对严重急性呼吸综合征冠状病毒2具有中和活性的肽的制作方法

1.本发明涉及一种对严重急性呼吸综合征冠状病毒2
2.(sars-cov-2)具有中和活性的肽及其用途。


背景技术：

3.严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)是一种单链rna病毒，属于冠状病毒(coronavirinae)亚科。为了避免与严重急性呼吸综合征感染混淆，世界卫生组织(who)也将其称为“2019冠状病毒疾病病毒”或“导致2019冠状病毒疾病的病毒”。
4.据了解，从2019年12月至2020年7月初，全球214个国家发生了1157万例确诊病例，其中537,138例死亡，并且死亡率达4.64。sars-cov-2的临床症状主要是伴有发烧的呼吸道症状，并且主要易感人群是患有基础疾病、免疫疾病等的60岁以上的老年人。与以前的病毒不同，sars-cov-2表现出强传染性和症状的迅速恶化，并且在2020年3月，即在报道第一次疫情爆发后的约三个月，who宣布为全球流行病，即大流行病。
5.目前还没有特定的治疗剂，但据报道已经进行了抗病毒剂的研究，并且诸如rna聚合酶抑制剂瑞德西韦、疟疾药品氯喹和抗逆转录病毒人类免疫缺陷i蛋白酶抑制剂洛匹那韦/利托那韦之类的抗病毒剂在细胞水平上显示出sars-cov-2抑制作用。然而，到目前为止已知有效的治疗剂在实际临床实践中具有困难，这是因为它们的作用微不足道或者它们可以产生各种副作用。
6.因此，本发明人勤奋努力以开发能够抑制sars-cov-2的新治疗剂，结果是确认了本发明的肽可以有效地用于预防、减轻或治疗冠状病毒感染，从而完成了本发明。


技术实现要素：

7.[技术问题]
[0008]
本发明的目的是提供一种特异性识别严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)的蛋白或其一部分的肽。
[0009]
本发明的另一目的是提供一种用于预防或治疗sars-cov-2感染的组合物。
[0010]
本发明的还一目的是提供一种预防或治疗sars-cov-2感染的方法。
[0011]
本发明的还一目的是提供一种组合物，以用于预防或治疗sars-cov-2感染。
[0012]
本发明的还一目的是提供一种用于检测sars-cov-2的组合物。
[0013]
本发明的还一目的是提供一种检测sars-cov-2的方法。
[0014]
本发明的还一目的是提供一种组合物，以用于检测sars-cov-2。
[0015]
本发明的还一目的是提供一种用于诊断sars-cov-2感染或疾病的试剂盒。
[0016]
[技术方案]
[0017]
为此，本发明的一个方面提供了一种特异性识别严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)的蛋白或其一部分的肽。
[0018]
此外，本发明的另一方面提供了一种包含该肽的用于预防或治疗sars-cov-2感染
的组合物。
[0019]
此外，本发明的另一方面提供了一种预防或治疗sars-cov-2感染的方法，该方法包括向受试者施用该肽或包含该肽的组合物。
[0020]
此外，本发明的另一方面提供了一种肽或包含该肽的组合物，以用于预防或治疗sars-cov-2感染。
[0021]
此外，本发明的另一方面提供了一种包含该肽的用于检测sars-cov-2的组合物。
[0022]
此外，本发明的另一方面提供了一种检测sars-cov-2的方法，该方法包括使该肽或包含该肽的组合物与生物样本接触。
[0023]
此外，本发明的另一方面提供了一种肽或包含该肽的组合物，以用于检测sars-cov-2。
[0024]
本发明的另一方面提供了一种用于诊断sars-cov-2感染或疾病的试剂盒。
[0025]
[有利效果]
[0026]
根据本发明的包括选自由seq id no:1至seq id no:6的氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列的肽具有通过与sars-cov-2的表面的刺突蛋白结合以中和sars-cov-2从而抑制病毒和宿主细胞的膜融合的效果，因此，该肽可用于预防、治疗或诊断sars-cov-2感染。
[0027]
然而，本发明的效果不限于上述效果，并且本领域技术人员将通过以下描述清楚地理解未提及的其他效果。
附图说明
[0028]
图1为示出了确认根据本发明的seq id no:1至seq id no:6的肽与sars-cov-2刺突蛋白的受体结合域(rbd)结合的能力的elisa结果的图。
[0029]
