一种用于检测苯二氮卓类药物的MIPs固相微萃取探针及其应用方法与流程

一种用于检测苯二氮卓类药物的mips固相微萃取探针及其应用方法
技术领域
1.本发明属于检测技术领域，具体涉及一种用于检测苯二氮卓类药物的分子印迹聚合物（mips）固相微萃取探针及其应用方法。


背景技术：

2.苯二氮卓类药物（bzds）是以苯环和七元亚胺内酰胺环骈和为母核结构的一类衍生物，可通过抑制中枢神经系统产生抗焦虑、抗惊厥、镇静催眠等作用，主要用于焦虑、失眠、兴奋激越、紧张综合征、癫痫、肌痉挛、酒精戒断及外科术前的辅助用药。目前已有报道畜牧业饲养者将该类药作为生长促进剂添加动物饲料中，使其嗜睡减耗，增加体重；个别商贩会在动物运输和屠宰过程中添加使用bzds，降低动物死亡率，减轻动物对不良刺激的机能反应，保持肉质。食用含有bzds残留的动物源性产品，会对人造成乏力、嗜睡、晕厥等副作用，长期食用可能会产生依赖性和成瘾性，造成严重的公共卫生问题。欧盟对bzds使用提出了限量标准；我国在《药品管理法实施条例》与《食品卫生法》中明确规定，禁止在中成药及保健食品中添加bzds；农业农村部第176号公告《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》中就有bzds，因此建立一种测定生物检材中痕量bzds残留的灵敏快速廉价分析方法至关重要。
3.苯二氮卓类药物的检测方法主要有质谱法、免疫分析法、光谱法和电化学分析法等。由于食品样品或生物检材的组成成分较复杂且苯二氮卓类药物含量较低，在仪器分析前，需对样品进行前处理，分离纯化目标物，目前常用的前处理方法有固相萃取法（spe）和分散固相萃取技术（dspe），但这些方法较难实现目标物的选择性净化富集，且过程繁琐耗时，因此开发高效省时简易的前处理方法十分必要。
4.分子印迹聚合物（mips）是模板分子、功能单体和交联剂三种物质在致孔剂中通过共价键形成刚性结构的高分子聚合物。mips对目标物的识别具有高选择性和稳定性，被广泛应用于固相萃取、传感器、检测器等领域。但目前对mips的研究主要集中于食品中农兽药物残留的检测，且多以制造固相萃取柱填充材料为主，尚未有以mips制备固相微萃取探针用于选择分离提取生物检材中依赖性药品的研究报道。本发明采用溶胶凝胶法合成mips，以阿普唑仑（alprazolam）、咪达唑仑（midazolam）或艾司唑仑（estazolam）为模板分子，苯基三甲氧基硅烷（ptmos）为功能单体，四乙氧基硅烷（teos）为交联剂，在不锈钢丝上镀膜形成mips固相微萃取探针（spme），添加二甲基二甲氧基硅烷（mtmos）提升溶胶凝胶的稳定性和疏水性，将其联合超高效液相色谱-串联质谱法（uplc-ms/ms），建立了一种血液和尿液中痕量苯二氮卓类物质检测的新方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种用于检测苯二氮卓类药物的分子印迹聚合物（mips）固相微萃取探针及其应用方法，其前处理简单快速灵敏，检测准确度高，可用于生物检材中
痕量苯二氮卓类药物的快速检测。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种用于检测苯二氮卓类药物的mips固相微萃取探针，其是以苯二氮卓类药物为模板分子，苯基三甲氧基硅烷（ptmos）为功能单体，四乙氧基硅烷（teos）为交联剂，二甲基二甲氧基硅烷（mtmos）为改性剂，在不锈钢丝上镀膜形成分子印迹聚合物（mips），从而得到用于苯二氮卓类药物检测的mips固相微萃取探针。
7.进一步地，所述苯二氮卓类药物为阿普唑仑、咪达唑仑或艾司唑仑。
