一种生物转化杨木生物质生产燃料乙醇的方法

1.本发明涉及一种生物转化杨木生物质生产燃料乙醇的方法，尤其涉及一种高糖化率和高糖醇转化率的燃料乙醇工艺，属于燃料乙醇生产的技术领域。


背景技术：

2.生物乙醇来源于各类生物质中的有机质，传统的第一代燃料乙醇主要由粮食作物为原料，存在“与人争粮，与粮争地”的粮食危机问题。因此二代燃料乙醇以农林废弃植物纤维为原料，是解决粮食危机和生物质资源浪费的希望，并且二代燃料乙醇生产技术已具备产业化示范的条件。
3.二代燃料主要以木质纤维素为原料，而木质纤维素是一种丰富的可再生资源，被认为是世界上最有前途的化石燃料替代品之一。木质纤维素占地球总生物量的40%左右，寻找可持续的、高效的、低成本的转化方式，是由石油基能源向生物基能源社会转变的基础。木质纤维素种类丰富，秸秆、枯草、林木枝桠等农林废弃物均可利用，每年大量的农林废弃物，可以保证生物能源的可持续发展。通过对木质纤维素原料的预处理、酶解和发酵等步骤，可以将原料中的生物质能转化为化学能。其中燃料乙醇的基本生产工艺主要包括降低原料粒度、破坏纤维素内在结构的理化因子预处理、释放单糖的酶解糖化、生产乙醇的微生物发酵、乙醇脱水的蒸馏等步骤。预处理的目的是破坏纤维素内在结构，提高木质纤维素底物的可及性，提高酶解效率。酶解糖化过程是将原料中保留的纤维素和半纤维素降解成可发酵性单糖，获得工业化生产中所需的高糖浓度水解液。随后发酵反应是以单糖（葡萄糖、木糖）为底物在微生物的代谢作用下转化生产乙醇。
4.杨木（populas.sp）属于硬木，在林木类生物质中纤维结构相对疏松，是生长最快的乔木之一。作为速生丰产树种，杨木在全世界广泛种植。随着现代育种技术的发展，使杨木品种不仅适于全球不同环境中种植，而且优化了杨木在生物工业中的应用特性。中国处于世界的杨木种植中心，如今在全国各地分布已超一亿亩，杨树人工林面积居世界之首。同时杨木植伐周期短，应用面广，每年产生大量的枝桠材和加工业弃料，极具发展及应用潜力。


技术实现要素：

5.针对目前二代燃料乙醇生产原料研究的局限性，以及对林业加工剩余物的高效利用，开发对于木质纤维素原料具有针对性的燃料乙醇生产工艺。本发明以杨木加工剩余物——杨木锯末为原料，开发了一种高效生物转化杨木生物质生产燃料乙醇的方法，将杨木生物质经过亚氯酸盐-稀硫酸两步法预处理，纤维素酶酶解处理后的水解液，采用发酵酿酒酵母6m-15与步骤（1）的杨木生物质水解液进行发酵生产燃料乙醇，工艺简单，适合工业化放大生产。
6.本发明的技术方案如下：一种生物转化杨木生物质生产燃料乙醇的方法，包括以下步骤：
（1）杨木生物质水解液的制备，采用亚氯酸盐-稀硫酸两步法预处理，调节ph，纤维素酶酶解，离心取上清液，补充蛋白胨、酵母粉，即得；（2）生物转化，采用发酵酿酒酵母6m-15与步骤（1）的杨木生物质水解液进行发酵；所述的发酵酿酒酵母6m-15菌株已于2020年08月17日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为cgmcc no.20436。分类命名为：酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
7.优选地，步骤（1）亚氯酸盐预处理条件为10%杨木生物质干重、4-5%亚氯酸盐；稀硫酸预处理条件为10%杨木生物质干重、0.1-0.4%（w/v）h2so4、121
±
2℃、120
±
5 min；纤维素酶酶解条件为：调节ph至4.8-5.0，添加35
±
2 fpu/g干重的诺维信纤维素酶进行酶解。
8.进一步地，酶解过程使用cao调节ph。
9.优选地，步骤（2）的具体过程为：对步骤（1）获得的水解液进行离心，保留上清液，补加蛋白胨、酵母粉配制成发酵液，调节ph至5.0
