膜破裂组合物及其制造和使用方法与流程

1.本发明涉及细胞膜破裂组合物(例如溶液)，以及制备和使用该组合物的方法。膜破裂溶液包括一种或多种非离子洗涤剂以及添加剂，其中至少一种洗涤剂具有对细胞、病毒载体和蛋白质抗剪切应力稳定至关重要的表面活性性质。


背景技术：

2.一般来说，大多数细胞都有一层外膜。这种膜的功能是保护、组织和调节细胞的渗透。除了少数例外，细胞膜由甘油磷脂、蛋白质、多糖、糖苷键和蛋白聚糖组成。细胞裂解是指细胞膜的破裂和随后细胞的分解。利用酶促、渗透、冻融和机械压力等各种技术来破坏细胞的外膜，以释放细胞内物质，如dna、rna、蛋白质或病毒载体。其中一些技术可以破坏/变性蛋白质、dna和其他目标成分。因此，需要一种在可能苛刻的制造过程中破坏细胞膜并保护目标材料不受损伤的细胞裂解试剂。细胞裂解对于病原体的分子诊断、用于治疗点诊断的免疫分析、下游过程(例如用于研究蛋白质功能和结构的蛋白质纯化)、病毒载体的下游纯化、癌症诊断、药物筛选、mrna转录组以及特定蛋白质、脂质、以及单独的或作为复合物的核酸。
3.细胞裂解有几种化学或机械方法[2]。从细胞中释放重组腺相关病毒(raav)载体的基本机械技术是冷冻/融化循环，然后是低速离心澄清步骤。然而，该技术不适用于raav的大规模纯化，因为它很难相应地规模化。机械匀浆是另一种裂解方法，其中使用高压迫使培养基中的细胞通过孔。当细胞在进入孔口时受到压缩，并且在排出时膨胀时，由于高剪切力，膜发生破裂。尽管这种方法是可扩展的，但由于剪切应力引起的聚集和沉淀，它具有产品损失的缺点。
[0004]
通过sds进行细胞裂解仅在碱性ph下起作用[3]，碱性ph不是病毒颗粒稳定性和其他细胞内成分的最佳溶液条件[4]。在sds细胞裂解过程中，病毒载体在苛刻的溶液条件下从宿主细胞中释放，导致病毒载体因处理而显著损失。
[0005]
细胞裂解过程也会释放核酸杂质，去除这些杂质需要单独的单元操作。目前的裂解方法不能防止由于剪切应力导致的产物损失，也不能去除由细胞裂解过程产生的与工艺相关的杂质。任何能够结合细胞裂解和dna去除过程，同时防止剪切应力导致的损失的解决方案，对病毒载体的制造都将是有价值的。
[0006]
病毒失活是指病毒的表面性质发生改变，使病毒不再有活性或无法感染的过程。药品制造商必须确保生物治疗产品的病毒安全性。病毒污染是对所有动物和人类生物制药的常见威胁。病毒污染物可以来自细胞系(如内源性逆转录病毒)或药物制造过程中的异位(如支原体)引入。
[0007]
对于病毒灭活，药品制造商应用多种技术来去除或灭活病毒。这些包括低ph灭活、病毒过滤和化学灭活。任何单一的策略都无法确保所有生物产品的安全。然而，溶剂/洗涤剂处理是灭活脂质包膜病毒的首选方法，因为它强大且易于扩大规模。
[0008]
传统上，各种洗涤剂，如辛苯昔醇-9(也以triton x-100出售)、脱氧胆酸钠和十二
烷基硫酸钠，已被用作细胞裂解的主要洗涤剂[5]。其中，triton x-100由于其优异的性能，已成为病毒载体纯化过程[5]和包膜病毒灭活的首选洗涤剂。
[0009]
研究表明，triton x-100会引起急性口服毒性、眼睛损伤、皮肤刺激和慢性水生生物毒性[6]。因此，该洗涤剂已于2016年12月被欧洲化学品管理局根据reach法规列入“高度关注物质名单”[6]。reach代表化学品的注册、评估、授权和限制，是欧盟于2006年12月颁布的一项法规，旨在解决化学品对人类健康和环境的安全问题。自2021年1月起，这种洗涤剂就被禁止在欧洲使用[7]，全球其他地区也可能效仿或受到欧洲的影响。
[0010]
因此，显然需要一种用于细胞裂解和病毒灭活的安全有效的膜破裂溶液，该溶液不仅裂解细胞并从宿主细胞释放细胞内物质，而且保护目标物质在工艺条件下免受损伤。理想的是，膜破裂溶液还应该能够在不影响产品的情况下分离产品，并去除在细胞裂解过程中产生的与工艺相关的杂质。本发明的膜破裂溶液不同于目前的组合物，并且显示出令人惊讶的快速和有效的裂解，同时保护病毒载体免受剪切应力的损伤。此外，它还能去除产品和工艺相关的杂质，如空衣壳、细胞碎片和细胞dna。


技术实现要素：

[0011]
本发明提供了非离子洗涤剂混合物，其令人惊讶地保护目标细胞成分(例如，病毒载体和蛋白质)，同时实现定量的细胞裂解。本发明的膜破裂解决方案破坏细胞膜的外部边界，保护目标材料在潜在的苛刻制造过程中不受损伤，并将目标物质与产品和工艺相关的杂质分离。膜破裂溶液有两个主要应用：细胞裂解和病毒灭活。病毒分为两组：第一组包膜病毒，被脂质外膜包围；第二组无包膜病毒，缺乏这种脂质膜。膜破裂溶液使包膜病毒失活。细胞裂解和包膜病毒失活的机制是相同的。细胞膜和包膜病毒都含有一个由疏水分子和亲水分子组成的脂质双层。膜破裂溶液破坏脂质、脂质-蛋白质和蛋白质-蛋白质的相互作用[2]。因此，任何能裂解细胞的溶液也能使包膜病毒失活。
[0012]
本发明的膜破裂溶液的洗涤剂是良性的，产生低泡沫，与环境相容，更具体地说，符合oecd 301关于易生物降解材料的指南。本发明的膜破裂溶液和细胞破裂方法(其中洗涤剂是环境友好的)可以在接近生理条件下保护裂解物中的目标产物(并且在细胞裂解的情况下可能去除产物和工艺相关的杂质)或溶液(在病毒失活的情况下)。
[0013]