8.所述mips固相微萃取探针的制备包括以下步骤：1）硅烷化不锈钢丝的制备：将不锈钢丝经预处理后，于乙烯基三乙氧基硅烷（vteos）与甲醇的混合溶液中浸泡3h，之后经清洗、干燥，获得硅烷化不锈钢丝；2）分子印迹聚合物（mips）的制备：将含teos、ptmos、mtmos的混合溶液经300r/min磁力搅拌1h后加入苯二氮卓类药物的标准溶液，300r/min继续磁力搅拌1h，得到mips溶胶溶液；3）mips固相微萃取探针的制备：将步骤1）制得的硅烷化不锈钢丝浸入步骤2）所得mips溶胶溶液中，并于55℃恒温水浴2h，从而在不锈钢丝表面覆盖一层mips膜，再进行干燥；如此重复3次后，将表面包裹mips膜的不锈钢丝洗脱至无法检测到模板分子为止，经干燥即得到mips固相微萃取探针。
9.进一步地，步骤1）中所述预处理是将不锈钢丝用砂纸（1500～2000目）打磨至表面光滑，然后依次用甲醇和超纯水超声清洗30分钟，氮气干燥，再浸泡在1 mol/l naoh溶液1小时、1 mol/l hcl溶液中5 min、超纯水溶液中5 min，氮气干燥。
10.进一步地，步骤1）所述混合溶液中vteos与甲醇的体积比为1:10。
11.进一步地，步骤2）所述混合溶液由10mmol teos、5mmol ptmos、5mmol mtmos、2ml无水乙醇、100μl 0.1m的hcl溶液和2ml超纯水组成。
12.进一步地，步骤2）所述标准溶液中苯二氮卓类药物的含量与混合溶液中苯基三甲氧基硅烷的摩尔比为1:10。
13.进一步地，步骤3）所述洗脱是将表面包裹mips膜的不锈钢丝在由乙腈与0.1vol%甲酸溶液组成的洗脱液中磁力搅拌1h；所述洗脱液中乙腈与0.1vol%甲酸溶液的体积比为7:3。
14.利用所述mips固相微萃取探针检测生物检材中苯二氮卓类药物含量的方法，是利用所述mips固相微萃取探针对生物检材进行富集处理，再采用超高效液相色谱-串联质谱法（uplc-ms/ms）进行检测，以获得生物检材中苯二氮卓类物质的含量。其具体是取1ml生物检材，加入2ml ph=9.2的硼砂缓冲液混匀，在室温下插入所述mips固相微萃取探针，振摇吸附40min后，将探针用乙腈和超纯水依次洗涤后，插入3ml的解析液中振摇60min，之后离心，取1 ml上清液过0.22 μm滤膜，供超高效液相色谱-串联质谱测定。
15.进一步地，所述生物检材包括血液和尿液。
16.进一步地，所述解析液是由乙腈与0.1vol%甲酸溶液按体积比7:3混合制成。
17.进一步地，所用超高效液相色谱的检测条件为：色谱柱 ultimate pfp，2.1
×
100mm，5μm；进样量10μl；柱温：40℃；流速：200μl/min；流动相a：20mmol/l乙酸铵的0.1vol%甲酸水溶液；流动相b：乙腈；等度洗脱条件：30%流动相a，70%流动相b；洗脱时间6min。
18.进一步地，扫描方式：esi
+
；检测方式：mrm；毛细管电压：3.5 kv；锥孔电压：44 v；离子源温度：120℃；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流速：1000l/hr；碰撞气流速：50l/hr。
19.本发明的显著优势在于：本发明以阿普唑仑、咪达唑仑、艾司唑仑为模板分子，苯基三甲氧基硅烷为功能单体，四乙氧基硅烷为交联剂，在乙醇-水体系中制备分子印迹聚合物，并在不锈钢丝上镀膜形成固相微萃取探针，该探针具较好的热稳定性和机械稳定性，便于携带、成本低廉，并对阿普唑仑、咪达唑仑、艾司唑仑具有高萃取效率和高选择性，适用于生物检材的前处理环节。
20.将该分子印迹聚合物固相微萃取探针与超高效液相色谱串联质谱结合，可快速检测生物检材中痕量苯二氮卓类药物残留。经检测，三种苯二氮卓类药物在0.1~100.0 μg/l范围内线性关系良好，相关系数（r2）为0.994~0.997，检出限（s/n=3）为0.1~0.2 μg/l。在实际血液和尿液样本品中三种苯二氮卓类药物的检测中，其加标回收率在80.9~102.9%之间，重复6次实验的标准偏差《7.2%，表明该方法检测准确度高，可实现生物检材中痕量苯二氮卓类药物的快速检测，为食品安全监管和法医毒物检测提供了新的思路。