±
0.2，并按照od
600
3.5
±
0.2接种发酵菌株6m-15，发酵。
10.优选地，还包括将水解液规模放大发酵，生产高浓度乙醇。
11.优选地，步骤（2）发酵的控制条件为30
±
2℃，200 rpm，初始ph为5.0
±
0.2，发酵前6 h通气为度1
±
0.1 vvm，其余时间关闭通气；发酵时发酵罐填充体积为总体积的70%；在发酵初始添加消泡剂，后续视发酵情况进行添加。
12.优选地，所述的消泡剂为：格雷特生物发酵消泡剂gpe。
13.优选地，所述的杨木生物质为杨木锯末。
14.本发明根据杨木生物质木质素含量高以及半纤维素含量适中，且其半纤维素主要由木聚糖组成的特点，选择亚氯酸钠预处理粉碎后的原料，能够脱除近70%的木质素，纤维素和半纤维素损失均不足5%。随后根据脱木素后的原料特点，选择低酸浓度的稀硫酸预处理方式，通过条件优化，本发明提供的方法可解聚原料中的50%以上的半纤维素，纤维素解聚不明显。随后，对酶解过程中的ph中和试剂进行选择，选择cao进行ph调节，结合纤维素酶（35
±
2 fpu/g干重原料）可将原料的纤维素水解率提升至近92%，并且此时的抑制物浓度处于较低水平。
15.本发明提供了一种兼具多种优势的清液发酵策略，对酶解后的水解液仅进行离心（4000 rpm, 10 min）保留上清。因水解液具有一定浓度的抑制物，可以不对水解液进行灭菌（高温）处理，降低了操作成本的同时，还能使水解液中的纤维素酶可继续发挥作用。而发酵菌株6m-15有优越的发酵性能，具有一定的对抑制物的耐受性，可以在水解液中保持较优的生长并且不易染杂菌。在10%底物浓度的水解液中，发酵菌株6m-15的生长和葡萄糖代谢较优，但是在木糖利用中后期受水解液中抑制物存在的影响代谢较缓慢。本发明通调节发酵参数，提高发酵液初始ph，明显提升木糖的利用能力和发酵性能，使糖醇转化率达到理论值的90%以上。并在50 l发酵罐中进行体积放大实验，通过发酵罐优良的参数控制能力，使菌株的发酵效率进一步提升。
16.本发明的有益效果采用本技术的方案，解聚糖化过程可使原料的总糖（葡萄糖、木糖）化率达到理论值的92%。通过cao调节ph，并将发酵液初始ph调节至5.0
±
0.2，可使整个发酵过程的木糖消耗速率提升了179.54%，糖醇转化率由原来0.4397 g/g提高到了0.4621 g/g，达到理论值的
90.61%。在50 l发酵罐发酵时，几乎在36 h便可结束发酵，乙醇浓度达到了近40 g/l，糖醇转化率提高到0.4780 g/g，达到理论值的93.73%。
17.本发提供了一种“木素先行”策略的预处理方式，采用亚氯酸钠预处理后，原料组成成分占比发生明显变化，木质素含量减低。随后采用低酸浓度的解聚技术和酶解技术使水解液具有较高的糖浓度，并保持较低的抑制物水平。并优化发酵参数，大幅度的提升了发酵效率。优化形成了杨木生物质原料高效生物转化生产燃料乙醇的整体工艺流程，为林木类生物质的生物转化探索了道路。
18.保藏信息：保藏时间：2020年08月17日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号：cgmcc no.20436；分类命名：酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