在一个方面，本发明包括可用于细胞裂解和病毒灭活的膜破裂组合物(即溶液)。在一个实施方案中，该溶液包含一种或多种纯化的非离子洗涤剂，其中至少一种洗涤剂具有表面活性性质(表1)，所述表面活性性质适合于抗剪切应力的病毒载体/蛋白质稳定。合适的洗涤剂的实例包括乙氧基化醇(例如，tda9、tergitol 15-s-9)、乙氧基山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)和三嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆188、泊洛沙姆407和泊洛沙姆305)。在一些实施方案中，该溶液还包括清除剂，该清除剂可以例如通过在细胞裂解期间将目标产物与杂质分离来简化病毒载体制造工作流程。合适的清除剂的实例包括乙二胺四乙酸(edta)、乙醇、聚乙烯亚胺(pei)及其衍生物和脱氧胸苷三磷酸(dttp)。pei衍生化包括pei的乙酰化和季铵化，其通过烷基卤化物、烷基酸酐或烷基乙酰氯将甲基、乙基或丙基添加到仲胺基团上。
[0014]
在一些实施方案中，纯化的洗涤剂组合物具有大于95％的纯度，并且控制已知具有毒性的常见杂质，例如环氧乙烷(《5ppm)和二恶烷(《10ppm)。纯化过程包括蒸馏、反应蒸
馏、过滤、柱色谱吸附或其组合。
[0015]
在一些实施方案中，膜破裂溶液还可以包含其他稳定剂，例如蔗糖、海藻糖、葡萄糖、聚乙二醇(peg)、氯化钠(nacl)和氯化镁(mgcl2)。
[0016]
在另一个方面，本发明还包括生产高纯度洗涤剂和制备细胞破裂溶液的方法。在另一个方面，本发明还包括裂解哺乳动物和昆虫细胞系以及灭活包膜病毒的方法。在另一个方面，膜破裂溶液可用于分离病毒载体颗粒。在另一个方面，膜破裂组合物可用于从空衣壳和其他产物和工艺相关杂质中分离完整衣壳(含基因组)。
附图说明
[0017]
图1：示出了溶液a和triton x-100对hek-293(图a)和sf9(图b)细胞的细胞裂解。在细胞裂解1小时后测定细胞活力百分比。
[0018]
图2：示出了溶液a和溶液b对hek-293(图a)和sf9(图b)细胞的细胞裂解。细胞裂解1小时后测定细胞活力百分比。
[0019]
图3：示出了溶液a和聚山梨醇酯20对hek-293(图a)和sf9(图b)细胞裂解的协同作用。细胞裂解1小时后测定细胞活力百分比。
[0020]
图4：是描述溶液b和溶液c对hek-293(图a)和sf9(图b)细胞的细胞裂解的图。细胞裂解1小时后测定细胞活力百分比。
[0021]
图5：是描述膜破裂溶液triton x-100、溶液a、溶液b和溶液c的泡沫高度的图。根据astm d 1173《表面活性剂泡沫性质的标准试验方法》，在0.1％膜破裂溶液浓度下进行测定。
[0022]
图6：是描述在ph 4.0的50mm tris的溶液c中和在细胞培养基中hek-293细胞裂解的图。细胞裂解1小时后测定细胞活力百分比。
[0023]
图7：是描述使用膜破裂溶液triton x-100、溶液a、溶液b和溶液c的病毒滴度的图。使用qpcr方法测定滴度。
具体实施方式
[0024]
本发明涉及用于从宿主细胞中提取和分离非裂解病毒、蛋白质和肽分子的组合物和方法。更具体地，本发明涉及可用于通过裂解从宿主细胞(例如哺乳动物和昆虫细胞)中提取和分离病毒载体的组合物和方法。
[0025]
在一个方面，本发明提供了膜破裂解决方案。这些溶液可用于裂解宿主细胞和灭活病毒。所述组合物包含一种或多种纯化的、可生物降解的和环境友好的洗涤剂，其浓度范围为约0.001％(w/v)至约1％(w/w)。合适的洗涤剂的实例包括乙氧基化醇(例如，tda9、tergitol 15-s-9)、乙氧基山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)和三嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆188、泊洛沙姆407和泊洛沙姆305)。
[0026]
在一些实施方案中，所述组合物还包括至少一种清除剂，其浓度范围为0.01％(w/v)至约1％(w/w)。合适的清除剂的实例包括edta、乙醇、dttp和pei或其衍生物。具体地，pei可以是分子量为3000kd至100000kd的线性或支链结构。pei的衍生化可以包括使用目前已知的使用诸如乙酸酐或乙酰氯的试剂进行乙酰化或烷基化的技术在仲胺基团处添加烷基，例如甲基、乙基或丙基。
[0027]
在一些实施方案中，组合物可以进一步包括一种或多种稳定剂。合适的稳定剂的实例包括蔗糖、海藻糖、葡萄糖、各种链长的聚乙二醇(peg)、氯化钠(nacl)和氯化镁(mgcl2)，其浓度范围为约0.001m至约2m。peg的链长可以在100至10000个单体单元之间变化。
[0028]
在一些其它实施方案中，所述组合物可进一步包含缓冲液，所述缓冲液的量足以将ph维持在约3.0至约9.0的范围。该组合物可以是一种水溶液，或者是一种浓缩水溶液。在一个方面，本发明提供了一种从宿主细胞如哺乳动物和昆虫细胞回收病毒载体的方法。该方法包括以下步骤：(a)提供细胞生长的方法，从而提供细胞制剂；(b)提供细胞破裂溶液，所述细胞破裂溶液包含浓度范围为约0.01％至约1％(w/v)的一种或多种洗涤剂，其中所述洗涤剂中的至少一种具有对病毒载体/蛋白质抗剪切应力稳定至关重要的表面活性性质(任选地，包含清除剂和稳定剂)；(c)使所述细胞制剂与所述细胞破裂溶液接触，其中发生细胞裂解；(d)进行细胞活力分析；(e)进行dna测定；和(f)进行病毒滴定。