附图说明
21.图1为（a）未洗脱nip、（b）已洗脱nips、（c）未洗脱mips、（d）已洗脱阿普唑仑-mips、（e）已洗脱艾司唑仑-mips、（f）已洗脱咪达唑仑-mips的原子力显微镜表征图。
22.图2为6种固相微萃取探针的吸附动力学曲线。
23.图3为6种固相微萃取探针的静态吸附曲线。
24.图4为6种固相微萃取探针对不同物质的吸附能力比较情况图。
25.图5为样品溶液ph值对mips吸附能力的影响情况图。
26.图6为解吸溶剂对mips吸附能力的影响情况图。
27.图7为解吸时间对mips吸附能力的影响情况图。
具体实施方式
28.为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
29.1.实验部分1.1仪器与试剂和样品waters xero tqd液相色谱三重四极杆质谱联用仪（美国waters公司）；超纯水系统（smart-n，中国力康集团）；5500afm 原子力显微镜 (美国agilent公司)；振摇机器（ql-901，中国其林贝尔仪器制造有限公司）；高速冷冻离心机（st-16r，赛默飞世尔科技有限公司）；干燥箱（shek6000-8ce，赛默飞世尔科技有限公司）。
30.苯基甲氧基硅烷（99%，ptmos）、四乙氧基硅烷（98%，teos）、甲基甲氧基硅烷（99%，mtmos）、乙烯基三乙氧基硅烷（97%，vteos）（均购自美国sigma-aldrich公司）；氢氧化钠（片状固体）（中国阿拉丁公司）；阿普唑仑（alprazolam）、咪达唑仑（midazolam）、艾司唑仑（estazolam）、地西泮（diazepam）、劳拉西泮（lorazepam）标准溶液（美国默克公司）；盐酸、丙酮（分析纯，上海沪试公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，瑞典欧森巴克化学公司）；乙醇（分析纯，
中国西陇科技公司）；硼砂缓冲液（ph 9.2，上海虹北试剂有限公司）；carbowax-聚乙二醇（peg）、聚二甲基硅氧烷（pdms）、聚丙烯酸酯（pa）固相微萃取装置（美国默克公司）。
31.1.2色谱-质谱检测条件1.2.1液相色谱条件色谱柱（ultimate pfp，2.1
×
100mm，5μm，中国月旭科技公司）；进样量10μl；柱温：40℃；流速：200μl/min；流动相a：20mmol/l乙酸铵的0.1%甲酸水溶液；流动相b：乙腈；等度洗脱条件：30%流动相a，70%流动相b，洗脱时间6min。
32.1.2.2质谱条件扫描方式：esi
+
；检测方式：mrm；毛细管电压：3.5 kv；锥孔电压：44 v；离子源温度：120℃；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流速：1000l/hr；碰撞气流速：50l/hr；其他质谱参数见表1。
33.表1 3种苯二氮卓类药物的质谱参数优化
34.1.3标准溶液配制准确吸取阿普唑仑、咪达唑仑、艾司唑仑标准品，用甲醇配制成0.1g/l的标准储备液，之后准确吸取适量阿普唑仑、咪达唑仑、艾司唑仑标准储备液，用甲醇稀释成10.0 mg/l的中间液；吸取适量中间液，分别用甲醇稀释成浓度为1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、250.0、500.0 μg/l的标准溶液。
35.1.4 mips和nips固相微萃取探针的制备1.4.1不锈钢纤维硅烷化取直径5μl的不锈钢丝8cm，用砂纸（1500～2000目）打磨至表面光滑，依次用甲醇和超纯水超声清洗30分钟，氮气干燥，继续浸泡在1 mol/l naoh溶液1小时、1 mol/l hcl溶液中5 min、超纯水中5 min，氮气干燥，将干燥后的不锈钢丝浸入乙烯基三乙氧基硅烷（vteos）-甲醇溶液(1:10，v/v)中3小时，用丙酮和超纯水依次洗涤3次，氮气干燥，得到硅烷化不锈钢丝。