19.图1 杨木生物质预处理条件优化结果；（a）不同酸浓度对杨木生物质解聚的影响；（b）不同酸浓度对杨木生物质酶解的影响；（c）不同中和方式对杨木生物质酶解的影响；图2 不同酸浓度、加酶量和酶解时长对酶解效果的影响；（a）相同酶解时长条件下，酸浓度与加酶量的增加对糖化率的影响；（b）相同加酶量条件下，酸浓度与酶解时长的增加对糖化率的影响；（c）相同酸浓度的条件下，加酶量和酶解时长的增加对糖化率的影响；图3 杨木生物质水解液发酵性能测试；（a）水解液未调节ph对发酵性能的影响；（b）水解液初始ph为4.5对发酵性能的影响；（c）水解液初始ph为5.0对发酵性能的影响；（d）水解液初始ph为5.5对发酵性能的影响；图4底物浓度为10%的水解液在发酵罐中发酵性能测试；（a）5 l发酵罐中发酵性能测试；（b）50 l发酵罐中发酵性能测试。
具体实施方式
20.实施例1 微生物培养基及基础培养条件（1）酿酒酵母培养基
①
酿酒酵母ypd/x培养基去离子水中加入1%（w/v）酵母粉和2%（w/v）蛋白胨，固体培养基的配制含2%（w/v）的琼脂，灭菌（115 ℃、20 min）备用。灭菌后根据计算在yp中加入400 g/l葡萄糖或木糖母液，使葡萄糖或木糖的浓度为20 g/l。ypd/x固体培养基的配制只需在yp灭菌时加入2%（w/v）的琼脂即可。
21.②
水解液yp培养基将水解液离心(4000 rpm、5 min)，收集上清液，取适量体积的水解液，加入1%（w/v）的酵母粉和2%（w/v）的蛋白胨，摇匀使其完全溶解，进行菌株发酵。
22.（2）酿酒酵母培养条件
酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）6m-15，菌株已于2020年08月17日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为cgmcc no.20436。
23.①
菌株活化酵母在ypd固体培养基上划线，30
±
2℃培养48 h，封存4℃备用。挑取ypd固体培养基上酵母单菌落，于ypd液体培养基中30
±
2℃、200 rpm、活化6-8 h，再次转接至新的ypd液体培养基中30
±
2℃、200 rpm、二次活化6-8 h。
24.②
摇瓶发酵参数恒温摇床条件为30
±
2℃、200 rpm、初始ph为5.0
±
0.2、接种od
600
3.5
±
0.2，于150 ml限氧瓶中装入30 ml发酵液，封口用橡胶塞并插上注射器针头控制限氧条件，发酵过程中未调节ph。每瓶作三个平行实验，采用实施例2所述hplc方法检测糖组分和发酵产物的变化。
25.③
发酵罐发酵参数发酵罐发酵条件为30
±
2℃，200 rpm，初始ph为5.0
±
0.2，接种量为发酵液体系得到10%（od
600
约为2.0），发酵前6 h通气量为1
±
0.1 vvm，其余时间关闭通气；发酵时发酵罐填充体积为总体积的70%；在发酵初始添加适量消泡剂，发酵过程中未调节ph。
26.实施例2 杨木生物质组分测定及发酵产物检测（1）杨木生物质成分测定
①
原料中的葡萄糖和木糖的可释放总量通过nrel中两步酸解法进行测定，计算公式如下：葡萄糖（g/g）= cg* 0.087 / tg/ m0木糖（g/g）= c
x
* 0.087 / t
x
/ m0式中，cg和c
x
分别为两步酸解后的葡萄糖和木糖浓度（g/l）；0.087为酸解时体积（l）；tg和t
x
分别为葡萄糖和木糖两步酸解的损失率；m0为酸解时称样量。
27.②
原料中的含水量、纤维素、半纤维素、木质素和灰分组分含量参照美国可再生能源实验室（national renewable energy laboratory, nrel）中的方法进行测定和计算，主要计算公式如下：纤维素（%）= 葡萄糖* 0.90 * 100%半纤维素（%）= 木糖* 0.90 * 100%式中，葡萄糖和木糖分别为原料中葡萄糖和木糖总量（g/g）；0.90和0.88分别为纤维素和半纤维素转化为六碳糖和五碳糖的系数；m0：为酸解时称样量。