图2为示出了确认根据本发明的seq id no:1至seq id no:6的肽抑制sars-cov-2刺突蛋白rbd与宿主细胞的血管紧张素转换酶2(ace2)蛋白的结合的活性的elisa结果的图。
[0030]
图3示出了确认根据本发明的seq id no:1至seq id no:4的肽是否具有抑制rbd与在人肺癌细胞系a549的细胞表面表达的ace2结合的能力的蛋白印迹结果。
具体实施方式
[0031]
以下，将详细描述本发明。
[0032]
本发明的一个方面提供了一种特异性识别严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)的蛋白或其一部分的肽，该肽包括选自由seq id no:1至seq id no:6的序列组成的组中的任一种氨基酸序列。
[0033]
在本说明书中，术语“肽”是指通过肽键将氨基酸残基彼此连接而形成的线性或环状分子。可以通过本领域已知的常规生物或化学合成的方法实现肽的制备，例如，可以通过诸如固相合成技术之类的方法实现肽的制备。
[0034]“肽”可以是通过在不影响功能的范围内的氨基酸残基的缺失、插入或置换、或者它们的组合而得到的具有不同序列的氨基酸变体或片段。不完全改变肽的活性的氨基酸交换在本领域中是已知的。在一些情况下，可以通过磷酸化、硫酸化、丙烯酸酯化、糖基化、甲
基化、法尼基化等进行修饰。因此，本发明包括具有与具有选自由seq id no:1至seq id no:6组成的组中的任一种氨基酸序列的肽基本相同的氨基酸序列的肽，以及该肽的变体或活性片段。基本上相同的蛋白是指(但不限于)与选自由seq id no:1至seq id no:6组成的组中的任一种氨基酸序列的序列同源性为75％以上、优选80％以上、例如85％以上、90％以上、95％以上、98％以上或99％以上的氨基酸序列，并且当氨基酸序列的序列同源性为75％以上且具有相同活性时，该氨基酸序列包括在本发明的范围内。此外，本发明的肽还可包括为了增加半衰期或肽稳定性的特定目的而制备的靶向序列、标签、标记的残基以及氨基酸序列。
[0035]
此外，为了获得更好的化学稳定性、增强的药理学性质(半衰期、吸收性、效价、功效等)、改变的特异性(例如，宽的生物活性谱)和降低的抗原性，可以将保护基附接至本发明的肽的n端或c端。例如，保护基可为乙酰基、芴基甲氧基羰基、甲酰基、棕榈酰基、肉豆蔻基、硬脂基或聚乙二醇(peg)，然而，任何能够增强肽的修饰、特别是增强肽的稳定性的成分都可以包括在内而不受限制。所使用的“稳定性”不仅包括保护本发明的肽在体内免受蛋白水解酶攻击的体内稳定性，而且包括储存稳定性(例如，室温储存稳定性)。
[0036]
在一个实施方案中，本发明的肽选自由以下组成的组：
[0037]
rsymtthheqf(seq id no:1)；
[0038]
kfnrrhh(seq id no:2)；
[0039]
kyllvhrpyyrr(seq id no:3)；
[0040]
wvpyqarvpypr(seq id no:4)；
[0041]
rlycknggfflr(seq id no:5)；和
[0042]
khrgggnrr(seq id no:6)。
[0043]
本发明的肽可以特异性结合sars-cov-2的刺突蛋白(s蛋白)。更具体而言，本发明的肽可以特异性结合sars-cov-2的刺突蛋白中存在的rbd(受体结合域)。
[0044]
在本说明书中，术语“特异性结合”是指与目的蛋白即作为sars-cov-2的刺突蛋白或其一部分的rbd结合，但基本上不识别和结合样品中的其他分子。
[0045]
本发明的肽可以与sars-cov-2的表面的刺突蛋白特异性结合，以抑制刺突蛋白与宿主细胞的细胞膜受体的结合。
[0046]
宿主细胞的细胞膜受体是血管紧张素转换酶2(ace2)，并且血管紧张素转换酶2是在真核生物和细菌中发现的跨膜蛋白，并且是包括sars-cov-2的冠状病毒入侵细胞所使用的受体。
[0047]
在一个实施方案中，确认了本发明的肽可以与sars-cov-2的表面的刺突蛋白rbd特异性结合以中和sars-cov-2，并且可以抑制sars-cov-2与宿主细胞的细胞膜的结合。
[0048]
在本说明书中，术语“中和”是指不管通过何种机制实现中和，在体内和/或体外抑制sars-cov-2的复制的能力。在一个实施方案中，本发明的肽通过抑制sars-cov-2附着于靶细胞而使病毒膜与细胞膜融合，从而中和sars-cov-2。
[0049]
本发明的另一方面提供了一种包含该肽的用于预防或治疗严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)感染的药物组合物。