[0029]
在一个实施方案中，使用中的细胞破裂溶液在溶液ph为约3.0至9.0的水溶液中包含约0.25％(w/v)tda9(溶液a)。tda9是一种来源于异十三醇的可生物降解的非离子洗涤剂，被乙氧基化为平均9摩尔环氧乙烷。作为乳化剂、分散剂和增溶剂，它显示出优异的快速润湿性质、相对较低的泡沫水平、良好的去污性和多功能性。针对hek 293和sf9细胞系对细胞破裂溶液进行测试。细胞浓度＞5
×
106个细胞/ml。在细胞培养基中的细胞收获物中掺入细胞破裂溶液的浓缩储备液，以达到0％至0.5％的最终细胞破裂溶液浓度，并在15℃至30℃下孵育约5分钟至约1小时。储备溶液的浓度可以比目标浓度高1-500倍。在培养期之后，通过vi-cell计数仪分析细胞的细胞活力。细胞活力分析表明，细胞在约5分钟内完全裂解。超过5分钟的培养既没有任何益处，也没有造成任何害处。
[0030]
在一个方面，本发明提供了一种可生物降解的环境友好型洗涤剂，其可以裂解哺乳动物和昆虫细胞，类似于目前使用的洗涤剂triton x-100。由于triton x-100自2021年1月起将无法使用，因此本发明对于病毒载体和其他非溶血性细胞产品非常重要。在本发明中，洗涤剂是高纯度的，不含与产品相关的杂质，如聚乙二醇和游离环氧乙烷，这些杂质可能对目标产品产生不利影响。这里使用的洗涤剂微生物污染物和环氧乙烷含量都很低。tda9纯化步骤期间微生物污染的减少减少了下游在纯化步骤(如色谱)期间去除杂质(如聚乙二醇和游离环氧乙烷)的处理负担。从tda9中去除环氧乙烷至关重要，因为环氧乙烷是一种危险物质[8]，具有致癌作用，在处理过程中需要额外的预防措施。此外，tda9是一种环保型洗涤剂，符合oecd关于易生物降解材料的301f指南。所述洗涤剂的短期(急性)毒性被归类为2类，不需要警告标志，lc
50
和ec
50
值高于1.00且小于100。根据oecd 203(对鱼类的毒性)、oecd 202(对水生无脊椎动物的毒性)和oecd 201(对藻类的毒性)，在所有三个营养级测试了对水生环境的毒性。
[0031]
在本发明的该实施方案的另一个方面，细胞破裂溶液由水溶液中的约0.05％tda9和约0.20％(w/v)聚山梨醇酯20(溶液b)组成。聚山梨醇酯20，也称为吐温20，是一种山梨乙氧基化醇型非离子表面活性剂，通过在加入月桂酸之前山梨醇酯的乙氧基化形成。它相对无毒，在国内、科学和药理学的一些应用中都有使用。顾名思义，乙氧基化过程使分子具有20个重复单元的聚乙二醇。溶液ph为约3.0至约9.0。该细胞破裂溶液在hek 293和sf9细胞系上进行了测试。细胞浓度＞5
×
106个细胞/ml。在细胞培养基中的细胞收获物中掺入细胞
破裂溶液的浓缩储备液，以达到0％至0.5％的最终细胞破裂溶液浓度，并在15℃至30℃下孵育约5分钟至约1小时。培养期结束后，通过vi-cell计数仪分析细胞活力。细胞活力分析显示细胞在约5分钟内完全破裂。对于0.1％(w/v)或更高的裂解溶液浓度，溶液b显示与溶液a相当的裂解。如实施例3所示，利用基于组分浓度的数学计算，破裂溶液b出乎意料地显示出比理论预期的更高的细胞裂解。这种协同表现现象促进了更好的细胞裂解。本发明的膜破裂溶液相对于聚山梨醇酯20具有低的tda9浓度。在一个实施方案中，本发明中使用的聚山梨醇酯20是avantor j.t.baker品牌的超精制低杂质聚山梨醇酯。在另一个实施方案中，与溶液a或triton x-100相比，溶液b具有更低的泡沫高度，从而提供操作灵活性。
[0032]
在本发明的另一个实施方案中，膜破裂溶液包含约0.05％的tda9、约0.20％(w/v)的聚山梨醇酯20和约0.005％(w/w)的泊洛沙姆188(溶液c)。泊洛沙姆是非离子三嵌段共聚物，由聚氧化丙烯(聚环氧丙烷)的中心疏水链和聚氧乙烯(聚环氧乙烷)的两条亲水链组成。泊洛沙姆188保护产物免受剪切应力，例如，在裂解和纯化过程中保护病毒载体。文献[9]中已经报道了由于剪切诱导的应力导致的病毒载体的降解。泊洛沙姆188影响细胞裂解，因为据报道，它是一种细胞膜稳定剂，在生物医学工程中也可作为膜再封闭试剂应用[10,11]。评价了泊洛沙姆188对膜破裂溶液裂解细胞的能力的影响。在本发明中，溶液的ph为约3.0至约9.0。令人惊讶的是，本发明的发明人观察到泊洛沙姆188在用作膜破裂溶液的一部分时不会对细胞裂解产生不利影响。针对hek 293和sf9细胞系对细胞破裂溶液进行测试。细胞浓度＞5
×
106个细胞/ml。将细胞培养基中的细胞收获物掺入细胞破裂溶液的浓缩储备液，以达到0％至0.5％的最终细胞破裂缓冲液浓度，并在15℃至30℃下孵育约5分钟至约1小时。在培养期之后，通过vi-cell计数仪分析细胞的细胞活力。细胞活力分析表明，细胞在约5分钟内完全破裂。超过5分钟的培养既没有任何益处，也没有造成任何不良影响。结果表明，细胞裂解与溶液b和溶液c相当。在一个实施方案中，本发明提供了裂解缓冲液，其不仅完全裂解细胞，而且保护裂解物中的目标产物免受其在制造过程中可能经历的剪切诱导损伤。本研究中使用的泊洛沙姆188在制药行业也有很长的使用历史，并被列为gras赋形剂[1,12,13]。本发明中使用的泊洛沙姆188可以来自avantor j.t.baker品牌，或者可以来自其他供应商。
[0033]
