一种基于高分子扩增信号放大的免疫分析方法

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于高分子扩增信号放大的免疫分析方法。


背景技术：

2.蛋白药物相比其他药物具有多种优势，如特异性强、相容性好。尽管如此，蛋白质或者多肽类药物仍然存在些许局限性，如细胞摄取低、生物利用率低、容易受到环境干扰、易失活等，这些局限性正阻碍着蛋白质药物的开发与利用。
3.蛋白质在人体内的各项生理活动中发挥着至关重要的作用，对蛋白质分子的灵敏特异性检测在分子诊断学研究和生物医药领域具有重要意义。为了提高蛋白质检测方法的灵敏度、降低检测限，开发一种合适的信号放大方法是十分必要的。近年来，高分子偶联蛋白质的技术发展日新月异，通过偶联高分子可以赋予蛋白质新的功能与性质，在药物传输、医疗诊断等多个领域展现了广阔的应用前景。其中，多个高分子重复单元的聚集，可以起到信号放大的作用，在生物分析中具有潜在的应用价值。本发明发展一种新型的蛋白质-高分子偶联物合成方法，并在此基础上开发出一种便捷的、快速的信号放大方法以应用于蛋白质的免疫分析。
4.牛血清白蛋白（bsa）是一种球状蛋白，因其具备价格低、易获得性且与人血清白蛋白（hsa）的高度结构同源性等优点，在各种生化分析中被公认为是最受欢迎的模板。同样，bsa在与人类相关的各种疾病的病理学（如糖尿病、疯牛病、肾病等）中也存在着极其重要的意义。因此，本发明开发出了一种能够快速、精准地检测bsa的方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的针对现有技术中蛋白质分子检测灵敏度低的问题，于提供一种基于高分子扩增信号放大的免疫分析方法，实现基于photo atrp技术的信号放大策略在生物分析中的应用，发展出一种快速、简便、廉价、无酶的级联放大检测技术。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种基于高分子扩增信号放大的免疫分析方法，包括以下步骤：（1）二氧化硅微球的表面修饰：利用aptms和戊二醛对二氧化硅微球表面进行化学修饰，获得醛基-氨基-功能化二氧化硅微球溶液；（2）负载抗原蛋白分子的二氧化硅微球的制备：利用抗原蛋白分子的氨基与醛基-氨基-功能化二氧化硅微球表面的醛基进行醛胺缩合形成希夫碱，从而以共价交联的形式将抗原蛋白分子固定在二氧化硅微球表面的负载抗原蛋白分子的二氧化硅微球；（3）封闭二氧化硅微球表面的非特异性结合位点；使用封闭剂封闭微球表面的非特异性结合位点；（4）抗体igg-光引发剂大分子的制备：利用高碘酸钠的强氧化性打开抗体igg糖基化位点的六元环，形成醛基，随后将光引发剂与醛基进行定点的肟化反应，合成抗体igg-光
引发剂大分子；（5）光介导atrp反应竞争免疫检测抗原蛋白分子含量：将抗原蛋白分子样品溶液、封闭非特异性位点的负载抗原蛋白分子的二氧化硅微球溶液和抗体igg
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光引发剂大分子溶液加入聚合溶液中；在催化剂的作用下，抗体igg
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光引发剂大分子与聚合溶液中的配体、信号分子单体通过photo atrp反应共聚形成带有光引发剂标签的抗体igg
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高分子偶联物；利用抗原抗体之间的特异性识别能力，样品中待检测的抗原蛋白分子与固定在二氧化硅微球表面的抗原蛋白分子共同竞争带有光引发剂标签的抗体igg
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高分子偶联物，间接地将抗体igg
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高分子偶联物固定在二氧化硅微球表面，通过荧光强度变化检测抗原蛋白分子含量。
7.进一步的，上述方法中所述抗原蛋白分子包括但不限于牛血清白蛋白bsa、卵清白蛋白ova、人血清白蛋白hsa。
8.进一步的，上述方法中步骤（1）二氧化硅微球的表面修饰，具体包括以下步骤:1) 二氧化硅微球的表面修饰：将按照二氧化硅微球与3-氨丙基三甲氧基硅烷1:10的摩尔比例将1mg/ml的二氧化硅微球悬浮液与3-氨丙基三甲氧基硅烷混合，混合物在4℃下连续搅拌18 h，离心收集沉淀，用无水乙醇和超纯水分别洗涤三次，再用超纯水分散，获得氨基功能化的二氧化硅微球溶液备用；2）将2.5wt%戊二醛溶液加入氨基功能化的二氧化硅微球溶液中，室温快速搅拌反应2 h，反应结束后，将得到的醛基-氨基-功能化二氧化硅微球混合物离心得到沉淀，用超纯水洗涤三次，并在pbs中重新分散获得醛基-氨基-功能化二氧化硅微球溶液。
