一种黄色系列羊肚菌多孢子融合分离方法与流程

1.本发明涉及羊肚菌多孢子融合技术领域，特别是一种黄色系列羊肚菌多孢子融合分离方法。


背景技术：

2.羊肚菌(morchelladeliciosafr.)是一种珍稀名贵的食药两用菌，也是世界四大名菌之一，它功能齐全、香味独特、营养丰富、食效显著，具有强身健体、防病治病、延年益寿、提高人体免疫力的功能，它即是宴席上的珍品，又是中医药中久负盛名的良药，过去曾是敬献皇家的滋补贡品，羊肚菌传统上主要靠采集野生品种，近几年，人工栽培面积不断扩张，但栽培技术标准尚不完善，近两年由于自然气候的变化，频繁地出现极端天气，国内羊肚菌主产区种植的六妹系列羊肚菌品种，出现大面积绝产现象，野生六妹系列羊肚菌多生长在海拔1000米—3000米以上的地区，属于高海拔低温型品种，而野生黄色系列羊肚菌多生长在海拔200米—1800米范围内，属于低海拔菌根型真菌品种，六妹系列羊肚菌菌种分离技术简单，一般采用组织分离成功率高，而黄色系列羊肚菌组织分离成功率非常低，且难以获得有效菌株，而野生黄色系列羊肚菌由于受地理、环境、气候等条件的影响，每年只生长一次，采集又困难，因此产量很少，价格相当昂贵，通过大量人工采摘破坏，野生资源面临枯竭；
3.羊肚菌人工种植的菌种是从羊肚菌子实体通过组织分离，进行多次纯化培养，最终选取产量稳定、抗逆性强的品种作为栽培种，本发明通过采集野生黄色系列羊肚菌标本，搜集成熟孢子后，采用多孢子融合技术，能改善现有黄色系列羊肚菌菌种分离技术存在的主要不足和缺陷，提高黄色系列羊肚菌菌种分离水平，解决羊肚菌种植品种退化的问题，减少和控制羊肚菌种植风险和种植成本，可有效解决制约羊肚菌产业化发展过程中存在的品种单一和长期组织分离种源退化瓶颈问题，通过总结相关经验，完善国内主产区羊肚菌栽培技术规程，降低羊肚菌种植户投资风险，向广大种植户提供可靠的抗逆性强的黄色系列羊肚菌种源，能够有效解决羊肚菌重茬问题；
4.羊肚菌种植主要面临三大问题：一是长期采用组织分离导致菌种退化加速，影响羊肚菌产量和加大投资风险；二是引进菌株对环境的依赖性较强，抗逆性差、产量不稳；三是现有可种植的羊肚菌品种单一，不能应对极端的天气变化，通过采用黄色系列羊肚菌多孢子融合分离技术，有效解决黄色系列羊肚菌商业化发展进程，将成为羊肚菌产业发展的里程碑。