在本发明的另一个实施方案中，膜破裂溶液包括0.05％的tda9、0.20％(w/v)的聚山梨醇酯20、0.005％(w/w)的泊洛沙姆188和0.1％的pei(溶液d)。pei，聚乙烯亚胺，是一种具有由胺基和两个碳脂肪族族ch2ch2间隔物组成的重复单元的聚合物。尽管pei已被用于选择性沉淀dna[14]，但由于其活性干扰细胞膜成分，如磷脂和膜蛋白，因此未用于细胞裂解溶液。在本发明中，发明人惊奇地发现，在细胞裂解后，裂解缓冲液中pei的存在显著减少了裂解物中的dna，而不受细胞膜成分的干扰，并且在细胞裂解强度没有显著变化的情况下去除了细胞碎片。通过将由溶液d裂解的裂解物中的总dna与不含pei的裂解溶液进行比较来计算pei对dna的去除。通过denovix荧光定量测定法(denovix双链dna宽范围试剂盒)测定裂解物中的dna。pei可以显著提高病毒载体的产量，进而简化生产流程。pei可以选择性沉淀产物相关杂质(例如，空衣壳和dna)，同时在裂解物中保留完整的病毒载体衣壳。
[0034]
在本发明的另一个实施方案中，用溶液a、溶液b和溶液c裂解产生病毒载体的细胞。简言之，将细胞和裂解缓冲液混合物暴露于剪切应力，然后纯化。通过qpcr测定，用溶液c裂解的细胞的产率比溶液a和溶液b好。含有泊洛沙姆的溶液的较高滴度证明了泊洛沙姆
188对病毒载体的保护作用。
[0035]
在本发明的另一个实施方案中，溶液d对细胞的裂解令人惊讶地沉淀出dna杂质和aav病毒。由于空衣壳与完整衣壳的pi以及dna杂质是不同的，因此可以优化裂解溶液条件，以选择性地从完整衣壳中沉淀空病毒衣壳和dna杂质，完整衣壳是裂解时溶液中目标病毒。
[0036]
本发明对非裂解细胞产品的制造具有重大影响。在一些实施方案中，所述组合物包含泊洛沙姆188以最小化下游工艺中由于剪切应力引起的产物损伤，并且包含pei以选择性地减少裂解物中的空衣壳和dna杂质。这显著改善了当前的病毒载体制造工作流程，从而提高了整体产量并降低了处理成本。
[0037]
可提供浓缩的膜破裂溶液储备以供使用，并稀释至工作溶液中的最终浓度。浓缩溶液的储备可以在使用浓度的约1-500倍或约5-200倍之间变化。
[0038]
在一个实例中，使用中的细胞破裂溶液包含0.25％(w/v)乙氧基化醇(溶液a)。在另一个实例中，使用中的膜破裂溶液在水溶液中含有0.05％乙氧基化醇和0.20％(w/v)聚山梨醇酯20(溶液b)。在另一个实例中，使用中的膜破裂溶液包含0.05％乙氧基化醇、0.20％(w/v)聚山梨醇酯20和0.005％(w/v的)泊洛沙姆188(溶液c)。在另一个实例中，使用中的膜破裂溶液包含0.05％乙氧基化醇、0.20％(w/v)聚山梨醇酯20和0.005％(w/v的)泊洛沙姆188和0.10％pei(溶液d)。溶液ph为约3.0至约9.0。溶液的电导率为约5至约200ms/cm。在一些实施方案中，使用盐溶液如氯化钠或氯化镁将电导率调节在约5至200ms/cm的范围内。
[0039]
发明人还意外地观察到，膜破裂溶液的某些组合物提供了较低的泡沫高度，从而提供了易用性并提高了病毒颗粒的回收率。
[0040]
表1：细胞悬浮液中在用膜破裂溶液的澄清成分
[0041]
[0042][0043]
膜破裂溶液的使用方法包括在细胞培养基中或在合适的缓冲系统中将储备裂解溶液添加到细胞悬浮液中。细胞悬浮液中的最终膜破裂溶液浓度大于约0.01％(w/v)，优选约0.25％(w/v)，并且在一些实施方案中，对于约1％。可以将储备膜破裂溶液直接添加到培养基中的细胞中，或者可以将收获的细胞以目标终浓度重悬在合适的缓冲溶液中。溶液的ph可以在约3.0至约9.0之间变化。溶液的电导率可以在大约5-200ms/cm之间变化。细胞悬浮液和膜破裂溶液的混合物应至少保持约5分钟，优选保持约1小时，以使细胞裂解完成。
[0044]
细胞裂解的一个典型例子是在无包膜aav病毒载体的制造过程中完成的。典型的下游工艺首先包括离心和细胞裂解，其中细胞通过离心浓缩成浆液，然后通过洗涤剂、冷冻/融化或机械匀浆裂解以释放病毒，然后进一步纯化以去除产品和工艺相关的杂质。病毒载体下游工艺中的其他单元操作包括核酸去除，其中用核酸内切酶消化细胞裂解后产生的裂解物以减少核酸污染物；在色谱纯化之前通过离心或微滤除去固体以除去细胞碎片和碎屑；亲和层析以去除hcp和任何血清蛋白杂质；通过氯化铯梯度超速离心程序或离子交换色谱法，从空的非传染性衣壳中去除含有传染性aav病毒基因组；以及最终纯化，以使用芯珠吸附剂(core-bead absorbent)进一步减少hcp或其他低分子量污染物[15]。
[0045]
病毒失活的一个典型例子是从血浆中去除病毒[16,17]。卫生机构要求在给患者用药前清除血浆中的病毒。这是一个关键的安全步骤，可以最大限度地减少通过血液成分输注传染性病原体(如肝炎)的可能性。细胞衍生产物的病毒失活的另一个例子发生在重组产物(如单克隆抗体)的生产过程中。单克隆抗体的生产包括几个单元操作，以灭活/去除产品中的病毒。根据fda和其他监管机构的指导方针，重组产品必须进行病毒清除证明[18]。洗涤剂的病毒灭活过程包括将洗涤剂溶液添加到cmc或高于cmc的细胞衍生产品中，并保持数小时。然而，在人类使用之前，必须通过过滤、色谱和/或任何其他方法从产品中去除灭活病毒[16,17]。
[0046]
虽然已经描述了目前认为是本发明的优选实施方案，但本领域技术人员将意识到，在不偏离本发明精神的情况下，可以进行其他和进一步的改变和修改，并且旨在要求所有这些改变和修改都在本发明的真正范围内。本发明通过以下非限制性实施例进行了进一步的详细说明。