36.1.4.2 mip和非印迹聚合物（nip）的制备取10mmol teos、5mmol ptmos、5mmol mtmos、2ml无水乙醇、100μl hcl溶液（0.1m）和2ml超纯水组成混合溶液，300r/min磁力搅拌1h，得到溶胶溶液，该溶胶溶液即为非分子印迹聚合物（nips）。
37.加入0.5μmol的不同标准溶液（阿普唑仑、咪达唑仑、艾司唑仑），300r/min磁力搅拌1h，得到对应分子印迹聚合物（mips）。
38.1.4.3固相微萃取探针的制备取上述mips溶胶溶液至玻璃管中氮吹5min，然后将硅烷化不锈钢纤维浸入到mips溶胶溶液中，55℃恒温水浴2h，可观察到不锈钢纤维表面覆盖了一层薄薄的mips膜，80℃干燥2小时后，再次浸入到新的mips溶胶溶液中，并按照上述程序重复涂覆3次。将所得mips包裹的不锈钢纤维在乙腈-0.1%甲酸溶液（7:3，v/v)中磁力搅拌洗脱1h，直至洗脱液无法检测到模板分子为止，然后用乙腈洗涤并干燥，保存于干燥器备用。
39.nips固相微萃取探针除选用的溶液为nips以外，其他操作与mips固相微萃取探针制备过程基本相同。
40.1.5 mips吸附试验1.5.1吸附容量考察吸附动力学试验：取mips和nips固相微萃取探针各6根，分别放入到5ml浓度为100.0 μg/l的三种目标物标准溶液中，常温振荡。不同时间间隔同时取出1份mips和nips，用乙腈和超纯水依次洗涤探针（浸渍1s），然后将探针插入3ml的解析液中，振摇60min，离心后取1 ml上清液过0.22 μm滤膜，供uplc-ms/ms测定。以10、20、30、40、50、60 min时的吸附量q和吸附时间t作图，形成吸附动力学曲线。通过公式（1）计算吸附量。
41.q=（c
i-cf）v/n
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（1）式中：q（ng）为吸附量；ci（ng/ml）为溶液中目标物初始浓度；cf（ng/ml）为溶液中吸附目标物后的浓度；v（ml）为溶液体积；n为使用的固相微萃取探针数。
42.静态平衡吸附试验：取mips和nips固相微萃取探针各6根，分别放入到2ml不同浓度（10.0、20.0、50.0、100.0、250.0、500.0μg/l）的三种目标物标准溶液中，室温振摇吸附40min。吸附完成后，用乙腈和超纯水依次洗涤探针（浸渍1s），然后将探针插入3ml的解析液中，振摇60min，离心取1 ml上清液过0.22 μm滤膜，供uplc-ms/ms测定。以吸附量q与目标物浓度c作图，绘制等温吸附曲线。
43.1.5.2选择性吸附试验为验证mips特异性，选择地西泮、劳拉西泮和其余两种目标物作为竞争物开展吸附实验，竞争物的浓度均为100.0 μg/l，于2ml标准溶液中各加1根mips和nips固相微萃取探针，室温振摇吸附40min，用乙腈和超纯水依次洗涤探针（浸渍1s），然后将探针插入3ml的解析液中，振摇60min，离心取1 ml上清液过0.22 μm滤膜，供uplc-ms/ms测定。通过公式（1）计算平衡吸附容量，比较mips和nips对目标物及竞争物的吸附量。
44.同时选择carbowax-聚乙二醇（peg）、聚二甲基硅氧烷（pdms）、聚丙烯酸酯（pa）这三种市场上流通的固相微萃取装置，于2ml浓度均为100 μg/l的三种目标物标准溶液中进行吸附平衡实验，比较商业探针和mips对目标物的吸附量。
45.1.6样品提取取血液或尿液样本1ml，加入2ml ph 9.2的硼砂缓冲液混匀，在室温下，将mips固相微萃取探针插入溶液中，振摇40min。取出探针，用乙腈和超纯水依次洗涤探针（浸渍1s），然后将探针插入3ml的解析液中，振摇60 min，离心取1 ml上清液过0.22 μm滤膜，供uplc-ms/ms测定。
46.2.结果与讨论2.1 mips制备条件优化