技术实现要素：

5.实现上述目的本发明的技术方案为：一种黄色系列羊肚菌多孢子融合分离方法，包括以下步骤：s1、培养基的制作，s2、野生黄色系列羊肚菌标本采集，s3、标本预处理，s4、子囊孢子提取，s5、多孢子融合以及s6、菌丝培养提纯；
6.所述步骤s1、培养基的制作步骤：将小米称量50g，放入锅中加1000ml的蒸馏水，煮
至小米开花，用3层纱布过滤取滤液，若滤液减少,可用蒸馏水将滤液加至1000ml，倒入锅中，将滤液微火加热，依次加入琼脂20g、磷酸二氢钾3g，碳酸钙2g等，加热过程中不断搅拌至琼脂融化，趁热将培养液分装在平皿中；
7.所述步骤s2：野生黄色系列羊肚菌标本采集：每年3—5月份在海拔500米左右的山林中采集野生新鲜黄色羊肚菌，选用子实体健壮、无畸形、无病虫害,成熟度为6-8成的野生黄色羊肚菌,带基质土一起拔出，先栽入小盆中放入22℃培养箱中培养72小时让黄色羊肚菌子实体进一步成熟；
8.所述步骤s3、标本预处理：首先用刀片把种菇基部的土壤去掉，在无菌条件下，取部分菇帽组织，用不锈钢丝制作成吊钩将羊肚菌组织块悬挂在吊钩上，放入提前灭完菌的三角瓶中；
9.所述步骤s4、子囊孢子提取：所有接种工具消毒后，放入超净工作台进行紫外线照射消毒30min，先将三角瓶内羊肚菌组织块取出，再往三角瓶内加入20ml无菌水摇均匀；
10.所述步骤s5、多孢子融合:待孢子刚刚萌发，在显微镜下单个单个挑选，取萌发快长势旺盛的萌发孢子8—20个，融合后集中放置在另外制备的培养皿中，在15℃恒温下培养72小时；
11.所述步骤s6、菌丝培养提纯：培养72小时后，生长前端的菌丝体即是羊肚菌菌丝体，每次只挑取前端生长最旺盛的菌丝体，利用反向接入法，将母种块接入培养皿盖子上中心位置，反向在18℃恒温培养48小时，待菌丝生长到培养基面上1cm时，在超净工作台中取出接种块，然后继续放置在15℃恒温箱培养48小时，如此重复5—8次提纯，目的是利用温差、时差和距离差，使得羊肚菌、杂菌之间的速度差，让羊肚菌菌丝和杂菌脱离，即可获得纯的黄色羊肚菌菌丝体。
12.作为优选的，所述步骤s1灭菌后自然冷却到50℃以下时打开高压锅,取出培养皿放入消毒后的超净工作台中备用。
13.作为优选的，所述步骤s1每只平皿装约10ml，冷却后装入17x33的聚丙烯袋子中扎口，然后平放入高压锅中进行121℃灭菌30min。
14.作为优选的，所述步骤s3用棉塞封口，再放入22℃培养箱中培养48小时，待子囊孢子弹射。
15.作为优选的，所述步骤s4用吸管吸入孢子液，在无菌条件下，滴入培养皿中，放置在15℃恒温箱中培养48小时。
16.作为优选的，所述步骤s6即羊肚菌纯母种，18℃恒温继续培养2周左右就会大量产生菌核，菌核产生量大而密为有效菌株，如果不产生菌核应该及时淘汰，经生物学鉴别和出菇试验后，即可用于生产。
17.利用本发明的技术方案制作的一种黄色系列羊肚菌多孢子融合分离方法，羊肚菌的菌种质量直接关系到羊肚菌种植的产量，多孢子融合分离技术是羊肚菌获得可靠种源的关键环节,能有效保护我国珍稀的野生羊肚菌资源的同时，又能推动羊肚菌产业的规模化种植，降低种植风险和种植成本，本发明提供了一种安全、高效、成功率可达95％以上的羊肚菌母种种分离方法。
附图说明
18.图1为本发明所述一种黄色系列羊肚菌多孢子融合分离方法的步骤流程示意框图。
具体实施方式
19.下面结合附图对本发明进行具体描述，如图1所示，一种黄色系列羊肚菌多孢子融合分离方法。
20.实施例：一种黄色系列羊肚菌多孢子融合分离方法，包括以下步骤：s1、培养基的制作，s2、野生黄色系列羊肚菌标本采集，s3、标本预处理，s4、子囊孢子提取，s5、多孢子融合以及s6、菌丝培养提纯；步骤s1、培养基的制作步骤：将小米称量50g，放入锅中加1000ml的蒸馏水，煮至小米开花，用3层纱布过滤取滤液，若滤液减少,可用蒸馏水将滤液加至1000ml，倒入锅中，将滤液微火加热，依次加入琼脂20g、磷酸二氢钾3g，碳酸钙2g等，加热过程中不断搅拌至琼脂融化，趁热将培养液分装在平皿中，每只平皿装约10ml，冷却后装入17x33的聚丙烯袋子中扎口，然后平放入高压锅中进行121℃灭菌30min，灭菌后自然冷却到50℃以下时打开高压锅,取出培养皿放入消毒后的超净工作台中备用；步骤s2：野生黄色系列羊肚菌标本采集：每年3—5月份在海拔500米左右的山林中采集野生新鲜黄色羊肚菌，选用子实体健壮、无畸形、无病虫害,成熟度为6-8成的野生黄色羊肚菌,带基质土一起拔出，先栽入小盆中放入22℃培养箱中培养72小时让黄色羊肚菌子实体进一步成熟；步骤s3、标本预处理：首先用刀片把种菇基部的土壤去掉，在无菌条件下，取部分菇帽组织，用不锈钢丝制作成吊钩将羊肚菌组织块悬挂在吊钩上，放入提前灭完菌的三角瓶中；用棉塞封口，再放入22℃培养箱中培养48小时，待子囊孢子弹射；步骤s4、子囊孢子提取：所有接种工具消毒后，放入超净工作台进行紫外线照射消毒30min，先将三角瓶内羊肚菌组织块取出，再往三角瓶内加入20ml无菌水摇均匀；用吸管吸入孢子液，在无菌条件下，滴入培养皿中，放置在15℃恒温箱中培养48小时；步骤s5、