养基中。
49.(3)将步骤(2)获得的混合液体与步骤(1)获得的菌液混合，孵育30分钟。涂于含有无菌过滤膜(0.45微孔)固体bg11培养基上。在100μmol photons m-2
s-1
的强度下孵育24小时后，将过滤膜转移到一个新的含有50μg/ml壮观霉素的固体bg11培养基上。在200μmol photons m-2
s-1
的光照下培养7天后，可以看到单菌落，菌落pcr，验证得到工程菌株。
50.所述液体bg 11培养基：nano
3 1.5g，k2hpo4.3h2o 0.04g，mgso4·
7h2o 0.075g，edta 0.001g，na2co
3 0.0 2g，h3bo
3 2.86g，mncl2·
4h2o 1.81g，znso4·
7h2o 0.222g，namoo4·
5h2o 0.390g，cuso4·
5h2o 0.079g，co(no3)2·
6h2o 0.0494g，cacl2·
2h2o 0.036g，柠檬酸铁铵0.006g，加水至1l。
51.所述固体bg 11培养基：nano
3 1.5g，k2hpo4.3h2o 0.04g，mgso4·
7h2o 0.075g，edta 0.001g，na2co
3 0.0 2g，h3bo
3 2.86g，mncl2·
4h2o 1.81g，znso4·
7h2o 0.222g，namoo4·
5h2o 0.390g，cuso4·
5h2o 0.079g，co(no3)2·
6h2o 0.0494g，cacl2·
2h2o 0.036g，柠檬酸铁铵0.006g，琼脂15g，加水至1l。
52.实施例3
53.工程菌重金属耐受表型测定
54.1.在cd
2+
、cu
2+
、zn
2+
胁迫下测定生长曲线
55.(1)在100ml摇瓶中，加入25ml新鲜液体bg11(ph＝9，茶碱)培养基，加入40μg/ml壮观霉素；
56.(2)在液体bg11培养基中分别培养对照菌及实施例2中获得的工程菌到对数期(种子液)；测种子液od
750
nm，并按照初始od
750
nm为0.04计算需接入步骤(1)获得的培养基中；在培养开始时向该培养基中分别加入4.6μm cd
2+
、6μm cu
2+
、3μm zn
2+
进行金属胁迫实验测定，每隔24小时，取样在酶标仪od
750
nm下测量，每次做三个独立生物性重复。在4.6μm cd
2+
、6μm cu
2+
、3μm zn
2+
条件下，工程菌生长均比对照菌提高(见图2)。
57.所述液体bg 11(ph＝9，茶碱)培养基：在正常液体bg11培养基的基础上添加2.5g/l的tes(三羟甲基甲胺基乙磺酸)，0.36g/l茶碱，调节ph值至9，直接配制成茶碱浓度为2mm，ph为9的培养基。
58.2.在15μm cd
2+
胁迫下测定各种参数
59.(1)工程菌干重和对照菌干重的测量：
60.在25ml液体bg11培养基中接种工程菌株和对照菌株使酶标仪测定od
750 nm
为0.04，每组设置三个平行，培养两天后加入15μm cd
2+
，继续培养两天，取20ml细胞液，7500rpm，5min离心收集菌体，使用真空冷冻干燥机冻干2天，称取对应菌体的重量，得到的菌体重量除以体积即对应菌株的干重数据(见图3a)。
61.(2)工程菌和对照菌fv/fm的测量：
62.在25ml液体bg11培养基中接种工程菌株和对照菌株使酶标仪测定od
750 nm
为0.04，每组设置三个平行，培养两天后加入15μm cd
2+
，继续培养两天。取3ml细胞液，暗处理15min，使用aquapen-c ap 110-c测量fv/fm(见图3b)。
63.(3)工程菌和对照菌的叶绿素a含量和类胡萝卜素含量的测定：
64.在25ml液体bg11培养基中接种工程菌株和对照菌株使酶标仪测定od
750 nm
为0.04，每组设置三个平行，培养两天后加入15μm cd
2+
，继续培养两天。取1ml od
750 nm
为0.4的细胞培养液，7500rpm，5min离心收集菌体，加入1ml的纯甲醇(4℃，预冷)重悬菌体，4℃萃取20min。12000，5min离心后取1-2ml上清液，使用紫外分光光度计测定od
665 nm
、od
470 nm
和od
720 nm
，通过公式叶绿素a含量[μg/ml]＝稀释倍数*12.9447*(od
665 nm-od
720 nm
)；类胡萝卜素含量[μg/ml]＝稀释倍数*[1,000*(od
470 nm-od
720 nm
)-2.86*(叶绿素a含量)]/221计算叶绿素a(图3c)和类胡萝卜素含量(图3d)。
[0065]
实施例4
[0066]
工程菌应用于重金属处理
[0067]
1.工程菌应用于不同浓度的cd
2+
处理
[0068]
处理300μm cd
2+
：在25ml液体bg11(ph＝9，茶碱)培养基中接种工程菌株使酶标仪测定od
750 nm
为0.04，培养2天，取30个od
750nm
的细胞，用20ml的液体bg11(ph＝9，茶碱)培养基重悬，一部分进行活细胞处理300μm cd
2+
；一部分进行真空冷冻冻干，再将冻干后的菌体均匀的溶解在20ml的液体bg11培养基中，处理1天，对剩余的cd
2+
进行定量，工程菌的处理量为起始添加量与剩余量的差值。(图4)
[0069]
剩余cd
2+
定量：7500rpm，5min离心取上清。上清液用4.5μm的过滤膜过滤后，每25ml添加3ml的浓硝酸。将添加硝酸的样品，170℃加热处理2-3h，当样品体积浓缩10倍左右时停止硝解。将硝解完成的样品转移到新的15ml离心管中，定容到硝解前的1/2。样品通过电感耦合等离子体质谱(icp-ms)进行cd
2+
的定量。
[0070]
2.工程菌冻干粉处理后的重金属废水样品应用于集胞藻培养
[0071]
在25ml液体bg11(ph＝9，茶碱)培养基中接种工程菌株使酶标仪测定od
750 nm
为0.04，培养5天，3500rpm，5min离心收集菌体，液体bg11培养基清洗3次，使用真空冷冻干燥机冻干2天，得到工程菌冻干粉。将6od的工程菌冻干粉分别加入20ml含15μmcd
2+
或15μm cd
2+
、3μm zn
2+
或15μm cd
2+
,3μm zn
2+
和6μm cu
2+
的废水样品中，处理2天。然后分别通过0.22μm滤膜过滤菌体，得到滤液为培养基，在25ml该培养基中接种野生型集胞藻pcc 6803使酶标仪测定od
750 nm
为0.04，每组设置三个平行，每隔24h取200μl菌液使用酶标仪测定od
750 nm
，并绘制生长曲线。(图5)
[0072]
图5中：
[0073]
bg11：液体bg11培养基；
[0074]
bg11+cd
2+
：在液体bg11培养基中分别添加cd
2+
；
[0075]
bg11+cd
2+
+zn
2+
：在液体bg11培养基中分别添加cd
2+
和zn
2+
；
[0076]
bg11+cd
2+
+zn
2+
+cu
2+
：在液体bg11培养基中分别添加cd
2+
和zn
2+
和cu
2+
；
[0077]
bg11+cd
2+-pm是通过工程菌处理后的废水样品；
[0078]
bg11+cd
2+
+zn
2+-pm是通过工程菌处理后的废水样品；
[0079]
bg11+cd
2+
+zn
2+
+cu
2+-pm是通过工程菌处理后的废水样品。