[0047]
实施例
[0048]
本技术中使用的材料和方法如下：
[0049]
tda9纯化
[0050]
进行tda9提纯以减少产品相关杂质，特别是环氧乙烷。纯化过程包括(1)将原料加
热至50-180℃，同时与氮气或任何惰性气体混合或使用真空，(2)将产品冷却至15-40℃，同时与惰性气体混合，(3)加入10-50％体积的水以形成完全均质的溶液，(4)将溶液加热至40-120℃以完全水解剩余的挥发性杂质，以及(5)用0.2-1.0μm过滤器过滤混合物。
[0051]
细胞生长：
[0052]
用于本研究的hek 293细胞在expi293表达培养基(gibco a14351-01)中的通气无挡板摇瓶中生长。培养箱设置为37℃。摇床的转速为125转/分。co2保持在6％，相对湿度＞60％。在4-5天内实现了》5
×
106个活细胞/ml的目标细胞计数。用于研究的sf9细胞在sf-900ii sfm(invitrogen/gibco 10902)培养基中在无通气无挡板摇瓶中生长。培养箱设置为27℃和125转/分。在4-5天内实现了》5
×
106个活细胞/ml的目标细胞计数。
[0053]
用于细胞裂解的样品制备：
[0054]
对于细胞裂解研究，在无菌生物安全柜下，将2ml细胞加入10
×
15ml试管中。使用浓缩储备液向每根试管中加入0％(对照，无洗涤剂)、0.0025％、0.005％、0.0075％、0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.25％和0.5％的细胞破裂溶液。使用vi-cell细胞活力分析仪在15分钟、30分钟和1小时的时间点测定每个样品的细胞计数和细胞活力百分比。
[0055]
细胞活力研究：
[0056]
使用台盼蓝排除染色通过vi-cell xr评估细胞活力。vi-cell xr细胞活力分析仪是一种用于分析细胞活力的视频成像系统。它自动化了台盼蓝排除方案，即死细胞吸收染料，而活细胞不吸收[19]。样品被输送到流动池和相机进行成像，其中活细胞和死细胞之间的灰度级差异由软件确定。对于每个样本，仪器需要500μl样品体积，与台盼蓝1:1混合，最多可拍摄50张图像，以确定细胞浓度和活力。
[0057]
泡沫高度测定：
[0058]
根据astm d 1173《表面活性剂泡沫性质的标准试验方法》[20]，测定各种膜破裂溶液的泡沫高度。所有泡沫高度测定均在25℃使用wilmad labglass公司的ross miles泡沫装置(vwr cat#1007-876)。
[0059]
dna测定：
[0060]
使用denovix公司的双链dna宽范围荧光测定试剂盒测定dna。该试剂盒能够检测200μl体积中总质量为2至2000ng的双链dna样品。染料在双链dna存在下的光谱性质为350/460nm的激发/发射。这是一种范围广泛的两点测定法。使用不含dna酶的移液管尖端进行该测定(vwr cat#s 89174-528、89174-530、89714-524)；将所有试剂平衡至室温。工作溶液在2ml vwr带帽微管中制备(无菌，无dna酶，cat#16466-042)：1ml分析缓冲液+10μl染料+10μl增强剂。通过将190μl工作溶液添加到10μl标准品或10μl pcr管中的样品中，制备所有标准品(0ng和200ng)和样品。将测定管在室温下孵育5分钟。在菜单上选择预先配置的标准，然后选择“生成新的标准曲线”。然后读取0ng/μl和200ng/μl标准品。在生成该曲线之后对样品进行测定。记录样品和标准品的相对荧光单位和dna浓度。
[0061]
实施例1：通过膜破裂溶液a进行细胞裂解
[0062]
通过膜破裂溶液a和triton x-100对hek 293和sf9细胞进行细胞裂解。在裂解之前测定两种细胞类型的细胞计数。如前所述，对样品进行了制备和分析。用triton x-100进行的对照实验与溶液a的对照实验相同。使用vicell细胞活力分析仪在培养1小时后测定细胞计数和细胞活力百分比。细胞裂解的结果如图1所示。对于两种细胞系，在0.05％(w/v)的
洗涤剂浓度下，细胞裂解是完全的，并且溶液a和triton x-100的结果是相当的。洗涤剂浓度超过0.05％并没有带来任何优势。
[0063]
实施例2：通过膜破裂溶液b进行细胞裂解：
[0064]
通过溶液a和溶液b(溶液a+ps20)对hek 293和sf9细胞进行细胞裂解。在裂解之前测定两种细胞类型的细胞计数。如前所述，对样品进行了制备和分析。孵育1小时样品的细胞裂解结果如图2所示。溶液b在0.1％的浓度下实现了完全的细胞裂解。超过0.1％的浓度没有带来任何优势。尽管细胞裂解是通过浓度低于溶液b的溶液a实现的，但由于细胞裂解通常在0.1％以上的浓度下进行，因此小的差异实际上没有价值[5，6，21，22]。因此，在典型的使用浓度下，溶液a和溶液b的性能相当。与溶液a相比，使用溶液b的优点之一是，与溶液a(实施例5)相比，它产生的泡沫高度更小。
[0065]
实施例3：溶液a和聚山梨醇酯20的协同作用：
[0066]
通过溶液a、ps20和溶液b(溶液a+ps20)对hek 293和sf9细胞进行细胞裂解。在裂解之前测定两种细胞类型的细胞计数。对于样品制备，使用三种膜破裂溶液储备液(溶液a、ps20和溶液b)。如前所述，对样品进行了制备和分析。结果如图3所示。本研究旨在评估溶液a和ps20的协同作用。为了检验这一点，将溶液b的实验性细胞裂解与预期的细胞裂解进行比较。溶液b的预期响应计算如下：