9.进一步的，上述方法中步骤（2）负载抗原蛋白分子的二氧化硅微球的制备，具体包括：将醛基-氨基-功能化二氧化硅微球溶液与抗原蛋白分子溶液混合，4℃搅拌24 h，洗涤离心收集沉淀并分散于pbs溶液中，获得负载抗原蛋白分子的二氧化硅微球。
10.上述步骤（3）封闭二氧化硅微球表面的非特异性结合位点，具体包括：取制备好的负载抗原蛋白分子的二氧化硅微球，加入经pbs溶液按 1:20体积比稀释的血清，混匀并置于37℃混匀连续搅拌反应2 h，以封闭二氧化硅微球表面未被结合的非特异性位点；pbst缓冲液洗涤三次，离心收集沉淀并分散于pbs溶液中，获得封闭非特异性位点的负载抗原蛋白分子的二氧化硅微球溶液。
11.进一步的，上述方法中步骤（4）抗体igg-光引发剂大分子的制备，具体包括以下步骤：1）igg的氧化：将高碘酸钠溶液加入浓度为1 mg/ml的igg溶液中，快速混匀，放置在碎冰上避光反应30 min；利用高碘酸钠的强氧化性打开bsa抗体igg糖基化位点的六元环形成醛基；氧化反应完成后，将亚焦硫酸钠溶液加入氧化反应溶液中，终止反应5 min，反应完成后，置于pbs缓冲液中，4℃搅拌透析24 h，获得igg氧化反应溶液；其中igg：高碘酸钠：亚焦硫酸钠的摩尔比为1：10：10；2）igg
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光引发剂大分子的合成：在步骤1）igg-i氧化反应溶液中加入光引发剂2-氨氧基-3-溴-2-甲基丁酸酯溶液，快速混匀后将混合溶液放置在37℃的水浴锅中光引发剂与醛基进行定点的肟化反应反应1h，反应完成后，置于pbs缓冲液中，4℃搅拌透析24 h，获得igg
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光引发剂大分子溶液；其中igg：光引发剂的摩尔比为1：200。
12.进一步的，上述方法中步骤（5）光介导atrp反应竞争免疫检测bsa含量，具体包括
以下步骤：1）将封闭非特异性位点的二氧化硅微球溶液、抗原蛋白分子样品溶液和抗体igg
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光引发剂大分子溶液加入聚合溶液中混匀后制成混合体系，盖上橡皮塞使其成为一个密闭空间，并避光；在氮气氮气环境下除氧20 min后，打开紫外灯，开启photo atrp反应；photo atrp反应共聚形成带有光引发剂标签的抗体igg
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高分子偶联物igg-nipam-foa；样品中待检测的目标物抗原蛋白分子与固定在二氧化硅微球表面的抗原蛋白分子共同竞争带有光引发剂标签的抗体igg
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高分子偶联物，间接地将抗体igg
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高分子偶联物固定在微球表面；紫外照射反应30 min后，将混合体系暴露在空气中，终止反应；其中所述封闭非特异性位点的负载抗原蛋白分子的二氧化硅微球溶液的浓度为1mg/ml，抗体igg
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光引发剂大分子溶液的浓度为50 ug/ml；所述抗原蛋白分子样品溶液的浓度为0.1ng/ml~5000ng/ml；所述封闭非特异性位点的负载抗原蛋白分子的二氧化硅微球溶液、抗原蛋白分子样品溶液和抗体igg
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光引发剂大分子溶液的体积比为100μl：50μl：100μl。
13.2）终止反应后的溶液用荧光光谱仪测定激发波长为 468 nm、发射波长为512 nm 处的荧光强度，通过与标准曲线的对比，获得样品溶液中抗原蛋白分子的浓度。
14.进一步的，上述一种基于高分子扩增信号放大的免疫分析方法在免疫检测中的应用。