28.木质素（%）=ail(%) + asl(%)ail（%）= m / m0* 100%;asl（%）= a * 0.087 / 30 / m0* 100%式中，ail和asl分别为：酸不溶木质素和酸溶木质素；m：为酸解后所剩固体烘干后质量（g）；a：为酸解上清液在320 mm处吸光值；30：测量波长320 nm下的吸光系数（l g-1
cm-1
）
③
粗蛋白质含量采用凯氏定氮法测定。在红外智能消化炉中将原料进行充分消化，再利用凯氏定氮仪测定总含氮量，含氮量乘以系数6.25得到粗蛋白含量。
29.④
淀粉含量采用boxbio淀粉含量试剂盒测定，其主要原理以特异性的溶剂除去影
响淀粉酶解的物质，然后用特异性溶剂溶出淀粉，最后根据酶解和标准曲线测定淀粉含量。
30.⑤
本发明中的诺维信纤维素酶购自北京高瑞森科技有限公司，纤维素酶添加量为35
±
2 fpu/g干重原料，在50℃，ph 4.8进行酶解。
31.（2）发酵产物检测葡萄糖、木糖、乙酸、甘油和乙醇检测方法概述：检测仪器为高效液相色谱仪（waters，e2695，usa），色谱柱为bio-rad aminex hpx-87h离子排阻色谱柱（300
×
7.8 mm, bio-rad, hercules, ca, usa），流动相是浓度为5 mm的稀硫酸溶液（经过0.22
µ
m微孔滤膜抽滤），流速控制在0.6 ml/min，柱温箱45℃，自动进样器进样，进样量为5
ꢀµ
l（样品经0.22
µ
m微孔滤膜充分去除固形物），检测时间为25 min, 选用示差折光检测器（waters，2414 ri detector，usa）检测各组分信号。根据标准溶液确定各组分保留时间，并根据标准曲线计算待测样品浓度。
32.糠醛、5-hmf等物质使用gl sciences wondasil c18色谱柱(4.6
×
250 mm, 5μm)，紫外检测器（waters，2998 pda detector，usa）检测，流动相为乙腈: 磷酸-磷酸二氢钠缓冲溶液（15∶85 ，ph=2. 6），流速保持1ml /min，检测波长210nm，柱温30℃，进样量20微升。通过标准溶液确定各组分保留时间，并根据配置的标准曲线计算待测样品浓度。
33.实施例3 本发明提供的杨木生物质预处理和酶解条件（1）杨木生物质成分分析将杨木生物质按照实施例2中所述的测定方法进行成分分析，测定结果如表1所示。
34.表1 杨木生物质的成分分析
35.（2）杨木生物质预处理条件优化根据杨木生物质木质素含量高的特性，选择“木素先行”的策略。在10%底物浓度、4.8% (w/v) 亚氯酸钠浓度、水浴温度70℃、保留时间3h的预处理条件下，经过亚氯酸钠预处理后固形物回收率为83.31%，原料组成成分变化明显，通过对纤维素、半纤维素和木质素三大组分进行分析发现，经过亚氯酸钠预处理后原料木质素含量显著降低，较原料木质素含量降低了68.90%，且纤维素与半纤维素的损失量分别为2.69%和4.72%。亚氯酸钠预处理具有高效的木糖脱除能力，并且对糖组分的脱除较少，因此后续确定亚氯酸预处理为杨木
生物质的第一步预处理。
36.表2 脱木质素杨木生物质成分分析
37.取脱木质素预处理后的原料进行稀酸预处理，在底物浓度为10%，预处理温度为121℃，保留时间120 min的条件下，对h2so4浓度进行单因素优化实验，设置h2so4浓度梯度为0.2%、0.4%、0.6%（w/v）。随着硫酸浓度从0.2%上升到0.6%，原料的糖释放率呈上升趋（图1 a）。通过检测酸解液中葡萄糖和木糖浓度，以及酶解效率验证其解聚效果。通过添加35
±