[0067]
溶液b的预期细胞裂解(％)＝0.2*溶液a的裂解+0.8*ps20的裂解。如图所示，实验观察到的溶液b的裂解明显好于预期的裂解，这表明溶液a和ps20之间存在协同效应。
[0068]
实施例4：通过膜破裂溶液c进行细胞裂解：
[0069]
通过溶液b和溶液c(溶液b+泊洛沙姆)对hek 293和sf9细胞进行细胞裂解。在裂解之前测定两种细胞类型的细胞计数。孵育1小时样品的细胞裂解结果如图4所示。溶液b和溶液c的细胞裂解相当，表明泊洛沙姆与溶液b溶液相容，不会对细胞裂解造成任何不利影响。这是一项非常重要的发明，因为泊洛沙姆有望在苛刻的生产条件下为目标产品(在这种情况下是病毒载体)提供保护，而不会影响细胞裂解。
[0070]
实施例5：膜破裂溶液的泡沫高度比较：
[0071]
在使用洗涤剂时，最大限度地降低泡沫高度是一个常见的挑战。理想情况下，细胞裂解溶液应该能够裂解细胞，而不会产生太多泡沫。在本实验中，比较了triton x-100、溶液a、溶液b和溶液c的泡沫高度。使用wilmadlabglass公司的ross miles泡沫装置(vwr cat#1007-876)进行泡沫高度测定。图5显示了时间零点和保持5分钟后的泡沫高度。没有测定溶液d的泡沫高度，因为pei不是洗涤剂，因此预计不会影响溶液c的泡沫高度。
[0072]
细胞裂解溶液b和c的泡沫高度显著低于溶液a和triton x-100的泡沫高度。
[0073]
由于溶液a、溶液b和溶液c已显示出与triton x-100相当的裂解能力，并且溶液b和c的泡沫高度低于triton x-00和溶液a，因此膜破裂溶液b、溶液c和溶液d是比溶液a更好的替代品。
[0074]
实施例6：细胞裂解过程中dna的去除：
[0075]
通过冷冻/融化法和破裂溶液法进行hek 293和sf9细胞裂解，加入溶液b、溶液c和溶液d。测定裂解前后hek细胞中的dna浓度。通过冷冻/融化的细胞裂解是通过在-80℃下冷冻细胞悬浮液30分钟然后在37℃水浴15分钟来完成的。冻融重复4个循环。将对照样品和冻融样品在500xg下旋转10分钟以去除细胞碎片。通过双链dna宽范围荧光测定试剂盒测定上
清液的dna。结果如表2所示。使用细胞培养基校正基线。对于通过破裂溶液的细胞裂解，将溶液b、溶液c、溶液d掺入2ml细胞悬浮液中。在dna定量测定之前，允许15分钟的时间进行细胞裂解。结果如表2所示。总dna浓度在通过冷冻/融化方法进行细胞裂解的裂解物中最高。溶液b和溶液c裂解物中的dna浓度略低于冷冻/融化裂解物中dna浓度。溶液d中的dna浓度几乎为零。这是一项重要的发明，因为它将减少下游工艺的负担。
[0076]
表2：通过各种方法进行细胞裂解后细胞裂解物中的dna含量
[0077][0078][0079]
实施例7：细胞浓度依赖性dna去除：
[0080]
按照实施例6中描述的方法，使用溶液b、溶液c、溶液d裂解缓冲液，在50mm tris、ph 6.5缓冲液中以5
×
106个细胞/ml、10
×
106个细胞/ml、20
×
106个细胞/ml和40
×
106个细胞/ml的细胞浓度进行hek 293细胞裂解。结果如表3所示。溶液d裂解的细胞中的dna浓度显著低于溶液b和c裂解的细胞，这表明含有pei的裂解缓冲液可以有效地从细胞悬浮液中去除dna。正如预期的那样，在用溶液b和溶液c裂解后，dna浓度随着细胞浓度的增加而增加；然而，dna浓度与溶液d的裂解相当，这表明在5
×
10
6-40
×
106个细胞/ml的范围内，溶液d裂解缓冲液混合物中pei的dna去除与细胞浓度无关。
[0081]
表3：通过pei去除细胞浓度依赖性dna
[0082][0083][0084]
实施例8：裂解缓冲液与蔗糖和氯化镁的相容性：
[0085]
蔗糖和氯化镁被广泛用于病毒载体的生产，以提高总产量和产品质量[23]。进行该研究是为了证明所公开的细胞膜破裂溶液与蔗糖和氯化镁(mgcl2)相容，并且对细胞裂解没有任何不利影响。将细胞储备液分成两个试管，并在100x g下旋转10分钟。从第一个试管中取出上清液，并将固体沉淀重悬于50mm tris(ph 6.5)中。从第二管中取出上清液，并将沉淀重悬于50mm tris、ph 6.5、2mm mgcl2和1m蔗糖中。通过vicell测定，悬浮液的细胞浓度约为5
×
106个细胞/ml。对于细胞裂解，使用浓缩储备液将溶液c掺入2ml细胞，以获得0％、0.05％、0.1％、0.25％和0.5％的最终洗涤剂浓度。在培养1小时后，使用vicell细胞活力分析仪测定每个样品的细胞计数和细胞活力百分比。作为洗涤剂浓度的函数的细胞活力结果如表4所示。悬浮在含有mgcl2和蔗糖的缓冲液中的细胞在没有洗涤剂的情况下的细胞活力低于单独的缓冲液，这表明mgcl2或蔗糖可以在没有任何洗涤剂的情况下来部分裂解细胞。这并不是一个意外的结果，因为渗透性休克可能导致细胞破裂。然而，部分(45％)裂解不足以取代洗涤剂的使用。50mm tris(ph 6.5)和50mm tris-ph 6.5、2mm mgcl2和1m蔗糖的渗透压摩尔浓度值分别为114mosm/kg和1462mosm/kg。在较低的洗涤剂浓度下，膜破裂溶液在不含mgcl2和蔗糖的缓冲液中比在存在mgcl2或蔗糖的情况下稍微更有效。然而，在洗涤剂使用的典型浓度下，两种情况下的裂解百分比是相当的，这表明用作稳定剂的mgcl2和蔗糖对细胞裂解没有任何不利影响。这是一个重要的观察结果，因为在细胞裂解过程中使用蔗糖和mgcl2有望稳定病毒载体并提高回收率。