15.本发明方法的原理：为了实现基于原子转移自由基聚合（atom transfer radical polymerization，atrp）技术的信号放大策略在生物分析中的应用，将借鉴构建蛋白质-高分子偶联物的机理与方法，构建一种竞争免疫测定的形式用于bsa的定量分析。利用3－氨基丙基－三甲氧基硅烷（aptms）与戊二醛（ga）对二氧化硅微球表面进行化学修饰。并利用bsa上的氨基与微球表面的醛基进行醛胺缩合形成希夫碱，从而以共价交联的形式将bsa固定在其表面。使用封闭剂（sealing agent ,血清）封闭微球表面的非特异性结合位点，防止检测结果产生假阳性。接着利用抗原抗体之间的特异性识别能力，样品中待检测的目标物bsa与固定在微球表面的bsa共同竞争定量的、带有光引发剂(photoinitiator)标签的bsa igg-光引发剂大分子。通过简单的离心清洗步骤后，间接地将igg-光引发剂大分子选择性固定在微球表面（原理见图1）。最后，在紫外光的照射下，利用基于photo atrp技术的信号放大策略，在固定有光引发剂大分子处定向接枝荧光高分子。随着溶液中bsa浓度的增加，二氧化硅微球表面的光引发剂大分子含量下降，整体溶液的荧光强度亦随之下降。在一定范围内，建立bsa浓度与荧光强度的负线性相关关系，并对实际样品进行分析。
16.本发明的显著优势在于：（1）按本发明方法通过光催化的表面引发聚合技术，将蛋白质-高分子偶联物与生物分析结合在一起，成功地开发出用于bsa的定量分析的方法。在以二氧化硅微球作为固相载体材料的基础上，预先包被目标分析物bsa，利用抗原抗体的特异性识别反应，将事先接枝了光引发剂的抗bsa igg-i大分子间接地固定在微球表面，构建出“竞争”免疫检测方法。
17.（2）本发明的传感方法结合了二氧化硅材料和光催化表面引发atrp聚合的优点，与传统的信号放大方法相比，是一种新颖、方便、简单、无酶的级联放大方法。
附图说明
18.图1为基于高分子扩增信号放大的免疫分析方法原理图。
19.图2为抗bsa igg-nipam-foa蛋白电泳图（左）和荧光光谱图（右）。
20.图3为二氧化硅微球修饰前后的zeta电位变化情况。
21.图4为二氧化硅微球修饰后的粒径变化情况。
22.图5 bsa浓度与荧光强度的标准曲线图。
23.图6为 bsa检测方法的特异性。
具体实施方式
24.为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
25.实施例1一种基于高分子扩增信号放大的免疫分析方法，包括以下步骤：（1）二氧化硅微球的表面修饰：利用aptms和戊二醛对二氧化硅微球表面进行化学修饰，获得醛基-氨基-功能化二氧化硅微球（sio
2-nh
2-cho）溶液。具体包括以下步骤:1) 二氧化硅微球的表面修饰：本实验所采用的二氧化硅微球（sio2）来源于苏州纳微科技股份有限公司。将二氧化硅微球配置浓度成1mg/ml的悬浮液，随后用超声分散30 min，取600 μl的悬浮液加入反应容器内，接着将按照二氧化硅微球与3-氨丙基三甲氧基硅烷（aptms）1:10的摩尔比例量取3-氨丙基三甲氧基硅烷加入容器内，混合物在4℃下连续搅拌18 h，将得到的氨基功能化的二氧化硅微球（sio
2-nh2）在5000 rpm下离心10 min收集，用无水乙醇和超纯水分别洗涤三次，再用超纯水分散，获得1mg/ml氨基功能化的二氧化硅微球（sio
2-nh2）溶液备用。
26.2）将2 ml 2.5wt%戊二醛溶液加入氨基功能化的二氧化硅微球（sio
2-nh2）溶液中，室温快速搅拌反应2 h，反应结束后，将得到的醛基-氨基-功能化二氧化硅微球（sio
2-nh
2-cho）混合物在5000 rpm下离心10 min得到沉淀，用超纯水洗涤三次，并在pbs中重新分散获得1mg/ml醛基-氨基-功能化二氧化硅微球（sio
2-nh
2-cho）溶液。
27.（2）负载bsa的二氧化硅微球（sio
2-bsa）的制备：利用bsa上的氨基与醛基-氨基-功能化二氧化硅微球表面的醛基进行醛胺缩合形成希夫碱，从而以共价交联的形式将bsa固定在二氧化硅微球表面。
28.准确量取200 μl 1mg/ml的醛基-氨基-功能化二氧化硅微球（sio
2-nh
2-cho）溶液，加入1 ml的bsa溶液（2 mg/ml），4℃环境下以200pm的搅拌速度匀速搅拌24 h，pbs洗涤三次，3000 rpm离心10 min，收集沉淀并分散于pbs溶液中，获得1mg/ml的负载bsa的二氧化硅微球（sio
2-bsa）4℃保存备用。收集离心后的上清液用于测蛋白含量。
29.（3）封闭二氧化硅微球表面的非特异性结合位点：取1 ml制备好的1mg/ml的负载bsa的二氧化硅微球（sio
2-bsa），加入1 ml的血清（pbs溶液 1:20稀释），混匀并置于37℃混匀连续搅拌反应2 h，以封闭二氧化硅微球表面未被结合的非特异性位点。pbst缓冲液洗涤三次，3000 rpm离心10 min，收集沉淀并分散于pbs溶液中，获得1mg/ml的封闭非特异性位点的负载bsa的二氧化硅微球溶液；（4）bsa抗体igg-光引发剂大分子的制备：利用高碘酸钠的强氧化性打开bsa抗体