2 fpu/g的诺维信纤维素酶（cellicctec 3）进行酶解测试，0.4%酸浓度的预处理条件就可达到较理想的糖化率（图1 b）。
38.表3 不同h2so4浓度下的原料预处理液糖化分析
39.（3）杨木生物质酶解条件优化经过稀酸预处理后体系呈强酸性，而纤维素酶水解的最适ph为4.8-5.0，因此需对预处理液的ph进行调节，在加碱的过程中还会起到部分脱毒作用。在调解ph时分别选择氢氧化钠、氧化钙、氢氧化钙和氨水四种试剂进行ph的调节，用以选择更有利于糖分释放和减少抑制物的调节试剂。综合表4不同中和方式对水解液中乙酸、糠醛、5-hmf和总酚的浓度及成本问题，选定cao作为原料预处理液ph调节的试剂用于下一步酶解过程。用cao调节ph结合诺维信cellicctec 3纤维素酶的酶解，原料的糖释放最高，此时葡萄糖和木糖的总释放率可达理论释放值的92.47%，处于较高水平，后续以此作为酶解条件进行水解液的制备。
40.表4 不同中和方式对抑制物的脱除效果
41.（4）杨木生物质酶解条件优化通过响应面法对酸浓度、加酶量和酶解时长进行优化，在相同酶解时长条件下，酸浓度与加酶量的增加对糖化率均有显著的提升（图2 a），在相同加酶量条件下，酸浓度与酶
解时长的增加也对糖化率有显著的提升（图2 b），而在相同酸浓度的条件下，加酶量和酶解时长的增加，也一定程度上提高了糖化率（图2 c）。最终综合酸浓度、加酶量和酶解时长，得到在0.36%酸浓度、加酶量11.49 fpu/g和酶解时长48 h的条件，糖化率可达理论值的87.31%。水解液中葡萄糖和木糖的预测浓度能够达到50.16 g/l和20.77 g/l，同时还有4.56 g/l的乙酸，0.189 g/l的糠醛和0.323 g/l的5-hmf。经过验证发现，在预测的最优条件下，糖化率为理论值的87.17%，水解液中葡萄糖和木糖的浓度分别为49.72 g/l和20.37 g/l。
42.实施例4 本发明提供的杨木生物质水解液发酵性能测试（1）水解液的制备及发酵条件水解液的制备条件如实施例3中所述相同。发酵条件采用实例1中的摇瓶发酵条件和发酵罐发酵条件。
43.（2）杨木生物质水解液的发酵性能测试及ph优化在未经脱毒处理的杨木纤维水解液发酵过程中，菌株6m-15在36 h内可快速消耗完全部的葡萄糖，但发酵后期木糖利用速率缓慢（图3 a）。抑制物可以降低细胞代谢过程中的关键酶活性、破坏核酸稳态以及影响细胞膜的结构稳定等，从而影响细胞的正常生长代谢。根据对杨木纤维水解液的分析，水解液的主要抑制物中乙酸含量最高，达到了4.038 g/l。乙酸能抑制酵母菌种的生长及发酵活性，尤其在发酵后期，当乙酸浓度及其它毒性化合物如乙醇浓度较高时，发酵更容易出现停滞现象。因此可以通过调节发酵液的ph，减弱乙酸的抑制作用。随着ph的增高，木糖利用速率显著提高，在ph为4.5至5.5段，ph与木糖利用速率呈正相关，随着发酵液ph的升高，木塘利用率随之增加。同时，当发酵液ph高于乙酸解离常数，发酵结束时乙醇浓度提升了约6%。当发酵液初始ph为4.5时，发酵48 h后木糖剩余约7 g/l，糖醇转化率仅为84.25%（图3 b）。而当发酵液初始ph为5.5时，发酵48 h后木糖利用完全，糖醇转化率达到理论值90.44%（图3 d）。通过对比，当发酵液初始ph为5.0时具有最高的乙醇浓度35.13 g/l，木糖剩余1.20 g/l，木糖利用率达到95%，糖醇转化率达到理论值的90.61%（图3 c）。综上所处，选择发酵液初始ph为5.0能够有效提高木糖利用率，发酵液获得更高的乙醇浓度。
44.表5 不同ph对杨木生物质水解液的发酵性能测试