[0050]
此外，本发明提供了一种预防或治疗sars-cov-2感染的方法，包括向受试者施用该肽或包含该肽的组合物。
[0051]
此外，本发明提供了一种肽或包含该肽的组合物，以用于预防或治疗sars-cov-2感染。该组合物可通过与严重急性呼吸综合征冠状病毒2的表面的刺突蛋白结合以抑制刺突蛋白与宿主细胞的细胞膜受体的结合，从而预防或治疗sars-cov-2感染。
[0052]
根据本发明的预防或治疗sars-cov-2感染用药物组合物可以根据常规方法分别以诸如粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂和气雾剂之类的口服制剂、外用制剂、栓剂和无菌注射液的形式配制和使用，并且除了用于制剂的肽之外，该药物组合物还可包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
[0053]
药学上可接受的载体可以包括制剂中通常使用的乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、金合欢胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等。
[0054]
除了上述成分之外，药物组合物还可以包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。
[0055]
药物组合物可以根据所需方法口服施用或肠胃外施用(例如，肌内施用、静脉内施用、腹腔内施用、皮下施用、皮内施用或局部施用)，并且剂量根据患者的状况和体重、疾病的严重程度、药品形式以及施用途径和时间而变化，而且可以由本领域技术人员适当地选择。
[0056]
本发明的药物组合物以药学有效量施用。在本发明中，术语“药学有效量”是指以适用于医学治疗的合理的效益/风险比治疗疾病的足够的量，并且可以根据包括患者的疾病类型和严重程度、药品活性、药品敏感性、施用时间、施用途径和排泄速率、治疗持续时间和同时使用的药品在内的因素以及医学领域中公知的其他因素来确定有效剂量水平。药物组合物可以作为单独的治疗剂施用或者可以与其他治疗剂组合施用，药物组合物可以与常规治疗剂同时、分开或顺序施用，并且药物组合物可以单独或多次施用。重要的是，在考虑所有上述因素的情况下，施用能够以最少用量获得最大效果而没有副作用的量，该量可以由本领域技术人员容易地确定。
[0057]
药物组合物的有效量可以根据患者的年龄、性别、状况和体重、活性成分在体内的吸收程度、失活速率、排泄速率、疾病类型、联用药品而变化，并且药物组合物的有效量可以根据施用途径、肥胖的严重程度、性别、体重、年龄等而增加或减少，例如，可以以每天每1kg患者体重约0.0001μg至500mg、优选0.01μg至100mg施用药物组合物。
[0058]
本发明的药物组合物还可包含至少一种其他治疗剂。例如，该药物组合物还可包含干扰素、抗s蛋白单克隆抗体、抗s蛋白多克隆抗体、核苷类似物、dna聚合酶抑制剂、sirna制剂或治疗性疫苗，从而与肽一起作为抗病毒药品。这些可以与本发明的肽组合使用。在本说明书中，“与
……
组合”是指遵循作为单独制剂或作为组合制剂的单个组分同时施用的方案，或作为单独制剂以任何顺序依次施用的方案这两者中的一者。
[0059]“受试者”可以是需要施用本技术的肽的对象，并且需要施用的受试者可以包括已经诊断出患有sars-cov-2感染的对象、已经出现sars-cov-2感染的症状的对象、以及希望给予施用以预防疾病或症状的发展或改善健康的对象。
[0060]“施用”是指通过任何合适的方法向患者提供预定物质，并且本发明的肽可以通过全部一般途径进行口服施用或胃肠外施用，只要该肽能够到达期望的组织即可。此外，可以通过能够将活性物质输送至靶细胞的任何装置施用该肽或包含该肽的组合物。
4wvpyqarvpypr15324 5rlycknggfflr14745 6khrgggnrr10376
[0079]
[实施例2]
[0080]
本发明的肽与sars-cov-2刺突蛋白rbd结合的能力的确认
[0081]
为了确认本发明的肽是否可以阻断sars-cov-2对宿主细胞的侵袭，首先，对本发明的肽是否可以识别并结合至sars-cov-2的刺突蛋白中的rbd进行确认。
[0082]