igg糖基化位点的六元环，形成醛基，随后将光引发剂与醛基进行定点的肟化反应，合成bsa抗体igg-光引发剂大分子。具体包括以下步骤：1）bsa抗体igg的氧化：将高碘酸钠溶液加入浓度为1 mg/ml的bsa抗体igg溶液中，快速混匀，放置在碎冰上避光反应30 min；氧化反应完成后，将亚焦硫酸钠溶液加入氧化反应溶液中，终止反应5 min，反应完成后，置于pbs缓冲液中，4℃搅拌透析24 h，获得igg氧化反应溶液；其中igg：高碘酸钠：亚焦硫酸钠的摩尔比为1：10：10；2）bsa抗体igg
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光引发剂大分子的合成：在步骤1）igg-i氧化反应溶液中加入光引发剂（2-氨氧基-3-溴-2-甲基丁酸酯）溶液，快速混匀后将混合溶液放置在37℃的水浴锅中反应1h，反应完成后，置于pbs缓冲液中，4℃搅拌透析24 h，获得bsa抗体igg
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光引发剂大分子溶液；其中bsa抗体igg：光引发剂的摩尔比为1：200。所述光引发剂固体溶于pbs溶液中制成光引发剂溶液。
30.（5）光介导atrp（photo atrp）反应检测bsa含量：将bsa样品溶液、封闭非特异性位点的负载bsa的二氧化硅微球溶液和bsa抗体igg
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光引发剂大分子溶液加入聚合溶液中；在催化剂的作用下，bsa抗体igg
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光引发剂大分子与聚合溶液中的配体、信号分子单体通过photo atrp反应共聚形成bsa抗体igg
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高分子偶联物；利用抗原抗体之间的特异性识别能力，样品中待检测的目标物bsa与固定在二氧化硅微球表面的bsa共同竞争带有光引发剂标签的igg
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高分子偶联物，间接地将igg
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高分子偶联物固定在微球表面。具体包括以下步骤：1）将封闭非特异性位点的负载bsa的二氧化硅微球溶液、bsa样品溶液和bsa抗体igg
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光引发剂大分子溶液加入聚合溶液中混匀后制成混合体系，盖上橡皮塞使其成为一个密闭空间，并避光；在氮气氮气环境下除氧20 min后，打开紫外灯，开启photo atrp反应；紫外照射反应30 min后，将混合体系暴露在空气中，终止反应；所述聚合溶液为：800ml的溶剂水和20mg催化剂cubr，室温混合均匀后，加入配体15ml的三(2-二甲氨基乙基)胺（me6tern）、10mg信号分子单体n-异丙基丙烯酰胺（nipam）和10mg信号分子荧光单体荧光素-o
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丙烯酸酯（foa）。
31.所述封闭非特异性位点的负载bsa的二氧化硅微球溶液的浓度为1mg/ml，bsa抗体igg
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光引发剂大分子溶液的浓度为50 ug/ml；所述bsa样品溶液的浓度为0.1ng/ml~5000ng/ml。
32.所述封闭非特异性位点的负载bsa的二氧化硅微球溶液、bsa样品溶液和bsa抗体igg
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光引发剂大分子溶液的体积比为100μl：50μl：100μl。
33.所述共聚形成bsa抗体igg
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高分子偶联物为igg-nipam-foa偶联物。
34.2）终止反应后的溶液用荧光光谱仪测定激发波长为 468 nm、发射波长为512 nm 处的荧光强度，通过与标准曲线的对比，获得样品溶液bsa的浓度。