技术特征：
1.耐受重金属且具有重金属处理能力的集胞藻基因工程菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：(1)构建载体pja2-p
tho-pcs-p
tho-mt：将pja2-spe-p
tho-t
rbcl
质粒骨架与编码植物螯合蛋白合成酶的基因pcs通过重组连接组装成载体pja2-p
tho-pcs；将pja2-spe-p
tho-t
rbcl
质粒骨架与编码金属硫蛋白的基因mt连接组装成载体pja2-p
tho-mt；以pja2-p
tho-pcs为模板，以seq id no.10和seq id no.11所示核苷酸序列为上、下游引物，反向pcr扩增得到pja2-p
tho-pcs质粒骨架；以pja2-p
tho-mt为模板，以seq id no.12和seq id no.13所示核苷酸序列为上、下游引物，pcr扩增得到p
tho-mt-t
rbcl
片段；将pja2-p
tho-pcs质粒骨架与p
tho-mt-t
rbcl
片段通过重组连接，得到载体pja2-p
tho-pcs-p
tho
–
mt；所述pja2-spe-p
tho-t
rbcl
质粒骨架的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述基因pcs的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述基因mt的核苷酸序列如seq id no.3所示；(2)通过自然转化，将步骤(1)获得的载体pja2-p
tho-pcs-p
tho-mt转入集胞藻中，获得耐受重金属且具有重金属处理能力的集胞藻基因工程菌。2.权利要求1的方法构建的耐受重金属且具有重金属处理能力的集胞藻基因工程菌。3.权利要求2的耐受重金属且具有重金属处理能力的集胞藻基因工程菌在重金属生物处理中的应用。

技术总结
本发明公开了耐受重金属且具有重金属处理能力的集胞藻基因工程菌及构建方法与应用，构建：构建载体pJA2-P


技术研发人员：孙韬 霍怀舒 陈磊 解亚茹 张卫文
受保护的技术使用者：天津大学
技术研发日：2023.03.16
技术公布日：2023/8/9