45.（3）杨木生物质水解液的发酵放大实验根据已有的预处理条件以及水解糖化条件，对初始ph为5.0的水解液进行放大实验。为了评估杨木生物质水解液发酵产乙醇的工业应用潜力，进行了5 l及50 l发酵规模的放大测试。在5 l的发酵罐中，18 h即可消耗完约55 g/l的葡萄糖，发酵48 h时木糖基本利用完全，葡萄糖和木糖转化乙醇的糖醇转化率为0.4730 g/g，达到理论值的92.75%，乙醇浓度也达到37.492 g/l（图4 a）。采用相同的发酵条件对杨木生物质水解液进行了50 l规模
的发酵性能测试，结果显示发酵体积的进一步放大并没有影响菌株的发酵性能，菌株的糖醇转化率为0.4780 g/g，达到了理论值的93.73%（图4 b）。

技术特征：
1.一种生物转化杨木生物质生产燃料乙醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）杨木生物质水解液的制备，采用亚氯酸盐-稀硫酸两步法预处理，调节ph，纤维素酶酶解，离心取上清液，补充蛋白胨、酵母粉，即得；（2）生物转化，采用发酵酿酒酵母6m-15与步骤（1）的杨木生物质水解液进行发酵；所述的发酵酿酒酵母6m-15菌株于2020年08月17日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为cgmcc no.20436。2.根据权利要求1所述的生物转化杨木生物质生产燃料乙醇的方法，其特征在于，步骤（1）亚氯酸盐预处理条件为10%杨木生物质干重、4-5%亚氯酸盐；稀硫酸预处理条件为10%杨木生物质干重、0.1-0.4%（w/v）h2so4、121
±
2℃、120
±
5 min；纤维素酶酶解条件为：调节ph至4.8-5.0，添加35
±
2 fpu/g干重的诺维信纤维素酶进行酶解。3.根据权利要求2所述的生物转化杨木生物质生产燃料乙醇的方法，其特征在于，纤维素酶酶解过程中使用cao调节ph。4.根据权利要求1所述的生物转化杨木生物质生产燃料乙醇的方法，其特征在于，步骤（2）的具体过程为：对步骤（1）获得的水解液进行离心，保留上清液，补加蛋白胨、酵母粉配制成发酵液，调节ph至5.0
±
0.2，并按照od600 3.5
±
0.2接种发酵菌株6m-15，发酵。5.根据权利要求1所述的生物转化杨木生物质生产燃料乙醇的方法，其特征在于，还包括将水解液发酵规模放大，生产高浓度乙醇。6.根据权利要求1所述的生物转化杨木生物质生产燃料乙醇的方法，其特征在于，步骤（2）发酵的控制条件为30
±
2℃，200 rpm，初始ph为5.0
±
0.2，发酵前6 h通气为度1
±
0.1 vvm，其余时间关闭通气；发酵时发酵罐填充体积为总体积的70%；在发酵初始添加消泡剂，后续视发酵情况进行添加。7.根据权利要求6所述的生物转化杨木生物质生产燃料乙醇的方法，其特征在于，所述的消泡剂为：格雷特生物发酵消泡剂gpe。8.根据权利要求1-7任一所述的生物转化杨木生物质生产燃料乙醇的方法，所述的杨木生物质为杨木锯末。

技术总结
本发明涉及一种生物转化杨木生物质生产燃料乙醇的方法，尤其涉及一种高糖化率和高糖醇转化率的燃料乙醇工艺，属于燃料乙醇生产的技术领域。采用亚氯酸钠预处理后，杨木生物质的原料组成成分占比发生明显变化，木质素含量降低。随后采用低酸浓度的解聚技术和酶解技术使水解液具有较高的糖浓度，并保持较低的抑制物水平。并优化发酵参数，大幅度的提升了发酵效率；采用发酵酿酒酵母6M-15与杨木生物质水解液进行发酵生产燃料乙醇，工艺简单，适合工业化放大生产。业化放大生产。业化放大生产。


技术研发人员：赵建志 鲍晓明 徐发迪 孙东明 李洪兴 李在禄
受保护的技术使用者：齐鲁工业大学（山东省科学院）
技术研发日：2023.06.25
技术公布日：2023/8/9