多孢子融合:待孢子刚刚萌发，在显微镜下单个单个挑选，取萌发快长势旺盛的萌发孢子8—20个，融合后集中放置在另外制备的培养皿中，在15℃恒温下培养72小时；步骤s6、菌丝培养提纯：培养72小时后，生长前端的菌丝体即是羊肚菌菌丝体，每次只挑取前端生长最旺盛的菌丝体，利用反向接入法，将母种块接入培养皿盖子上中心位置，反向在18℃恒温培养48小时，待菌丝生长到培养基面上1cm时，在超净工作台中取出接种块，然后继续放置在15℃恒温箱培养48小时，如此重复5—8次提纯，目的是利用温差、时差和距离差，使得羊肚菌、杂菌之间的速度差，让羊肚菌菌丝和杂菌脱离，即可获得纯的黄色羊肚菌菌丝体，即羊肚菌纯母种，18℃恒温继续培养2周左右就会大量产生菌核，菌核产生量大而密为有效菌株，如果不产生菌核应该及时淘汰，经生物学鉴别和出菇试验后，即可用于生产。
21.上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理，属于本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种黄色系列羊肚菌多孢子融合分离方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、培养基的制作，s2、野生黄色系列羊肚菌标本采集，s3、标本预处理，s4、子囊孢子提取，s5、多孢子融合以及s6、菌丝培养提纯；所述步骤s1、培养基的制作步骤：将小米称量50g，放入锅中加1000ml的蒸馏水，煮至小米开花，用3层纱布过滤取滤液，若滤液减少,可用蒸馏水将滤液加至1000ml，倒入锅中，将滤液微火加热，依次加入琼脂20g、磷酸二氢钾3g，碳酸钙2g等，加热过程中不断搅拌至琼脂融化，趁热将培养液分装在平皿中；所述步骤s2：野生黄色系列羊肚菌标本采集：每年3—5月份在海拔500米左右的山林中采集野生新鲜黄色羊肚菌，选用子实体健壮、无畸形、无病虫害,成熟度为6-8成的野生黄色羊肚菌,带基质土一起拔出，先栽入小盆中放入22℃培养箱中培养72小时让黄色羊肚菌子实体进一步成熟；所述步骤s3、标本预处理：首先用刀片把种菇基部的土壤去掉，在无菌条件下，取部分菇帽组织，用不锈钢丝制作成吊钩将羊肚菌组织块悬挂在吊钩上，放入提前灭完菌的三角瓶中；所述步骤s4、子囊孢子提取：所有接种工具消毒后，放入超净工作台进行紫外线照射消毒30min，先将三角瓶内羊肚菌组织块取出，再往三角瓶内加入20ml无菌水摇均匀；所述步骤s5、多孢子融合:待孢子刚刚萌发，在显微镜下单个单个挑选，取萌发快长势旺盛的萌发孢子8—20个，融合后集中放置在另外制备的培养皿中，在15℃恒温下培养72小时；所述步骤s6、菌丝培养提纯：培养72小时后，生长前端的菌丝体即是羊肚菌菌丝体，每次只挑取前端生长最旺盛的菌丝体，利用反向接入法，将母种块接入培养皿盖子上中心位置，反向在18℃恒温培养48小时，待菌丝生长到培养基面上1cm时，在超净工作台中取出接种块，然后继续放置在15℃恒温箱培养48小时，如此重复5—8次提纯，目的是利用温差、时差和距离差，使得羊肚菌、杂菌之间的速度差，让羊肚菌菌丝和杂菌脱离，即可获得纯的黄色羊肚菌菌丝体。2.根据权利要求1所述的一种黄色系列羊肚菌多孢子融合分离方法，其特征在于，所述步骤s1灭菌后自然冷却到50℃以下时打开高压锅,取出培养皿放入消毒后的超净工作台中备用。3.根据权利要求1所述的一种黄色系列羊肚菌多孢子融合分离方法，其特征在于，所述步骤s1每只平皿装约10ml，冷却后装入17x33的聚丙烯袋子中扎口，然后平放入高压锅中进行121℃灭菌30min。4.根据权利要求1所述的一种黄色系列羊肚菌多孢子融合分离方法，其特征在于，所述步骤s3用棉塞封口，再放入22℃培养箱中培养48小时，待子囊孢子弹射。5.根据权利要求1所述的一种黄色系列羊肚菌多孢子融合分离方法，其特征在于，所述步骤s4用吸管吸入孢子液，在无菌条件下，滴入培养皿中，放置在15℃恒温箱中培养48小时。6.根据权利要求1所述的一种黄色系列羊肚菌多孢子融合分离方法，其特征在于，所述步骤s6即羊肚菌纯母种，18℃恒温继续培养2周左右就会大量产生菌核，菌核产生量大而密为有效菌株，如果不产生菌核应该及时淘汰，经生物学鉴别和出菇试验后，即可用于生产。

技术总结
本发明公开了一种黄色系列羊肚菌多孢子融合分离方法，包括以下步骤：S1、培养基的制作，S2、野生黄色系列羊肚菌标本采集，S3、标本预处理，S4、子囊孢子提取，S5、多孢子融合以及S6、菌丝培养提纯；本发明涉及羊肚菌多孢子融合技术领域，羊肚菌的菌种质量直接关系到羊肚菌种植的产量，多孢子融合分离技术是羊肚菌获得可靠种源的关键环节,能有效保护我国珍稀的野生羊肚菌资源的同时，又能推动羊肚菌产业的规模化种植，降低种植风险和种植成本，本发明提供了一种安全、高效、成功率可达95％以上的羊肚菌母种种分离方法。羊肚菌母种种分离方法。羊肚菌母种种分离方法。


技术研发人员：郭培荣 李媛媛 董柯良 赵祥生 郭培红 李任 陈敏
受保护的技术使用者：郭培荣
技术研发日：2023.06.28
技术公布日：2023/8/9