35.bsa抗体igg大分子接枝上nipam（n-异丙基丙烯酰胺）蛋白电泳图，结果如图2（左）所示。原样igg的条带清晰可见，可明显观察到高碘酸钠与光引发剂的处理对igg蛋白分子量没有影响，而经过photo atrp反应后的泳带，原蛋白条带几乎消失，代替出现的是一条高分子量、宽分布的条带，证明了igg-i大分子接枝上nipam单体。
36.为igg-nipam-foa荧光光谱图，见图2（右）。原样条带igg从图中可以看到经过氧化引发后未对条带造成影响，条带仍然清晰。在经过nipam单体与foa荧光单体聚合后，原蛋白
条带几乎消失，而所呈现的是一条带有荧光的模糊的条带，证明了igg大分子接枝上了nipam与foa单体。对其进行光谱扫描后可以发现条带上呈现出荧光光泽，进一步地证明了nipam与foa单体成功的被聚合上。
37.二氧化硅微球修饰前后的电位，结果如图3所示。sio2原样的zeta电位为
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38.56 mv，说明溶液具有较好的稳定性。经过aptms修饰及戊二醛处理后，溶液体系的zeta电位转变为带负电荷的
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3.57 mv，且绝对值基本不变，说明体系仍处于易凝聚的不稳定状态。这是因为醛基（-cho）本身具有亲水性，并且o、c的电负性都大于h（o又大于c），h的电子会偏向，导致h呈电正性、o呈负电，从而使得醛基整体带负电荷。经过photo atrp反应后，zeta电位由负电荷转变为了正电荷，且绝对值增大，这可能是微球表面接枝的高分子链引起的。对照组为未经过任何修饰的sio2，与原样相比，zeta电位的绝对值有所增加，这可能是因为二氧化硅微球表面非特异性吸附了单体，增加了颗粒之间的排斥力。
38.二氧化硅微球修饰后的粒径，结果如图4所示。如图4可见，经过一系列修饰后二氧化硅微球（sio2）的粒径变化情况，sio2原样的粒径约为1
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m，接着用戊二醛处理经过aptms修饰后的颗粒，在其表面包裹一层醛基，形成sio
2-nh-cho颗粒。从粒径上看，增加到1.433
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m，分散性有所增加。最后，经过聚合反应后，在sio
2-i表面的引发剂位点原位处接枝了高分子链（sio
2-i-pnipam-o-foa）。其粒径明显增大，为4.316
ꢀµ
m，分散度进一步下降。其粒径的变化证明了对二氧化硅微球的每一步修饰都是成功的，并且最终利用抗bsa igg-i大分子的引发剂位点在其表面原位接枝上了高分子链。
39.实施例2 标准曲线的构建配置不同浓度的bsa 标准溶液（浓度分别为 0 ng/ml、0.1 ng/ml、0.2 ng/ml、0.4 ng/ml、0.6 ng/ml、0.8 ng/ml 1 ng/ml、2 ng/ml、4 ng/ml、8 ng/ml、16 ng/ml、32 ng/ml、64 ng/ml、128 ng/ml、512 ng/ml、1024 ng/ml、2048 ng/ml、4096 ng/ml、5000 ng/ml、10000 ng/ml），每个浓度设置 3 个平行样品，空白对照为二氧化硅微球原液（sio2）。将1mg/ml的封闭非特异性位点的负载bsa的二氧化硅微球溶液、不同浓度的bsa标准溶液和50 ug/mlbsa抗体igg
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光引发剂大分子溶液按体积比为100μl：50μl：100μl加入聚合溶液【800ml的溶剂水和20mg催化剂cubr，室温混合均匀后，加入配体15ml的三(2-二甲氨基乙基)胺（me6tern）、10mg信号分子单体n-异丙基丙烯酰胺（nipam）和10mg信号分子荧光单体荧光素-o
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丙烯酸酯（foa）】中混匀后制成混合体系，盖上橡皮塞使其成为一个密闭空间，并避光；在氮气氮气环境下除氧20 min后，打开紫外灯，开启photo atrp反应；紫外照射反应30 min后，将混合体系暴露在空气中，终止反应；终止反应后的溶液用荧光光谱仪测定激发波长为 468 nm、发射波长为512 nm 处的荧光强度。以 bsa 浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线。