本发明采用阿普唑仑、咪达唑仑、艾司唑仑分别为模板分子合成单模板mips，对模板分子与功能单体、交联剂的比例进行了优化，以mips与nips的平衡吸附容量之比判定固相微萃取探针的吸附效果，结果见表2。
47.表2 mips制备聚合条件的优化
48.由表2可见，当模板分子、功能单体、交联剂的比例为1:10:20时，mips固相微萃取探针对三种药物的吸附效果最好。当功能单体使用较少时，聚合物表面印迹位点少，与模板分子结合较少，吸附效果不佳；而使用过多又会导致功能单体互相结合，影响与模板分子的结合。当交联剂使用较少时，模板分子与功能单体的交联性不足，无法形成充足的分子印迹聚合物结合位点，吸附作用较低；当交联剂使用过量时，交联剂会与分子印迹聚合物结合位点交联，影响吸附效果。因此，选择模板分子、功能单体、交联剂的比例为1:10:20。
49.2.2 mips的表征通过用原子力显微镜（afm）测试对各聚合物进行表面形貌表征，结果见图1。由图1可见，未经洗脱的nips、经洗脱的nips、未洗脱的mips均为无孔洞、表面平整、连接紧密的刚性结构，而经乙腈-0.1%甲酸溶液（7:3，v/v）洗脱后的阿普唑仑-mips、艾司唑仑-mips、咪达唑仑-mips则具有分布均匀的孔洞，表明制备的mips在乙腈-0.1%甲酸溶液（7:3，v/v）中洗脱后，能成功洗脱掉模板分子。
50.2.3吸附容量考察吸附动力学试验结果见图2。由图2可见，固相微萃取探针的吸附能力随着吸附时间的增加而持续增大，当吸附时间达到40min时，吸附达到最优状态，阿普唑仑-mips、咪达唑仑-mips、艾司唑仑-mips的吸附量分别为362.2、335.4、308.6ng，对应nips的吸附量为63.4、62.2、68.1ng，可见mips的吸附量明显高于nips。当吸附时间超过40min时，mips的吸附量均出现略微降低的趋势，这归因于振摇条件下固相微萃取探针的吸附能力达到饱和后目标物出现复溶现象。
51.静态平衡吸附试验结果见图3。由图3可见，固相微萃取探针的吸附能力随着吸附液浓度的增大而逐渐提升，当吸附液浓度达到250μg/l时，固相微萃取探针的吸附量达到最大，阿普唑仑-mips、咪达唑仑-mips、艾司唑仑-mips的吸附量为360.5、342.4、302.8ng，对应nips的吸附量为60.3、66.4、66.8ng；在吸附液浓度低于250μg/l时，mips吸附量与吸附液
浓度呈现较好的线性关系，当吸附液浓度超过250μg/l时，mips的吸附量出现略微降低的趋势。
52.2.4吸附特异性考察在相同的吸附条件下，比较不同mips和nips固相微萃取探针对阿普唑仑、咪达唑仑、艾司唑仑、地西泮、劳拉西泮的吸附能力，结果见图4。由图4可见，每种mips仅对特定目标物有高吸附能力，阿普唑仑-mips、咪达唑仑-mips和艾司唑仑-mips对目标物的吸附量为140.6、130.8、112.4ng，是竞争物的3.2~4.3、2.8~3.6、2.9~3.7倍，证明mips形成的高分子聚合物对模板分子具有选择性和识别性，这是由于其空间结构与结合位点与模板分子高度匹配，与其他物质匹配较少。
53.在相同的吸附条件下，比较不同商业探针和mips对目标物的吸附能力，以吸附量/目标物总量算吸附率，结果见表3。
54.表3 mips和商业探针对目标物的吸附能力比较
55.由表3可见，同一种商业固相微萃取装置对三种目标物的吸附能力较为接近，吸附效果较好的是聚丙烯酸酯探针，对阿普唑仑、咪达唑仑、艾司唑仑的吸附量为102.7、96.5、90.4ng，但仍低于每种mips对特定目标物的吸附量（分别为140.6、130.8、112.4ng），证明mips对目标物的选择性和识别性优于商业固相微萃取装置。
56.2.5提取条件优化以mips对1ml三种目标物（100.0 g/l）加标的血液样品的吸附值为指标，考察萃取过程中样品溶液ph、解吸溶剂、解吸时间对萃取效率的影响。