具体而言，将实施例1中选择的六种肽与等体积的2mm碳酸氢钠混合，并在96孔板中分别分配100μl，然后在4℃培养过夜，用肽覆盖孔的表面。将这些孔用0.1％ pbs-t(0.1％吐温-20的pbs溶液)洗涤三次，然后分配100μl的3％ bsa，然后在室温封闭1小时，并用0.1％ pbs-t洗涤三次。此后，用每个孔100ng的重组sars-cov-2刺突rbd-his(sino biological，cat.no.:40592-v08b，中国)处理各孔，并在室温下反应2小时。将各孔用0.1％ pbs-t洗涤三次，然后用以1:1000稀释的抗his抗体hrp(abcam，cat.no.:ab1187，美国)的pbs溶液进行处理，并在室温下反应1小时，然后用0.1％ pbs-t洗涤三次。分配100μl的tmb溶液(thermofisher，cat.no.:n301，美国)并反应约5分钟，然后通过用50μl的1m硫酸处理从而终止反应。使用光谱仪测定450nm的波长处的o.d.值。
[0083]
其结果是，如图1所示，当通过elisa观察seq id no:1至seq id no:6的各肽与rbd的结合模式时，确认了肽与rbd的结合倍数以浓度依赖的方式增加。
[0084]
由此可见，本发明的肽具有识别并结合至sars-cov-2刺突蛋白的rbd的能力。
[0085]
[实施例3]
[0086]
本发明的肽抑制ace2-rbd结合的能力的确认
[0087]
为了确认本发明的肽是否可以阻断sars-cov-2对宿主细胞的侵袭，对本发明的肽是否抑制宿主细胞的膜蛋白ace2与sars-cov-2rbd的结合进行确认。
[0088]
具体而言，将2mm碳酸氢钠与ace2-fc蛋白(sino biological，cat.no.:10108-h02h，中国)等体积混合，并在96孔板中以100ng/100μl/孔分配，然后在4℃培养过夜，用ace2蛋白覆盖孔的表面。将这些孔用0.1％ pbs-t(0.1％吐温-20的pbs溶液)洗涤三次，然后分配100μl的3％ bsa，并在室温下封闭1小时。将100ng的重组sars-cov-2刺突rbd-his(sino biological，cat.no.:40592-v08b，中国)与各种浓度的肽溶液混合于pbs中，并在室温下反应1小时。用0.1％ pbs-t洗涤孔三次，然后用蛋白-肽混合物处理孔。使它们在室温下反应2小时，然后用0.1％ pbs-t洗涤三次。将这些孔用以1:1000稀释的抗his抗体hrp(abcam，cat.no.:ab1187，美国)的pbs溶液进行处理，并在室温下反应1小时，然后用0.1％pbs-t洗涤三次。分配100μl的tmb溶液(thermofisher，cat.no.:n301，美国)并反应约5分钟，然后通过用50μl的1m硫酸处理从而终止反应。使用光谱仪测定450nm的波长处的o.d.值。
[0089]
其结果是，如图2所示，确认了seq id no:1至seq id no:6的各个肽以浓度依赖的方式抑制rbd与ace2蛋白的结合。
[0090]
由此可见，本发明的肽与sars-cov-2刺突蛋白的rbd结合，以抑制刺突蛋白与ace2蛋白的结合。
[0091]
[实施例4]
[0092]
本发明的肽抑制人肺癌细胞中ace2-rbd结合的能力的确认
[0093]
为了确认本发明的肽是否具有预防、减轻和治疗哺乳动物细胞中的冠状病毒感染的能力，对于用肽处理人肺癌细胞系后，sars-cov-2刺突蛋白rbd与宿主细胞的ace2结合的能力是否降低进行确认。
[0094]
具体而言，将人肺癌细胞系(腺癌人肺泡基底上皮细胞)a549细胞(韩国细胞系库，cat.no.:10185，韩国)以5x105个细胞/孔的密度接种至6孔板并培养24小时。将500ng的重组sars-cov-2刺突rbd-his(sino biological，cat.no.:40592-v08b，中国)与各种浓度的肽溶液混合于1ml的dmem培养基中，并在室温下反应1小时。用dmem培养基洗涤培养了一天的a549细胞，然后向细胞中添加900μl的重组sars-cov-2刺突rbd/肽混合物。在co2培养箱中以37℃培养2小时后，将细胞用pbs洗涤两次，并用200μl的裂解缓冲液处理以裂解细胞。通过用5x样品缓冲液处理，然后使用10％ sds-page凝胶进行sds-page，从而制备样品。将通过sds-page分离的蛋白转移至pvdf膜，然后在室温用5％脱脂奶封闭1小时。接下来，将抗his抗体hrp(abcam，cat.no.:ab1187，美国)在5％脱脂奶中以1:1000稀释，与膜反应2小时，并用0.1％pbs-t(0.1％吐温-20的pbs溶液)洗涤三次，每次10分钟。使用ecl溶液(ge healthcare，cat.no.:rpn2232，美国)对膜进行检测。
[0095]
其结果是，如图3所示，确认了根据本发明的seq id no:1至seq id no:4的各肽以浓度依赖的方式抑制sars-cov-2刺突rbd与宿主细胞的ace2的结合。