40.标准曲线见图5。荧光强度与log c bsa在0.1 ng/ml ~ 5000 ng/ml之间存在着良好的线性关系，线性方程为y=2.91
×
107-4318363*log cbsa，r2=0.9921。
41.实施例3检测bsa的方法。
42.a、bsa检测方法的特异性。
43.本发明选择了1mg/ml的蜗牛酶（sa）、牛血清白蛋白（bsa）、卵清白蛋白（ova）三组统一配置浓度为来作为特异性检验的实验对象，并且另设了pbs缓冲溶液组及空白对照组作为参照。如图6所示，在激发波长468 nm、发射波长512 nm处测定溶液的荧光强度，只有目
标物bsa的荧光信号值最高。其他物质的信号值均较低，说明该检测方法基本能够特异性检测bsa，不受其他物质干扰，该方法检测bsa具有良好的特异性。

技术特征：
1.一种基于高分子扩增信号放大的免疫分析方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）二氧化硅微球的表面修饰：利用aptms和戊二醛对二氧化硅微球表面进行化学修饰，获得醛基-氨基-功能化二氧化硅微球溶液；（2）负载抗原蛋白分子的二氧化硅微球的制备：利用抗原蛋白分子的氨基与醛基-氨基-功能化二氧化硅微球表面的醛基进行醛胺缩合形成希夫碱，从而以共价交联的形式将抗原蛋白分子固定在二氧化硅微球表面的负载抗原蛋白分子的二氧化硅微球；（3）封闭二氧化硅微球表面的非特异性结合位点；使用封闭剂封闭微球表面的非特异性结合位点；（4）抗体igg-光引发剂大分子的制备：利用高碘酸钠的强氧化性打开抗体igg糖基化位点的六元环，形成醛基，随后将光引发剂与醛基进行定点的肟化反应，合成抗体igg-光引发剂大分子；（5）光介导atrp反应竞争免疫检测抗原蛋白分子含量：将抗原蛋白分子样品溶液、封闭非特异性位点的负载抗原蛋白分子的二氧化硅微球溶液和抗体igg
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光引发剂大分子溶液加入聚合溶液中；在催化剂的作用下，抗体igg
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光引发剂大分子与聚合溶液中的配体、信号分子单体通过photo atrp反应共聚形成带有光引发剂标签的抗体igg
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高分子偶联物；利用抗原抗体之间的特异性识别能力，样品中待检测的抗原蛋白分子与固定在二氧化硅微球表面的抗原蛋白分子共同竞争带有光引发剂标签的抗体igg
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高分子偶联物，间接地将抗体igg
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高分子偶联物固定在二氧化硅微球表面，通过荧光强度变化检测抗原蛋白分子含量。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述步骤（1）二氧化硅微球的表面修饰，具体包括以下步骤:1) 二氧化硅微球的表面修饰：将按照二氧化硅微球与3-氨丙基三甲氧基硅烷1:10的摩尔比例将1mg/ml的二氧化硅微球悬浮液与3-氨丙基三甲氧基硅烷混合，混合物在4℃下连续搅拌18 h，离心收集沉淀，用无水乙醇和超纯水分别洗涤三次，再用超纯水分散，获得氨基功能化的二氧化硅微球溶液备用；2）将2.5wt%戊二醛溶液加入氨基功能化的二氧化硅微球溶液中，室温快速搅拌反应2 h，反应结束后，将得到的醛基-氨基-功能化二氧化硅微球混合物离心得到沉淀，用超纯水洗涤三次，并在pbs中重新分散获得醛基-氨基-功能化二氧化硅微球溶液。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述步骤（2）负载抗原蛋白分子的二氧化硅微球的制备，具体包括：将醛基-氨基-功能化二氧化硅微球溶液与抗原蛋白分子溶液混合，4℃搅拌24 h，洗涤离心收集沉淀并分散于pbs溶液中，获得负载抗原蛋白分子的二氧化硅微球。4.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述步骤（3）封闭二氧化硅微球表面的非特异性结合位点，具体包括：取制备好的负载抗原蛋白分子的二氧化硅微球，加入经pbs溶液按 1:20体积比稀释的血清，混匀并置于37℃混匀连续搅拌反应2 h，以封闭二氧化硅微球表面未被结合的非特异性位点；pbst缓冲液洗涤三次，离心收集沉淀并分散于pbs溶液中，获得封闭非特异性位点的负载抗原蛋白分子的二氧化硅微球溶液。5.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述步骤（4）抗体igg-光引发剂大分子的制备，具体包括以下步骤：