57.2.5.1样品溶液ph苯二氮卓类化合物可以以阳离子、阴离子或中间形式存在于水溶液中，因此在含水样品中形成的目标化合物的形式会极大地影响萃取效率。样品溶液ph在5~10之间mips对三种目标物的吸附值结果见图5。
58.由图5可见，当ph等于9时，阿普唑仑-mips、咪达唑仑-mips、艾司唑仑-mips对目标物吸附量最高，进一步增加ph会导致萃取效率降低。为获得最大的分析物萃取效率，使用硼砂缓冲液将测试溶液的ph调整为9。
59.2.5.2解吸溶剂选取在聚合物基质中与模板溶质有强相互作用的溶剂作为解吸溶剂，包括水、乙醇、甲醇、乙腈和乙腈-0.1%甲酸溶液（7:3，v/v)，结果见图6。
60.由图6可见，乙腈-0.1%甲酸溶液（7:3，v/v)的提取效率最高，因此选取乙腈-0.1%甲酸溶液（7:3，v/v)作为解吸溶剂。
61.2.5.3解吸时间在30-80min的时间范围内考察了解吸时间的影响，结果见图7。
62.由图7可见，大约60min后解吸达到平衡，选择60min作为实验的解吸时间。
63.2.6方法学验证2.6.1标准曲线和检测限采用外标法定量，在1.0、5.0、10.0、50.0、100.0μg/l五个质量浓度进行加标，以目标物的定量离子峰面积ｙ对质量浓度ｘ作标准曲线，阿普唑仑、咪达唑仑、艾司唑仑3种物质的标准曲线和相关系数见表4。以3倍信噪比算检出限，阿普唑仑、咪达唑仑的检测限为0.1μg/l，艾司唑仑的检测限为0.2μg/l。
64.表4 3种苯二氮卓类药物的方法学评价
65.2.6.2回收率采用血液和尿液阴性样品，在1.0、5.0、10.0μg/l三个添加水平进行加标回收实验，每个加标浓度6个平行样，加标回收实验结果见表5。表5显示，3种苯二氮卓类药物的加标回收率在80.9~102.9%之间，6平行的相对标准偏差《7.2%，证明该方法具有较好的准确性和稳定性。
66.表5血液和尿液样本中3种苯二氮卓类药物的加标回收率（%，x
±
s，n=6）
67.2.7实际样品测定从福州海关出入境人员和入境种牛中收集了78份血液样和53份尿液样本，按上述方法进行分析，在这些生物检材中均未检测到阿普唑仑、咪达唑仑、艾司唑仑残留。
68.3结论本发明制备了一种新型的分子印迹聚合物固相微萃取探针，该探针对阿普唑仑、咪达唑仑、艾司唑仑三种苯二氮卓类药物具有高萃取效率和高选择性。该探针具较好的热稳定性和机械稳定性，便于携带、成本低廉，所采用的方法使用样本量小，适用于生物检材的前处理环节，可尝试用于动植物活体样品的现场采样及长期监测。方法提取率、检出限和精密度满足检测要求，探针制备和提取过程均具有良好复现性，可用于生物检材中痕量阿普唑仑、咪达唑仑、艾司唑仑的选择性和敏感性监测，为食品安全监管和法医毒物检测提供新的思路。
69.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

技术特征：
1.一种用于检测苯二氮卓类药物的mips固相微萃取探针，其特征在于，以苯二氮卓类药物为模板分子，苯基三甲氧基硅烷为功能单体，四乙氧基硅烷为交联剂，二甲基二甲氧基硅烷为改性剂，在不锈钢丝上镀膜形成分子印迹聚合物，从而得到用于苯二氮卓类药物检测的mips固相微萃取探针。2.根据权利要求1所述的mips固相微萃取探针，其特征在于，所述苯二氮卓类药物为阿普唑仑、咪达唑仑或艾司唑仑。3.根据权利要求1所述的mips固相微萃取探针，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：1）硅烷化不锈钢丝的制备：将不锈钢丝经预处理后，于乙烯基三乙氧基硅烷与甲醇的混合溶液中浸泡3h，之后经清洗、干燥，获得硅烷化不锈钢丝；2）分子印迹聚合物的制备：将含四乙氧基硅烷、苯基甲氧基硅烷、甲基甲氧基硅烷的混合溶液经300r/min磁力搅拌1h后加入苯二氮卓类药物的标准溶液，300r/min继续磁力搅拌1h，得到mips溶胶溶液；3）mips固相微萃取探针的制备：将步骤1）制得的硅烷化不锈钢丝浸入步骤2）所得mips溶胶溶液中，并于55℃恒温水浴2h，从而在不锈钢丝表面覆盖一层mips膜，再进行干燥；如此重复3次后，将表面包裹mips膜的不锈钢丝洗脱至无法检测到模板分子为止，经干燥即得到mips固相微萃取探针。