[0086]
表4：氯化镁和蔗糖对溶液c裂解细胞的影响
[0087][0088][0089]
实施例9：通过膜破裂溶液进行ph依赖的细胞裂解
[0090]
在ph 4.0下，在50mm tris缓冲液中进行溶液c对hek 293的细胞裂解，并与实施例4中所述的在细胞培养基(ph 7.2-7.4)中的细胞裂解进行比较。将细胞培养基中所需细胞的适当体积在100x g下旋转10分钟。除去上清液，并将固体颗粒重悬在适当体积的50mm tris(ph 4.0)中。悬浮液的细胞浓度被测定为大约5
×
106个细胞/ml。使用溶液c的浓缩储备液掺入细胞悬浮液。在无菌生物安全柜下，将2ml细胞加入5
×
15ml试管中。将来自洗涤剂储备溶液的0％(对照，无洗涤剂)、0.05％、0.1％、0.25％和0.5％最终浓度的洗涤剂掺入每个管中。使用vicell细胞活力分析仪在培养1小时后测定每个样品的细胞计数和细胞活力百分比。孵育1小时样品的细胞裂解结果如图6所示。ph 4.0下的细胞裂解与细胞培养基中的细胞裂解相当，表明低ph的细胞裂解对膜破裂溶液的细胞裂解没有任何不利影响。
[0091]
实施例10：通过膜破裂溶液去除ph依赖性dna：
[0092]
在ph 4.0下，在hek 293细胞中的50mm tris缓冲液中评估通过膜破裂溶液的dna去除，并与实施例8中讨论的细胞培养基(ph 7.2-7.4)中的dna去除进行比较。将细胞培养基中所需细胞的适当体积在100x g下旋转10分钟。除去上清液，并将固体颗粒重悬在适当体积的50mm tris(ph4.0)中。悬浮液的细胞浓度被测定为大约5
×
106个细胞/ml。加入溶液b、溶液c和溶液d进行细胞裂解，使最终膜破裂溶液浓度为0.25％。裂解前测定溶液中的dna浓度作为对照。通过双链dna宽范围荧光测定试剂盒测定上清液的dna含量。结果如表5所示。使用50mm tris ph 4.0缓冲液校正基线。在dna定量测定之前，允许15分钟的时间进行细胞裂解。在通过溶液b或溶液c进行细胞裂解的裂解物中，总dna浓度高于溶液d。如实施例8所示，在ph 4.0时，裂解物中的dna与细胞培养基中的裂解物的dna相当。两个实施例中的细胞密度相当(～5
×
106个细胞/ml)。这一结果表明，裂解过程中产生的dna及其随后在ph 4.0下通过膜破裂溶液去除的dna与细胞培养基(ph 7.2-7.4)中裂解过程中生成的dna及其后续通过膜破裂液去除的dna相当，表明低ph对由溶液d组成的膜破裂溶液的dna去除没有任何不利影响。
[0093]
表5：ph对膜破裂溶液去除dna的影响
[0094][0095]
实施例11：膜破裂溶液的病毒载体滴度的比较：
[0096]
使用以4:1混合的pei-max与质粒dna，所述质粒dna中辅助质粒、r2c2质粒和gfp质粒的比例分别为2:1.6:1，对粘附性hek293t细胞的转染。转染后第5天，通过将浓缩的裂解溶液加入细胞悬浮液中进行裂解实验。为了裂解用raav2转染的细胞，将2ml浓度为200万个细胞/ml的细胞悬浮液加入5ml离心管和20μl100x浓缩的triton x-100溶液a、溶液b，并加入溶液c以达到约0.25％的最终洗涤剂浓度。然后将所有四种混合物暴露于剪切应力下，以模拟典型的制造过程中可能经历的应力条件，例如加入裂解缓冲液和核酸内切酶后的混合。将一个12mm大小的小磁棒插入每个管中，然后将每个管放置在摇床上。将混合物在室温下以250rpm摇动60分钟。剪切应力后，通过在4℃下以14000x g离心悬浮液15分钟并收集上清液来收获病毒载体。将浓缩的peg-8000/nacl混合物添加到上清液中，达到20％的最终浓度，以絮凝raav2，并将所得悬浮液在4℃下孵育过夜。在2500x g离心一小时后，收集沉淀并重悬于tae缓冲液中。在氯仿和peg8000提取步骤之后，通过在37℃下用dna酶i处理2μl样品来测定滴度，然后用0.5m naoh/0.2m edta溶液裂解病毒。随后，通过加入0.5m tris中和溶液，并使用具有针对gfp质粒引物的promega-taq聚合酶qpcr试剂盒来定量滴度。
[0097]
图7示出了不同膜破裂溶液的病毒滴度。该图表表明，triton x-100、溶液a和溶液b的滴度相当。溶液c的滴度高得多，这表明泊洛沙姆能够防止由于混合过程中的剪切应力而导致的病毒载体损伤(滴度损失)。这是一个极其重要的观察结果；它将允许载体制造商提高病毒载体的总产量。
[0098]
实施例12：使用裂解缓冲液d纯化病毒载体：
[0099]
使用以4:1混合的pei-max与质粒dna，所述质粒dna中辅助质粒、r2c2质粒和gfp质粒的比例分别为2:1.6:1，对粘附性hek293t细胞的转染。
a.effect of surfactants on mechanical,thermal,and photostability of a monoclonal antibody.aaps pharmscitech.aaps pharmscitech；2018；19:79
–
92.