1）igg的氧化：将高碘酸钠溶液加入浓度为1 mg/ml的igg溶液中，快速混匀，放置在碎冰上避光反应30 min；利用高碘酸钠的强氧化性打开bsa抗体igg糖基化位点的六元环形成醛基；氧化反应完成后，将亚焦硫酸钠溶液加入氧化反应溶液中，终止反应5 min，反应完成后，置于pbs缓冲液中，4℃搅拌透析24 h，获得igg氧化反应溶液；其中igg：高碘酸钠：亚焦硫酸钠的摩尔比为1：10：10；2）igg
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光引发剂大分子的合成：在步骤1）igg-i氧化反应溶液中加入光引发剂2-氨氧基-3-溴-2-甲基丁酸酯溶液，快速混匀后将混合溶液放置在37℃的水浴锅中光引发剂与醛基进行定点的肟化反应反应1h，反应完成后，置于pbs缓冲液中，4℃搅拌透析24 h，获得igg
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光引发剂大分子溶液；其中igg：光引发剂的摩尔比为1：200。6.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述步骤（5）光介导atrp反应竞争免疫检测bsa含量，具体包括以下步骤：1）将封闭非特异性位点的二氧化硅微球溶液、抗原蛋白分子样品溶液和抗体igg
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光引发剂大分子溶液加入聚合溶液中混匀后制成混合体系，盖上橡皮塞使其成为一个密闭空间，并避光；在氮气氮气环境下除氧20 min后，打开紫外灯，开启photo atrp反应；photo atrp反应共聚形成带有光引发剂标签的抗体igg
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高分子偶联物igg-nipam-foa；样品中待检测的目标物抗原蛋白分子与固定在二氧化硅微球表面的抗原蛋白分子共同竞争带有光引发剂标签的抗体igg
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高分子偶联物，间接地将抗体igg
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高分子偶联物固定在微球表面；紫外照射反应30 min后，将混合体系暴露在空气中，终止反应；2）终止反应后的溶液用荧光光谱仪测定激发波长为 468 nm、发射波长为512 nm 处的荧光强度，通过与标准曲线的对比，获得样品溶液中抗原蛋白分子的浓度。7.根据权利要求6所述方法，其特征在于：步骤1）中所述封闭非特异性位点的负载抗原蛋白分子的二氧化硅微球溶液的浓度为1mg/ml，抗体igg
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光引发剂大分子溶液的浓度为50 ug/ml；所述抗原蛋白分子样品溶液的浓度为0.1ng/ml~5000ng/ml；所述封闭非特异性位点的负载抗原蛋白分子的二氧化硅微球溶液、抗原蛋白分子样品溶液和抗体igg
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光引发剂大分子溶液的体积比为100μl：50μl：100μl。8.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述抗原蛋白分子包括但不限于牛血清白蛋白bsa、卵清白蛋白ova、人血清白蛋白hsa。9.如权利要求1所述方法在免疫检测中的应用。

技术总结
本发明公开了一种基于高分子扩增信号放大的免疫分析方法，属于生物医药技术领域。本发明将蛋白质-高分子偶联物与生物分析结合在一起，成功地开发出用于蛋白质定量分析的方法。在以二氧化硅微球作为固相载体材料的基础上，预先包被目标分析抗原蛋白分子，利用抗原抗体的特异性识别反应，将事先接枝了光引发剂的抗体IgG-I大分子间接地固定在微球表面，构建出“竞争”免疫检测方法。该方法是一种快速、简便、廉价、无酶的级联放大检测技术，应用前景广阔。广阔。


技术研发人员：吴元子 王旭伟 张江胜 李玲 吕艳玮 蔡静雯
受保护的技术使用者：福州大学
技术研发日：2022.01.28
技术公布日：2023/8/9