4.根据权利要求3所述的mips固相微萃取探针，其特征在于，步骤1）所述混合溶液中乙烯基三乙氧基硅烷与甲醇的体积比为1:10。5. 根据权利要求3所述的mips固相微萃取探针，其特征在于，步骤2）所述混合溶液由10mmol四乙氧基硅烷、5mmol苯基甲氧基硅烷、5mmol甲基甲氧基硅烷、2ml无水乙醇、100μl 0.1m的hcl溶液和2ml超纯水组成；所述标准溶液中苯二氮卓类药物的含量与混合溶液中苯基三甲氧基硅烷的摩尔比为1:10。6.根据权利要求3所述的mips固相微萃取探针，其特征在于，步骤3）所述洗脱是将表面包裹mips膜的不锈钢丝在由乙腈与0.1vol%甲酸溶液组成的洗脱液中磁力搅拌1h；所述洗脱液中乙腈与0.1vol%甲酸溶液的体积比为7:3。7.一种利用如权利要求1所述的mips固相微萃取探针检测生物检材中苯二氮卓类药物含量的方法，其特征在于：利用所述mips固相微萃取探针对生物检材进行富集处理，再采用超高效液相色谱-串联质谱法进行检测，以获得生物检材中苯二氮卓类物质的含量；所述生物检材包括血液和尿液。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，其具体是取1ml生物检材，加入2ml ph=9.2的硼砂缓冲液混匀，在室温下插入所述mips固相微萃取探针，振摇吸附40min后，将探针用乙腈和超纯水依次洗涤后，插入3ml的解析液中振摇60min，之后离心，取1 ml上清液过0.22 μm滤膜，供超高效液相色谱-串联质谱测定。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述解析液是由乙腈与0.1vol%甲酸溶液按体积比7:3混合制成。10. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所用超高效液相色谱的检测条件为：色谱柱 ultimate pfp，2.1
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100mm，5μm；进样量10μl；柱温：40℃；流速：200μl/min；流动相a：20mmol/l乙酸铵的0.1vol%甲酸水溶液；流动相b：乙腈；等度洗脱条件：30%流动相a，70%流
动相b；洗脱时间6min；所用质谱的检测条件为：扫描方式：esi
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；检测方式：mrm；毛细管电压：3.5 kv；锥孔电压：44 v；离子源温度：120℃；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流速：1000l/hr；碰撞气流速：50l/hr。

技术总结
本发明公开了一种用于检测苯二氮卓类药物的分子印迹聚合物（MIPs）固相微萃取探针及其应用方法，其是以苯二氮卓类药物阿普唑仑、咪达唑仑或艾司唑仑为模板分子，苯基三甲氧基硅烷为功能单体，四乙氧基硅烷为交联剂，二甲基二甲氧基硅烷为改性剂，在乙醇-水体系中制备分子印迹聚合物，并使其在不锈钢丝上镀膜而形成MIPs固相微萃取探针。将该探针与超高效液相色谱串联质谱结合，可快速检测生物检材中痕量苯二氮卓类药物残留。其前处理简单快速灵敏，检测准确度高，可用于生物检材中痕量苯二氮卓类药物的快速检测。氮卓类药物的快速检测。氮卓类药物的快速检测。


技术研发人员：叶洪 高博 曹洁 赖浩宇 陈燕雯
受保护的技术使用者：福州国际旅行卫生保健中心（福州海关口岸门诊部）
技术研发日：2023.06.28
技术公布日：2023/8/9