[0114]
13.agarkhed m,o’dell c,hsieh mc,zhang j,goldstein j,srivastava a.effect of polysorbate 80 concentration on thermal and photostability of a monoclonal antibody.aaps pharmscitech.2013；14:1
–
9.
[0115]
14.t,a,eisold k,kalbfuβ-zimmermann b,reichl u.dna depletion by precipitation in the purification of cell culture-derived influenza vaccines.chem eng technol.2010；33:941
–
59.
[0116]
15.rodrigues ga,shalaev e,karami tk,cunningham j,slater nkh,rivers hm.pharmaceutical development of aav-based gene therapy products for the eye.pharm res.pharmaceutical research；2019；36:1
–
20.
[0117]
16.suomela h.inactivation of viruses in blood and plasma products.transfus med rev.elsevier；1993；7:42
–
57.
[0118]
17.pamphilon d.viral inactivation of fresh frozen plasma.br j haematol.2000；109:680
–
93.
[0119]
18.fda.q5a guidance document:viral safety evaluation of biotechnology products derived from cell lines of human or animal origin.fed regist.1998；63:51074
–
804.
[0120]
19.coulter b.vi-cell reference manual.2011.
[0121]
20.astm international.standard test method for foaming properties of surface-active agents.2007；
[0122]
21.qiao c,koo t,li j,xiao x,dickson jg.aav capsid structure and cell interactions.gene ther.2011.
[0123]
22.rayaprolu v,kruse s,kant r,venkatakrishnan b,movahed n,brooke d,et al.comparative analysis of adeno-associated virus capsid stability and dynamics.j virol.2013；87:13150
–
60.
[0124]
23.rego m,hanley lm,ersing i,guerin k,tasissa m,haery l,et al.improved yield of aav2 and raav2-retro serotypes following sugar supplementation during the viral production phase.biorxiv.2018；1
–
21.

技术特征：
1.一种细胞破裂溶液，包括：一种或多种纯化的非离子洗涤剂，其中所述洗涤剂中的至少一种具有适合于抗剪切应力的病毒载体/蛋白质稳定化的表面活性性质，其中非离子洗涤剂选自乙氧基化醇、山梨醇乙氧基酯、三嵌段共聚物及其组合，其中所述洗涤剂的浓度范围为约0.01％(w/v)至约2.0％(w/v)；以及浓度在0％至约2.0％范围内的清除剂，其中所述溶液的ph在约3.0至9.0的范围内，电导率在约5至200ms/cm的范围内。2.根据权利要求1所述的溶液，其中所述乙氧基化醇为tda9、tergitol15-s-9或其组合。3.根据权利要求1所述的溶液，其中所述山梨乙氧基化醇为聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80或其组合。4.根据权利要求1所述的溶液，其中所述三嵌段共聚物为泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、泊洛沙沙姆305或其组合。5.根据权利要求1所述的溶液，其中所述非离子洗涤剂的浓度为约0.25％(w/v)。6.根据权利要求1所述的溶液，其中所述非离子洗涤剂是浓度为约0.05％(w/v)的tda9和浓度为约0.2％(w/w)的聚山梨醇酯20。7.根据权利要求1所述的溶液，其中所述清除剂选自乙二胺四乙酸(edta)、乙醇、脱氧胸苷三磷酸(dttp)、聚乙烯亚胺(pei)、pei衍生物及其组合，其中清除剂的浓度范围为约0.01％(w/v)至约1.0％(w/v)。8.根据权利要求1所述的溶液，其中所述非离子洗涤剂包含浓度为约0.05％(w/v)的乙氧基化醇、浓度为约0.2％(w/w)的聚山梨醇酯20和浓度为约0.005％(w/v)的泊洛沙姆188。9.根据权利要求8所述的溶液，其进一步包含浓度为约0.1％(w/v)的pei清除剂。10.根据权利要求1所述的溶液，其进一步包含稳定剂。11.根据权利要求10所述的溶液，其中稳定剂选自蔗糖、氯化镁、氯化钠、各种链长的peg及其组合。12.一种裂解细胞的方法，包括使细胞与根据权利要求1-11所述的膜破裂溶液接触。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物或昆虫细胞。14.根据权利要求12所述的方法，其中将所述溶液直接添加到细胞培养基中的细胞或细胞悬浮液中，其中离心细胞去除细胞培养基并重悬于合适的缓冲液。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述缓冲液选自tris、磷酸盐、组氨酸、柠檬酸盐、乙酸盐及其组合，其中在约3.0至9.0的ph下，所述缓冲剂的浓度为约5mm至约200mm。16.根据权利要求12所述的方法，其中pei仅在细胞裂解后加入。17.根据权利要求12所述的方法，其中所述细胞在血浆或单克隆抗体中。18.一种从细胞裂解物中去除dna和/或空病毒衣壳的方法，包括使细胞裂解物与根据权利要求1-11所述的膜破裂溶液接触。19.一种从细胞裂解物选择性沉淀dna和/或空病毒衣壳的方法，包括使细胞裂解物与pei接触。

技术总结
本发明提供了一种膜破裂溶液，包括：一种或多种纯化的非离子洗涤剂，其中至少一种洗涤剂具有适合于病毒载体/蛋白质抗剪切应力稳定的表面活性性质，以及任选的清除剂。以及任选的清除剂。


技术研发人员：阿尔温德
受保护的技术使用者：安万托特性材料股份有限公司
技术研发日：2021.10.14
技术公布日：2023/8/9