[0096]
由此可见，本发明的肽通过与sars-cov-2的刺突蛋白结合，抑制了刺突蛋白与宿主细胞的ace2的结合，从而可以预防或治疗宿主细胞的病毒感染。
[0097]
[实施例5]
[0098]
本发明的肽抑制sars-cov-2细胞感染的作用的确认
[0099]
为了直接确认本发明的肽是否具有抑制细胞被sars-cov-2感染的作用，进行了病灶减少中和测试(frnt)。
[0100]
具体而言，将vero e6细胞(atcc，美国)以2x104个细胞/孔的密度接种至96孔板，然后培养直至90％至100％融合。将各种浓度的500个病灶形成单位(ffu)/孔的sars-cov-2和肽样品以1:1的比例混合，并在37℃反应1小时。用肽和病毒的混合物处理单层的vero e6细胞，并在37℃培养1小时。除去上清液，然后用包含1.6％羧甲基纤维素(cmc)的dmem培养基进行处理，并在37℃培养24小时。除去上清液，然后将细胞用4％多聚甲醛固定并用pbs洗涤。通过用包含0.2％ triton x-100和1％ bsa的pbs处理进行30分钟的细胞透化，然后用pbs洗涤。用在包含1％ bsa的pbs溶液中以1:1000稀释的抗sars-cov-2核蛋白壳一抗(sino biological，中国)处理细胞1小时，并用pbst(包含1％吐温-20的pbs溶液)洗涤。用在包含1％ bsa的pbs溶液中以1:2000稀释的二抗(sino biological，中国)处理细胞1小时，并用pbst洗涤。用kpl trueblue
tm
过氧化物酶底物(seracare life sciences，美国)处理细胞，然后用蒸馏水洗涤，并通过elispot reader(cellular technology limited，美国)分析sars-cov-2病灶的数量。使用以下等式计算对病毒感染的抑制率：
[0101]
方程式1
[0102]
病毒感染抑制率(％)＝(对照组病灶数-治疗组病灶数)/对照组病灶数
×
100
[0103]
其结果是，如表2所示，确认了当用根据本发明的seq id no:1至seq id no:4的肽处理时，对于全部四种肽，对病毒感染的抑制率以浓度依赖的方式增加。
[0104]
由此可见，本发明的肽可以通过抑制细胞被sars-cov-2感染从而预防、减轻和治疗sars-cov-2感染。
[0105]
[表2]
[0106]

技术特征：
1.一种特异性识别严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)的蛋白或其一部分的肽，所述肽包括选自由seq idno:1至seq id no:6的序列组成的组中的任一种氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的肽，其中所述严重急性呼吸综合征冠状病毒2的蛋白为刺突蛋白。3.根据权利要求1所述的肽，其中所述肽与所述严重急性呼吸综合征冠状病毒2的表面的刺突蛋白结合，以抑制所述刺突蛋白与宿主细胞的细胞膜受体的结合。4.一种用于预防或治疗严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)感染的药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1所述的肽。5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中所述组合物与所述严重急性呼吸综合征冠状病毒2的表面的刺突蛋白结合，以抑制所述刺突蛋白与宿主细胞的细胞膜受体的结合。6.根据权利要求4所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。7.根据权利要求4所述的药物组合物，其中所述药物组合物以口服制剂、注射制剂或外用制剂的形式配制。8.一种用于检测严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)的组合物，所述组合物包含权利要求1所述的肽。

技术总结
本发明涉及：特异性识别严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的蛋白或其一部分的肽；包含该肽的用于预防或治疗SARS-CoV-2的组合物；以及包含该肽的用于检测SARS-CoV-2的组合物。合物。合物。


技术研发人员：郑镕池 金银美 李应智 李英敏 姜憪雅 郑民卿
受保护的技术使用者：凯尔格恩有限公司
技术研发日：2021.07.15
技术公布日：2023/8/9